5. MEDIOS-CULTIVO-FITOHORMONAS-asignatura de agronomia.pptx

describe los distintos efectos de las fitohormonas en el uso agropecuario y de manejo biotecnológico

1. Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas

2. Laboratorio Area de preparación de medios. Area de lavado y esterilización. Cuarto estéril. Cámara de cultivo. Area de rusticación. Material vegetal Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento). Explantes (elección, disección, esterilización, etc.). Condiciones de cultivo Asepsia. Recipientes. Temperatura. Luz y fotoperíodo. La m i c r o p r op a g a c i ó n vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo

3. Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO 3 - , PO 4 3- , K + , Ca 2+ , Mg 2+ , SO 2- 4 Micronutrientes: Fe 2+ , Cu 2+ , Zn + , Mn 2+ , Mo 2+ , Co 2+ , I - Carbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Aminoácidos Glicina Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas G i be r e li nas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite ® pH 5,6 – 5,8 Esterilización 1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave Medios de cultivo: composición general

4. Soluciones concentradas de macroelementos (100x) Soluciones concentradas de microelementos (100x) Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) Mioinositol (100 mg/L) Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L. Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L Fo r m u l a c i ó n básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales

5. Inducción de embriogénesis*. Cultivo de protoplastos. Cultivo de suspensiones celulares. C o n s i s t enc i a del medio Semisólido L í q u i do P r op i eda d e s físicas de los medios de cultivo El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías :

6. Intercambio gaseoso: Los recipientes de cultivo se tapan con una película de po l i etiele n o ( parafilm ) p ar a p o si b i l ita r e l i n terca m b io d e gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. - La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno. - La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes. pH: Constituye un factor crítico. Se ajusta en el rango 5,5 – 5,8. Se modifica durante el crecimiento de los cultivos. P r op i eda d e s físicas de los medios de cultivo

7. Composición de medios de cultivo comúnmente usados

8. Composición de medios de cultivo comúnmente usados

9. Reguladores del crecimiento comúnmente usados en los medios de cultivos vegetales

10. Grupos básicos de reguladores del crecimiento: Auxinas Citocininas Giberelinas Acido abscísico - Etileno Generalidades: Actúan a bajas concentraciones Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). - Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta. - Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos. Reguladores del crecimiento

11. Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero químico responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleóptilo de gramíneas. Alargamiento y división celular Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos Formación de raíces adventicias Dominancia apical Acción herbicida Estimulación de la producción de etileno Se sintetizan en las yemas, las hojas jóvenes, los frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg·Kg -1 . Su transporte es polar Auxinas sintéticas: - Acido indol butírico (IBA) Acido naftalen acético (ANA) 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) N OH O Acido indol acético (AIA) (auxina endógena) Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis

12. Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro . Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: Promoción de la división celular Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citocininas) Retardo de la senescencia Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citocininas endógenas: Zeatina (Zea) Isopenteniladenina (2iP) Citocininas sintéticas: Cinetina (Kin) Benziladenina (BAP) Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500  g·Kg -1 . Su transporte es no polar. Citocininas: en combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas

13. Estructura química de las principales citocininas

14. Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi , a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. Algunos efectos mediados por las giberelinas son: Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales Crecimiento de yemas latentes Germinación de semillas en dormancia Floración Movilización de reservas en la semilla. Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión. Su transporte no es polar. Acido giberélico (GA3) Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo

15. Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

16. Iniciación Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo Desinfección superficial de los explantes Establecimiento del cultivo in vitro Multiplicación Multiplicación del material stock Enraizamiento Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro Rusticación Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo Etapas de la mi cr o p r o p aga ci ó n vegetal

17. Posibles vías morfogenéticas: - Organogénesis - Embriogénesis Diferencias entre las dos posibles vías: - La organogénesis es de origen pluricelular . Un grupo o cluster de células del explante inicial se desdiferencía inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas directamente. - La embriogénesis se presupone de origen unicelular . Una célula del explante se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa. Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novo de brotes y/o plantas completas

18. Elección de una planta madre selecta Explantes Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicación Formación de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Pasaje a maceta en un invernadero ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3 ETAPA 4 Etapas implicadas en el protocolo de micropropagación de una especie vegetal

19. Elección del explante inicial

20. Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal: Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos. Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%, entre 5 y 30 min Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl 2 ), entre el 0,01 y 0,05%. Enjuagues con abundante agua estéril (4 ó 5 veces). - En el caso del HgCl 2 , el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar. Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo

21. Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

22. Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis

23. Propagación vegetativa por embriogénesis somática

24. Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por encapsulación en alginato Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales

25. Sistemas de micropropagación vegetal

26. Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de yemas axilares o apicales Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

27. Proliferación de yemas apicales o axilares - Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemos. La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula con base en el número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explante inicial, entre una resiembra y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables. Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año, a partir de una única yema inicial. - El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta técnica. Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

28. Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de tejidos desdiferenciados

29. Consideraciones generales: - Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explante cultivado in vitro (disco de hoja, meristemo, células en suspensión, etc.) - Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala. Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales d es dif e r e n c i a d o s in vitro

30. Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta

31. Sistemas de pr op a gac i ó n vegetativa in vitro

32. Sistemas de micropropagación vegetal Cultivo de meristemos

33. Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservación y conservación de germoplasma. Los meristemos son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos

34. Meristemos apicales Están localizados en la porción terminal o distal del vástago y de la raíz. Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos pimarios del tallo y la raíz. Son organogénicos. Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces. Meristemos secundarios Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales. Dan lugar a los tejidos de conducción. Meristemos florales Derivan de la transformación de meristemos apicales. Se limitan a la producción de órganos florales. Meristemos intercalares En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros. Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces En el cuerpo de una planta se reconocen diferentes tipos de meristemas

35. Cultivo de meristemas El empleo de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas

36. - El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción). El número de partículas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934). La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus. - Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y Dahlia . El cultivo de meristemos facilita la eliminación de patógenos

37. Equipamiento Elementos generales para cultivo in vitro . Lupa estereoscópica. Instrumental de disección. Etapas del cultivo Elección del explante: escencialmente meristemos apicales de vástago. Domo meristemático desnudo o acompañado por 2 ó 3 pares de primordios foliares. Tamaño aproximado 0,5 mm. Esterilización de la yema o porción apical del vástago conteniendo al meristemo propiamente dicho. Disección del meristemo bajo lupa. Eliminación de las primeras hojas. Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido. - Regeneración de yemas axilares. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtención de plantas completas. - Propagación del material (a partir de estacas uninodales, etc.) - Rusticación. Aspectos técnicos del cultivo de meristemas

38. La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtención de plantas sanas dependerá del tamaño del explante. Existe una situación de compromiso entre el tamaño mínimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro . - Papa ( Solanum tuberosum ) / Potato virus Y o V : Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no más de 2 pares de primordios foliares. Consideraciones prácticas sobre el cultivo de meristemos Ejemplos prácticos: Frutilla ( Fragaria sp) / ¿patógeno?: Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas. Papa ( Solanum tuberosum ) / Potato virus X : Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios el % de plantas sanas es menor .

39. Propagación vegetativa rápida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin Mayor control sobre la sanidad del material propagado Introducción rápida de nuevos cultivares Conservación de germoplasma Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal Alcances de la mi c r op r o p aga ci ó n vegetal Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales