BIOLOGIE CLINIQUE.pptx cours de la faculté de médecine ULPGL

BIOLOGIE CLINIQUE 2022-2023 Prof TONEN Pr Dr Serge TONEN WOLYEC, MD, PhD Université Libre des Pays des Grands Lacs

Définition : La biologie clinique (Belgique, Pays-Bas, Autriche, Luxembourg) appelée aussi Biologie médicale (France, Afrique du Nord et de l’Ouest) est une spécialité médicale qui consiste en l’exécution d’analyse sur les liquides biologiques (ou extraits /broyats de tissus) et en l’interprétation des résultats dans le but de caractériser l’origine physiopathologique d’une maladie. INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Pourquoi la biologie clinique pour les étudiants en médecine ? Il assure la responsabilité des actes qu’il entreprend entant que responsable de l’hôpital ou de centre de santé ou même des laboratoires des références. C’est le médecin qui prescrit les examens de laboratoire. Il doit connaître les techniques et interpréter correctement les résultats INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Cheminement de l’analyse LE PATIENT Sélection des tests Prélèvement Transport du spécimen Analyses de laboratoire Phase analytique Création d’un rapport Transmission du rapport Phase pré analytique Interprétation des résultats Phase post analytique INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Les tests de laboratoire sont influencés par L’environnement du laboratoire Du personnel formé Du personnel compétent Les réactifs et l’équipement Le contrôle qualité Les communications La gestion des processus La gestion des erreurs L’enregistrement des données INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Personnel Ressources humaines Qualifications pour le travail Descriptif de poste Orientation Formation Vérification des compétences Développement professionnel Formation continue INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Équipement acquisition installation validation maintenance calibration dépannage maintenance et réparation enregistrement INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Achats et inventaires Qualifications du vendeur Fournitures et réactifs Services d’urgence Contrats et points clefs Gestion des stocks INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Contrôle des processus Contrôle qualité Gestion des échantillons Validation de méthodes Vérification de méthodes INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

Gestion de l’information Confidentialité Requêtes Registres et cahiers SIGL: système informatisé de gestion de l’information INTRODUCTION 2022-2023 Prof TONEN

A la fin du cours l’étudiant sera capable de : Réaliser les examens courants de laboratoire biomédical Noter et interpréter correctement les résultats par rapport aux valeurs usuelles Préparer correctement les réactifs de base Expédier correctement les échantillons vers un autre laboratoire plus équipé pour la détermination des parasites et germes ainsi que les autres analyses biochimiques, sérologiques, culture et antibiogramme, et voir moléculaires. OBJECTIFS EDUCATIONNELS 2022-2023 Prof TONEN

CHAPITRE 1 : ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN Local pourvu des installations et des appareils nécessaires à des manipulations et des expériences effectuées dans le cadre de: recherches scientifiques , d’ analyses médicales ou de matériaux de l’ enseignement

La mise en place d’un laboratoire, la répartition de locaux et des taches, l’équipement les conditions même du travail varient suivant la destination du service auquel il est attaché. ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN Analyse médicale

Quelque soit la destination de laboratoire, certaines règles générales doivent être respectées quant à son installation. Elles concernent la surface prévue en tenant compte de : La place occupée par les appareils ; La nature du travail envisagé et en conséquence de personnes ; Les services administratifs et des pièces de servitude ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN

Elles sont caractérisées par : Leur dimension La nature de leur revêtement Leur installation et leur équipement Minimum recquis 75cm profondeur , 130cm de largeur et la hauteur de 75-80cm Tables de travail ou Paillasses ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN

Postes de travail placés dans des boxes ou des cabines à usage individuel ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN

Equipement Les paillasses doivent être pourvus au minimum : - d’une arrivée de gaz par poste de travail - d’une alimentation et évacuation d’eau - de plusieurs prises de courant électrique - de Bec Bunsen ou lampe à alcool, un bain-marie - du matériel nécessaire aux manipulations stériles - matériels nécessaires pour la coloration - des portoirs pour tubes à essai - des récipients destinés à recueillir les matériels usagés ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN

Principaux appareils Appareils destinés à la production de la chaleur : - le bain-marie, - Les étuves : four Pasteur ou stérilisateur à l’air chaud, le poupinel , étuve bactériologique - les autoclaves - le Bec Bunsen, la plaque chauffante, ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN

Appareils producteurs de froid Réfrigérateurs pour des temperatures positives Congélateurs pour des temperatures negatives Glacières portatives Lyophilisateur Principaux appareils ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN

Autres matériels Appareils producteurs de vide Agitateurs Broyeurs Centrifugeurs Balances Verrerie Boîte de Pétri, tube à essai, tube à hémolyse, erlen meyers , bécher, verre à pieds, pipettes, entonnoirs (voir T.P.) Principaux appareils ORGANISATION D’UN LABORATOIRE 2022-2023 Prof TONEN

STÉRILISATION PAR LES MÉTHODES PHYSIQUES STÉRILISATION PAR LA CHALEUR 1 - LE FLAMBAGE 2 - LE FOUR PASTEUR Le poupinel " ou stérilisation à la chaleur sèche 3 - L’AUTOCLAVE En milieu saturé d'humidité et sous pression, la stérilisation s'opère à des températures inférieures à celles qui sont nécessaires en milieu sec. 4 - AUTRES MÉTHODES Certains milieux de culture fragiles (comme les milieux au désoxycholate ) ne supportant pas les températures élevées, on procède à une ébullition à 100°C. PASTEURISATION TYNDALLISATION 2022-2023 Prof TONEN

STÉRILISATION PAR FILTRATION Cette méthode est utilisée pour les milieux sensibles à la chaleur, mais n'est possible que lorsque la viscosité de ces milieux est faible. On utilise alors, suivant le cas, les bougies de porcelaine (type Chamberland), les filtres de verre poreux (le verre fritté N°5 arrête de nombreuses bactéries) ou les membranes filtrantes à usage unique, de type Millipore ou Sertorius. 2022-2023 Prof TONEN

C - STÉRILISATION PAR LES RADIATIONS La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la décontamination de l'air et des paillasses situées sous la hotte de protection : le rayonnement n'agit que de façon directe et sa pénétration est faible. Des instruments ou des récipients tels que les boîtes de Pétri peuvent être stérilisées de la sorte. Le rayonnement bêta Le rayonnement gamma Rayons X 2022-2023 Prof TONEN

STÉRILISATION PAR DES AGENTS CHIMIQUES Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles et plans de travail et pour la destruction des germes portés par des instruments souillés. Ce mode de stérilisation doit être systématiquement pratiqué, dans nos laboratoires, pour les lames et pour la verrerie qui ne passe pas en autoclave. 1) LES ANTISEPTIQUES LIQUIDES L'alcool éthylique à 70% L'hypochlorite de sodium (eau de Javel) Les savons et détergents 2) LES ANTISEPTIQUES GAZEUX Les vapeurs d'une solution chauffée de formol 2022-2023 Prof TONEN

CHAPITRE II. SECURITE DANS LE LABORATOIRE Biosécurité necessite : Cadre réglementaire et principes directeurs pour la mise en application de la sécurité biologique dans les laboratoires biomédicaux et de recherche 2022-2023 Prof TONEN But de la biosécurité : Protection du personnel Limitation des risques de libération accidentelle d’agents pathogènes DEFINITIONS ET GENERALITES Ensemble des principes, des technologies et des pratiques liés au confinement mis en œuvre pour prévenir l’exposition involontaire à des matières infectieuses et à des toxines, ou leur liberation accidentelle .

2022-2023 Prof TONEN Biosûreté : Ensemble des mesures visant à prévenir la perte, le vol, le mésusage, le détournement ou la libération intentionnelle d’agents pathogènes, de toxines ou d’autres biens liés à l’installation (p. ex. le personnel, l’équipement, les matières non infectieuses, les animaux). But de la biosûreté : Réduction des risques de perte , de vol, ou d’utilisation à mauvais escient d’agents pathogènes DEFINITIONS ET GENERALITES

2022-2023 Prof TONEN Pourquoi la biosécurité/ biosûreté au niveau des laboratoires est-elle essentielle ? Pour limiter les risques de libération depuis le laboratoire Prévenir la diffusion de pathogènes risquant de causer des épidémies / des épizooties Pour limiter les risques au sein du laboratoire Protection du personnel ( 60% des pathogènes humains sont zoonotiques / 75% des maladies émergentes sont zoonotiques ) Prévenir les risques de contaminations croisées et ainsi des erreurs au niveau du diagnostic (par des pathogènes venant de l’extérieur ou présent dans le laboratoire )

2022-2023 Prof TONEN Symboles internationaux ayant une signification précise risques, sécurité, danger, orientation, recommandation Pictogrammes Danger biologique

2022-2023 Prof TONEN Cadre réglementaire

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Identifier les dangers potentiels associés aux activités menées ainsi qu’aux matières infectieuses ou toxines utilisées Déterminer les risques en cas d’exposition Élaborer des stratégies d’atténuation et de gestion des risques pour éviter l’exposition du personnel ou le relâchement dans l’environnement Tâche effectuée par un groupe multidisciplinaire (direction assistée de professionnels avec expertises et responsabilités variées) 2022-2023 Prof TONEN Evaluation du risque

Atténuation / gestion du risque Mécanismes de contrôle visant à réduire les risques pour les employés: L’élimination ( comprenant la substitution) Les mesures d’ingénierie : utilisation de dispositifs de confinement Les mesures de contrôle administratives : politiques et POS (procédure opérationnelle standardisée) déterminant comment les tâches sont réalisées. L’EPP (Equipement de protection personnelle): pour réduire ou minimiser le risque possible d’exposition. 2022-2023 Prof TONEN

Groupes de risque (GR) Permet de classer les microorganismes en fonction de leurs caractéristiques inhérentes (virulence, pathogénicité, existence d’un traitement). La classification par GR permet de catégoriser les agent pathogènes humains en fonction du risque qu'ils présentent pour la santé du personnel, du public et des populations animales Utilisé pour évaluer les risques relatifs à la sécurité biologique au laboratoire 2022-2023 Prof TONEN

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Niveau de confinement MANIPULER SÉCURITAIREMENT LES AGENTS PATHOGÈNES ET TOXINES Confinement ‘‘Ensemble de paramètres de conception physique et de pratiques opérationnelles visant à protéger le personnel, le milieu de travail immédiat et la communauté contre toute exposition à des matières biologiques’’ ‘‘Indice composite déterminé suite à l‘évaluation des risques’’ 2022-2023 Prof TONEN

Niveaux de sécurité biologique (ou de confinement) ‘‘Exigences minimales liées au confinement physique et aux pratiques opérationnelles visant la manipulation sécuritaire de matières infectieuses et de toxines dans les laboratoires’’ 4 niveaux : laboratoire de base –sécurité biologique niveau 1 laboratoire de base –sécurité biologique niveau 2, laboratoire de confinement –sécurité biologique niveau 3 laboratoire de confinement à haute sécurité–sécurité biologique niveau 4. 2022-2023 Prof TONEN

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Réduction du NC lorsqu'une procédure donnée, par exemple l'identification primaire d'un agent, entraîne un risque moindre que celui qu'entraînerait la manipulation d'une culture vivante. Accroissement du NC lorsque l'évaluation locale du risque conclut que les procédures posent un danger plus grand que la routine à l'échelle laboratoire (ex: production à grande échelle, inoculation d’animaux). 2022-2023 Prof TONEN Principe de NC

2022-2023 Prof TONEN Principe de NC

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2022-2023 Prof TONEN Utilisation de poste de sécurité microbiologique

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CHAPITRE III : LES GRANDS PRINCIPES EN BIOLOGIE CLINIQUE 1. PRINCIPE DIAGNOSTIC PAR TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE Les tests de dépistage rapides (TDR) sont définis comme étant des dispositifs médicaux de diagnostic in vitro qualitatif ou semi-quantitatif, utilisés séparément ou pour une série limitée, faisant appel à des procédures non automatisées et conçus pour donner un résultat rapide 2022-2023 Prof TONEN

2022-2023 Prof TONEN un test unitaire, à lecture visuelle subjective, de réalisation simple et conçu pour donner un résultat dans un délai court (moins de 30 minutes généralement). Il peut être réalisé sur sang total, fluide gingival, sérum et plasma en fonction de la (des) matrice(s) revendiquée(s) par le fabricant pour son test. 1. PRINCIPE DIAGNOSTIC PAR TEST DE DIAGNOSTIC RAPIDE

Marché mondial anarchique : > 80 tests, nombreux fabricants , qualité inégale 2022-2023 Prof TONEN

a. Principes généraux des TDR immuno -filtration ou immuno -chromatographie La technique d'immunochromatographie consiste en la migration, sur un support, de nano- ou microparticules mises en contact avec des antigènes et/ou des anticorps. La première méthode développée par Singer et Plotz en 1956 est fondée sur un principe de chromatographie d'affinité de type ligand–récepteur correspondant à la réaction antigène – anticorps ( i.e. immunochromatographie ). 2022-2023 Prof TONEN

2022-2023 Prof TONEN Les complexes immuns sont immobilisés sur une membrane La migration se fait par capillarité sur la membrane de nitrocellulose Les nanoparticules de l’or colloidal permet la modification de la couleur Ils peuvent être quantitatifs si la coloration de la bande obtenue est comparée à un étalon . Principes généraux des TDR immuno -filtration ou immuno -chromatographie

2022-2023 Prof TONEN Problème de sensibilité

Sample Conjugate Control line Test line Anti-HIV IgG IgG antibodies Colloidal gold conjugated to Protein A HIV antigens Anti-IgG antibodies HIV antigens Rapid HIV tests : Lateral flow devices 2022-2023 Prof TONEN Anti-HIV IgM

b. Technique d’immunofilttration 2022-2023 Prof TONEN INSTI TM HIV-1/HIV-2 Antibody Test  Immunofiltration

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2022-2023 Prof TONEN c. Technique d’immunofluorescence L'immunofluorescence est une technique sérologique basée sur la réaction antigène / anticorps, révélée grâce à un second anticorps spécifique du premier et couplé à un fluorochrome

2022-2023 Prof TONEN Comme avantages, il y a la possibilité de réaliser des marquages multiples sur un même échantillon de cellules, la rapidité et la facilité d'utilisation de cette méthode et aussi une bonne fiabilité de celle-ci. Possibilité de faire des analyses quantitatives. la possibilité de réactions faussement positives ou faussement négatives, l'appréciation subjective du degré de fluorescence et le phénomène de photo-blanchiment. c. Technique d’immunofluorescence

d.Réaction d’agglutination Elle met en évidence la présence des Ag sur un élément figuré (érythrocytes, cellules, particules, bactéries) et un antisérum contenant des Ac spécifiques agglutinants. Les Ac IgM sont très agglutinants, les Ac des autres classes beaucoup moins 2022-2023 Prof TONEN

a) Réaction d’agglutination directe L’Ag est naturellement présent à la surface de la particule ( ABO , ou sérologie Widal ). b) Réaction d’agglutination passive L’agglutination passive consiste à fixer un Ag soluble 2022-2023 Prof TONEN

Les applications sont très nombreuses Treponema pallidum hemagglutination assay (TPHA Facteurs rhumatoïdes La recherche d’Ac présents sur les hématies du malade par le test de Coombs direct La recherche d’Ac anti-GR dans le sérum du malade par le test de Coombs indirect 2022-2023 Prof TONEN

Les anticorps monoclonaux sont aujourd'hui largement utilisés comme réactifs thérapeutiques et diagnostiques dans de nombreuses maladies humaines . 2022-2023 Prof TONEN Préparation des anticorps monoclonaux

2022-2023 Prof TONEN La chimiluminescence est une réaction chimique qui émet de l'énergie sous forme de lumière . Quand elle est utilisée dans la technologie des immunodosages , la lumière émise traduit la quantité d' analyte (substance qui subit une analyse ou est mesurée) présente dans l'échantillon. Méthodes automatisées basées sur la rx Ag/ Ac Chimiluminescence

2022-2023 Prof TONEN Clia Assay chimiluminescence Analyseur

2022-2023 Prof TONEN Autres méthodes EIA (TP) ELISA AUTRES

2. TECHNIQUES DE COLORATION 2022-2023 Prof TONEN Voir cours de microbiologie 3. TECHNIQUES DE CULTURE

3. PRINCIPES DE LA BIOLOGIE MOLÉCULAIRE La cellule héberge deux sortes d'acides nucléiques : les acides désoxyribonucléiques (ADN) et les acides ribonucléiques (ARN). L'ADN est composé de deux brins antiparallèles, le brin sens (5′-3′) et le brin antisens (3′-5′). Chaque brin est constitué de quatre nucléotides dont l'agencement forme une séquence spécifique. Un nucléotide est l'association du désoxyribose 5′ phosphate avec l'une des quatre bases existantes, l'adénine (A), la cytosine (C), la guanine (G) et la thymine (T). Les bases A et T sont complémentaires et se lient d'un brin à l'autre. Il en est de même pour les bases G et C. Les brins se lient à l'aide de liaisons hydrogène dont le nombre est variable selon l'appariement, A avec T par deux liaisons, et G avec C par trois liaisons. Ces deux brins sont enroulés en hélice droite formant la double hélice qui est super enroulée et compactée sur elle-même. 2022-2023 Prof TONEN

L'ARN est, lui, constitué d'un seul brin résultant de l'agencement de quatre nucléotides correspondant à l'association du ribose 5′ phosphate avec l'une des quatre bases suivantes : l'adénine (A), la cytosine (C), la guanine (G) et l'uracile (U). L'uracile remplace la thymine dans les molécules d'ARN. Trois types d'ARN sont retrouvés dans le cytoplasme de la cellule bactérienne, l'ARN de transfert ( ARNt ), l'ARN ribosomal (ARNr) et l'ARN messager (ARNm). Les ARNt , qui sont constitués de 75 à 80 bases, ont une structure grossièrement identique en forme de feuille de trèfle. Ils assurent le transport des acides aminés du cytoplasme vers les ribosomes pour la traduction. Les ARNr sont au nombre de trois, ARN 23S, ARN 16S et ARN 5S, et ils entrent dans la composition des sous-unités ribosomales en association avec les protéines ribosomales. L'ARN 16S rentre dans la composition de la petite sous-unité ribosomale 30S, tandis que les ARN 23S et 5S entrent eux dans la composition de la grande sous-unité 50S. 2022-2023 Prof TONEN

a. EXTRACTION DES ACIDES NUCLÉIQUES L'extraction se déroule en deux phases : • la lyse du tissu collecté qu'il faut adapter à la consistance du tissu et aux bactéries recherchées ; • la purification de l'ADN à partir du mélange de lyse Plusieurs types de lyse peuvent être utilisés seuls ou combinés : • lyse mécanique par broyage à l'aide de billes, de Potter, d'ultrasons ; • lyse thermique au bain-marie en eau bouillante ou au micro-ondes ; • lyse chimique à l'aide de sodium- dodécyl -sulfate (SDS) ou de Chelex ® (agents chélateurs) ; • lyse enzymatique à l'aide de protéinase K, de lysozyme. 2022-2023 Prof TONEN

b. AMPLIFICATION DE L'ADN L'amplification est une technique de biologie moléculaire très utilisée en microbiologie. Elle permet, à partir d'une simple molécule d'acide nucléique (non visible donc non étudiable), d'obtenir des quantités suffisamment importantes de matériel cible afin de pouvoir l'analyser par différentes techniques. Actuellement, la technique de PCR est la plus utilisée pour amplifier de l'ADN 2022-2023 Prof TONEN

2022-2023 Prof TONEN La PCR « Polymerase chain reaction » ou en français Réaction de polymérisation en chaine La paternité de découverte de la PCR a été disputée. Un scientifique norvégien, Kjell Kleppe , a décrit le principe de cette méthode dès 1971. Mais ce n’est qu'avec le travail du scientifique américain Kary Mullis que ce concept devient réalité. La PCR

La PCR repose principalement sur trois éléments : Le chauffage d'un ADN double brin jusqu'à au moins 90 °C permettant de le séparer en deux simples brins (étape de dénaturation) ; Après le chauffage et une séparation de l'ADN double brin en simples brins, un refroidissement progressif permettant une hybridation entre des séquences complémentaires (étape d'hybridation des amorces) ; La propriété de recopiage d'un brin cible à partir d'une amorce complémentaire hybridée sur le brin grâce à des ADN polymérases, enzymes thermostables (étape d'élongation) . 2022-2023 Prof TONEN Principes de la PCR

2022-2023 Prof TONEN 4 éléments sont nécessaires: Amorces, dNTPs , ADN, ADNpol Les deux amorces sont de petits brins d’ADN d'environ 20 bases, (appelés oligonucléotides capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier.

2022-2023 Prof TONEN Segment d'ADN qui sera amplifié La séquence cible représente le segment d'ADN qui sera amplifié (recopié de nombreuses fois)

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2022-2023 Prof TONEN Le nombre de brins obtenus à la fin du premier cycle est le double du nombre de brins initialement présents. REMARQUE : la polymérisation ne s'arrête pas lorsque la copie est de la longueur souhaitée. La copie de l’ADN initial génère donc des copies plus longues que souhaité.

Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes ; seule la température d'hybridation (Tm) pourra être modifiée pour chaque nouvelle PCR en fonction de la composition en nucléotides des amorces. Pour calculer le Tm d'une amorce inférieure à 30 nucléotides, on peut utiliser la formule suivante : 2022-2023 Prof TONEN

Il faut compter 20 à 40 cycles pour synthétiser une quantité analysable d'ADN (environ 0,1 mg). Le facteur d'amplification devrait donc être 2 n , où n représente le nombre de cycles. En pratique, le rendement de la réaction est plutôt de l'ordre de 85 %. Parmi les raisons pour lesquelles la réaction atteint un plateau, on peut citer notamment : la dimérisation des amorces, l'apparition de sous-produits de réaction ayant un pouvoir inhibiteur (pyrophosphates), l'épuisement et la dénaturation des composants de la réaction, la compétition entre les amorces, les fragments d'ADN amplifié qui peuvent s'hybrider entre eux ou avec la cible plutôt qu'avec les amorces, et ce d'autant plus que leurs concentrations varient en sens inverse au cours de la réaction. 2022-2023 Prof TONEN

LES DIFFÉRENTS TYPES DE PCR 1. PCR en point final En PCR conventionnelle, la technique est dite en « point final » car ce n'est qu'une fois la réaction de PCR terminée que la détection du produit amplifié est effectuée. 2. PCR en temps réel Cette méthode consiste en la détection et la quantification d'un reporter fluorescent dont l'émission est directement proportionnelle à la quantité d' amplicons générés pendant la réaction. Afin de recueillir des données quantitatives avec précision, chaque échantillon doit être analysé dans sa phase exponentielle d'amplification qui est la phase la plus reproductible de la réaction. La PCR en temps réel permet donc le suivi, cycle par cycle, de la production des amplicons , à l'opposé de la PCR conventionnelle où les amplicons ne sont détectés que dans la phase finale du processus d'amplification. 2022-2023 Prof TONEN

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2022-2023 Prof TONEN CHAPITRE IV : LES EXPLORATIONS HEMATOLOGIQUES 1. SANG 1. Caractéristiques physiques Liquide visqueux et opaque Sang oxygéné = écarlate Sang pauvre en O 2 = rouge sombre Dense et plus visqueux que l’eau pH 7,35 et 7,45 Constitue environ 8% du poids Température = 38°C 5 à 6 L chez l’homme 4 à 5 litre chez la femme Plaquettes Érythrocytes Monocyte Lymphocyte Granulocytes neutrophiles

Généralités 1. SANG Par centrifugation du sang, on obtient 3 couches : Hématocrite: % en volume occupé par les érythrocytes = (volume des GR) / (volume total) x 100 Plasma (55%) Couche leucocytaire leucocytes+ plaquettes (< 1%) Érythrocytes (45%) Éléments figurés 3. Principaux composants du sang total: hématocrite Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 95

Plasma 90 % d’eau 10 % solutés Protéines ( Albumine, Globulines ) Hormones Nutriments Glucose, Acides aminés, etc… Vitamines et électrolytes Déchets Urée. lactate Gaz respiratoires O 2 et C O 2 Généralités 1. SANG Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 96

Éléments figurés Erythrocytes Leucocytes thrombocytes Généralités 1. SANG Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 97

Érythrocytes Disques biconcaves (7-8  m de diamètre) Très flexibles  peuvent se déformer et s’étirer dans les petits capillaires sanguins grâce à la spectrine . Anucléés  ne peuvent pas se reproduire, ni synthétiser des protéines. Sans mitochondries  génèrent l’ATP de façon anaérobique Essentiellement des “sacs” d’ hémoglobine (plus de 97% de leur poids sec est de l’hémoglobine) Généralités 1. SANG Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 98

Hème : Structure en anneau avec un ion Fe 2+ en son centre. Chaque Fe 2+ peut se lier réversiblemen t à une molécule d’O 2  4 O 2 par hémoglobine. Les molécules de CO 2 peuvent aussi se lier réversiblement à l’hémoglobine, mais ils se lient aux acides aminés de la globine plutôt qu’aux hèmes. Hémoglobine Constituées de la protéine globine liée à 4 groupements hèmes . Globine : Constituée de 4 chaînes polypeptidiques: 2 alpha (  ) et 2 bêta (  ). Chacune des chaînes est liée à un groupement hème. Généralités 1. SANG Oxyhémoglobine ( Hb-4O 2 ): Hémoglobine liée à l’O 2 Désoxyhémoglobine ( Hb ): Hémoglobine sans O 2 Carbhémoglobine (Hb-CO 2 ): Hémoglobine liée au CO 2 Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 99

Hématopoïèse L ’hématopoïèse est caractérisée par un ensemble de mécanismes qui conduisent à la formation continue des cellules sanguines, elle regroupe : - La myélopoïèse qui assure : l’érythropoïèse pour les érythrocytes la granulopoïèse (polynucléaires et monocytes). la mégacaryopoïèse pour les plaquettes. - Lymphopoïèse : qui aboutit à la production de lymphocytes. Phase 1 Synthèse des ribosomes Phase 2 Accumulation d’hémoglobine Phase 3 Éjection du noyau Cellule souche Précurseur des érythrocytes Différenciation cellulaire Hémocytoblaste Proérythtroblaste Érythtroblastes Réticulocyte Érythro-cyte E rythro - poïèse 1. SANG Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 100

Le nombre de G.R. dans le sang demeure constant :  équilibre entre leur production et leur destruction. > Si quantité insuffisante de G.R. : hypoxémie (manque d’O 2 ); > Si trop de G.R: le sang devient très visqueux  mauvaise circulation. Régulation de l’érythropoïèse Concentration sanguine normale d’O 2 Déséquilibre Déséquilibre Stimulus: Hypoxémie (diminution de la concentration sanguine d’O 2 ) Libération de l’hormone érythropoïétine par les reins (principalement) Diminution de la concentration sanguine d’O 2 Stimulation de la moelle osseuse rouge par l’érythropoïétine Augmentation de la concentration sanguine d’O 2 Augmentation de l’érythropoïèse  Augmentation du nombre d’érythrocytes Le contrôle de l’érythropoïèse se fait par l’entremise d’une hormone: l’ érythropoïétine ( EPO ) .  Hypoxémie  reins  EPO   érythropoïèse dans la moelle osseuse rouge   hématocrite. 1. SANG Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 101

Durée de vie des G.R.:  120 jours. Limitée parce que les G.R. ne peuvent pas synthétiser de nouvelles protéines. Les vieux érythrocytes non fonctionnels sont reconnus et détruits par les macrophagocytes présents dans: Rate Foie Moelle osseuse rouge Cycle de vie des érythrocytes Besoins nutritionnels pour l’érythropoïèse: Les érythrocytes sont parmi les cellules ayant le plus haut taux de production. Matériaux nécessaires à leur production comprennent: Acides aminés, lipides, glucides Fer Vitamines, en particulier B 12 et acide folique (folate)  requis pour la synthèse d’ADN et donc pour la multiplication cellulaire Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 102

4.1. HEMOGRAMME NORMAL Siège de l’hématopoïèse L’hématopoïèse fœtale : lors de la vie intra utérine s’effectue au niveau du tissu conjonctif embryonnaire( ilots de WOLF et PANDER) entre le 19ème j et la fin de la 8ème semaine L’hématopoïèse médullaire : à partir de 4ème mois de la vie intra utérine et sera le site exclusif à la naissance et pour toute la vie; dans tous les os jusqu’à l'âge de 4 ans puis uniquement les os courts et plats ; sternum, cotes, vertèbres, bassin. L’hématopoïèse hépatosplénique : entre le 2ème-6ème mois de la vie intra utérine Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 103

Définition L’hémogramme est l’ensemble des mesures quantitatives et qualitatives des éliment figurés du sang (globules rouges, globules blanc et les plaquettes) Il est souvent demandé dans les cas pathologiques comme : un syndrome anémique , un syndrome hémorragique , un syndrome infectieux , une altération de l’état général etc. Il est également demandé dans le cadre d’un bilan systématique ou pour surveiller un traitement médicamenteux … Prélèvement : sang veineux sur EDTA (ou si thrombopénie induite par EDTA, prélèvement sur citrate de Na), éventuellement sang capillaire Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 104

Indications de l’hémogramme C’est un examen d’orientation devant : un syndrome anémique un syndrome hémorragique ; un syndrome infectieux aigu ou chronique ; des symptômes évoquant une polyglobulie : érythrose , signes neurosensoriels, thrombose ; la présence d’ adénopathie ou d’une splénomégalie ; un ictère etc. Il doit être pratiqué en urgence devant : un état de choc, une pâleur intense, une angine ulcéro-nécrotique une fièvre élevée après prise de médicament , surtout après chimiothérapie , une fièvre résistante aux antibiotiques, un purpura pétéchial Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 105

1- études quantitative : Elle consiste à mesurer le taux des globules rouges , des globules blanc , des plaquettes , le taux d’ hémoglobine , d’ hématocrite et de calculer les constants hématométriques (VGM, CCMH, TGMH). Peuvent être soit : Manuelles (classique) : Ces techniques sont longue fastidieuse avec des marges d’erreurs non négligeable. Des méthodes automatisées : qui ont l’ avantage d’ être rapides et plus précises Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 106

Prélèvements Sang prélevé par ponction veineuse et recueilli dans un tube contenant un anticoagulant, plus rarement par prélèvement capillaire. Il n’est pas nécessaire d’ être à jeun pour cet examen Le tube doit être agiter pour éviter la formation de micro caillots Le tube doit être acheminer rapidement au laboratoire dans un délai moins de 2heures pour analyse. Si le malade est perfusé, on prélève le membre opposé. Lorsque le prélèvement est fait sur un cathéter , celui-ci doit être suffisamment purgé. Chez le nourrisson et le nouveau-ne ́, on peut réaliser un prélèvement capillaire de quelques millilitres au niveau du versant externe de l’annulaire ou au niveau du talon Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 107

Méthodes Méthodes classiques Les méthodes classiques sont manuelles. Elles permettent : La numération globulaire Elle détermine le nombre de leucocytes, d’ hématies et de plaquettes. Elle se fait en cellule hématimétrique avec comptage au microscope optique. Le dosage de l’ hémoglobine Il se fait à l’aide d’un colorimètre . Le résultat est exprimé en g/dl. Le dosage de l’ hématocrite L’ hématocrite ( Ht ) est obtenu par centrifugation du sang dans un tube à microhématocrite . Le résultat est exprimé en pourcentage (%). Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 108

Méthodes automatiques L’automatisation est caractérisée par sa rapidite ́ et sa reproductibilite ́ (30 secondes; 100 examens par heure). Cependant, elle nécessite un contrôle de qualite ́ et les méthodes manuelles restent les méthodes de référence . Elles donnent de nouveaux indices : L’indice de distribution érythrocytaire (RDW) qui rend compte du degre ́ d’ anisocytose normalement compris entre 11,5 et 14,5%. Il est supérieur à 15% dans l’ anémie ferriprive. Le volume plaquettaire moyen (VMP) qui oriente vers l’origine centrale (augmenté) ou périphérique (diminué) d’une thrombopénie . Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 109

L’ interprétation se fait selon le sexe , l’ âge (taux d’ Hb différent chez l’homme, la femme, l’enfant) et les caractéristiques ethniques . Il tient compte des renseignements cliniques. Dans l’ interprétation il faut tenir compte : des chiffres absolus et non des pourcentages des granuleux, des lymphocytes, monocytes et réticulocytes ; du contexte clinique. Interprétation de l’hémogramme Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 110

En cas d’anomalies, un frottis sanguin s’impose. Il faut par ailleurs, éliminer les artéfacts tels que : les fausses cytopénies , souvent la thrombopénie , due à un caillot ou à un prélèvement dans une perfusion ; la fausse hyperplaquettose en cas de microcytose importante, les GR très microcytaires (<36 μ3) seront comptés comme des plaquettes ; les fausses macrocytoses : en cas d’ autoagglutination donnant des VGM très élevés . Ceci est valable pour les appareils ne travaillant pas à 37° ; la fausse élévation de la CCMH (>36%) en cas de plasma opalescent ; la fausse hyperleucocytose de l’ érythromyélémie : les érythroblastes ( nucléés ) sont comptés comme GB. Il faut penser à les retrancher du nombre des GB. Interprétation de l’hémogramme (suite) Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 111

Interprétation des résultats de l’ hemogramme Il est impératif de connaitre les valeurs normales en fonction de l’ âge et du sexe pour éviter les erreurs d’ interprétation. 1. La lignée rouge : Taux des Globules rouges Homme = 4,5 – 6 M/mm3 Femme = 4 – 5,5 M/mm3 Le nouveau-né 5,1 – 5,8 M/mm3 Hématocrite ( Ht ) : Homme = 40 - 54% Femme = 37 – 47% Hémoglobine ( Hb ) Homme =13 – 17 g/dl Femme = 12 – 16 g/dl le nouveau né 14 – 20 g/dl Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 112

Les constants hématimetriques VGM : V olume G lobulaire M oyen= HT/GR X 10 = (80 – 100) fl si le VGM < 80 : l’anémie est dite microcytaire si le VGM est > 100 fl l’anémie est dite macrocytaire si le VGM est entre 80 et 100 fl l’anémie est dite normocytaire CCMH = la C oncentration C orpusculaire M oyenne en H émoglobine (CCMH), c’est-a-dire la quantité moyenne d’hémoglobine contenue dans un litre d’ hematies . = Hb / Ht X 100 entre 32 – 36% si elle est < 32% l’ anémie est dite hypochrome TCMH : la T eneur C orpusculaire M oyenne en H émoglobine c’est-a-dire la quantité moyenne d’ hémoglobine contenue dans une hématie = Hb /GR X 10 = 27 – 32 pg , si < 27pg : l’anémie est dite hypochrome Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 113

Réticulocytes = hématies de moins de 3 jours en circulation, contenant encore un peu d’ARN taux relatif; 1 -2 % Ils reflètent la production médullaire. permettent de classer les anémies . Ils doivent toujours être calculés en chiffre absolu. Nombre normal = 20 000 - 80 000 /mm 3 Anémie régénérative si > 120 000/ mm 3 Anémie Arégénérative < 120 000/mm 3 Réticulocytes Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 114

2. La lignée blanche : l es leucocytes VN entre 4000 – 10000 elt /mm3 PNN : 1600 - 7000 Lymphocytes : 1000 – 4000 PNE : 40 – 300 PNB: 0 – 100 Monocytes: 200 – 1000 Si les GB sont < 4000 / mm 3 = une leucopénie Si le taux des GB est > 10000 / mm 3 = une hyperleucocytose Si Lymphocytes > 5 000/ mm 3 = Lymphocytose Si Lymphocytes < 1 000/ mm 3 = Lymphopénie Si PNN < 1500 / mm 3 = Neutropénie Si PNN < 500 / mm 3 = Agranulocytose Si PNE > 500 / mm 3 = Hyperéosinophylie Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 115

3. La lignée plaquettaire 150 000 – 400000 elt /mm3 Si le taux des plaquettes est > 400 000 = une thrombocytose Si le taux des plaquettes est < 150 000 = une thrombopénie Autres anomalies: Erythroblastose : passage des érythroblastes dans le sang Bicytopénie : Diminutions de 02 lignées Pancytopénie : Diminutions des 03 lignées (GR, GB, Plaquettes ) Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 116

2- Etude qualitative Le frottis sanguin : # prélever une goutte de sang au niveau du doigt étaler cette goutte sur une lame # Colorer la lame par la coloration MGG # Regardes au microscopie optique à fort grossissement Le FS permet une étude cytologique des éléments figurés du sang GR , GB , PLT Permet de confirmer les données hématimetriques Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 117

les globules rouges : A l’ état normale les globule rouges ont la même taille ( normocytose ) avec une coloration normal ( normochromie ) Réticulocytes . La coloration au bleu de crésyl met en évidence l’acide ribonucléique (ARN) contenu dans les réticulocytes. De fois les structures paerticulieres des reticulocytes n’apparaissent pas à la coloration standard (MGG) Etude qualitative Réticulocytes colorés au bleu de crésyl Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 118

Les globules blancs : le frottis sanguin permet de faire l’ équilibre leucocytaire PNN normal PN Eosinophile PN Basophile Ce sont des cellules de 12 à 14 µm de diamètre caractérisées par un noyau bilobé et surtout par l’aspect des granulations qui sont sphériques (0,5 à 1,5 µm de diamètre), réfringentes, de coloration orangée Ce sont des cellules de 10 à 14 µm de diamètre. Leur noyau bilobé est masqué par des granulations spécifiques qui sont assez nombreuses et dispersées sur toute la cellule. Elles sont arrondies (0,2 à 1 µm de diamètre) ou plus souvent angulaires, de coloration pourpre Des cellules arrondies de 12 à 14 µm de diamètre, caractérisées par la forme plurilobée de leur noyau (3 à 5 lobes). Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 119

Ce sont de grandes cellules de taille variable (20 à 40 µm de diamètre). Leur noyau est arrondi ou ovalaire, plus souvent réniforme ou franchement irrégulier, la chromatine est peu dense, non mottée, et de structure régulière. Monocytes Lymphocytes normaux Les globules blancs (suite) Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 120

Les plaquettes : des cellules sanguine mature anucléé de 1 à 2 µm de diamètre provenant de la fragmentation cytoplasmique des mégacaryocytes elles sont spécialisées dans l’ hémostase Au frottis sanguin : les plaquettes sont des petits fragment cytoplasmique regroupés en amas Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 121

4.2. HEMOGRAMME PATHOLOGIQUE A ) anomalies des globules rouges : A-1 anomalie quantitative Anémie c’est la diminution de taux de l’ Hb Hb <13 g/dl chez l’homme Hb <12 g/dl chez la femme Hb <10,5 g/dl chez la femme enceinte Hb <11 g/dl chez l’enfant Hb <14 g/dl chez le nouveau-né normal anémie vraie Hb diminuée hémoconcentration hémodilution Hb diminuée fausse anémie plasma globules rouges Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 122

Principales circonstances où peut exister une hémodilution (fausse anémie) splénomégalie volumineuse Grossesse (>2ème trimestre) certaines immunoglobulines monoclonales (IgM, IgA) (Maladie de Waldenström, myélome) Surcharge volémique, insuffisance cardiaque. circonstances où peut exister une hémoconcentration (anémie masquée) Déshydratation Diurétiques Panhypopituitarisme, Insuffisance surrénale chronique Fausse anémie et anémie masquée Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 123

proérythroblaste (pro-EB) EB. basophile EB. basophile EB. polychromatophile EB acidophile (énucléation) réticulocyte hématie 24 à 48 H 24-48 H BFUE, CFU-E mécanisme 1 aplasie, envahissement mécanisme 2 érythroblastopénie mécanisme 3 : défaut de synthèse de l’Hb mécanisme 4 : défaut de synthèse de l’ADN mécanisme 5 dysérythropoièse mécanisme 6 raccourcissement de la durée de vie des GR mécanismes des anémies cellules souches hémolyse physiologique 120 j autres : ins. rénale, ins. endocrinienne, toxiques (alcool) Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 124

Caractérisation de l’anémie L’anémie est dite Macrocytaire si le VGM > 100 fl : causes : déficit en Vit B12 et folate Microcytaire si < 80 fl : causes : carence martiale, inflammation chronique et trouble d’utilisation du Fer Normocytaire si entre 80 et 100fl Normochrome si la CCMH est entre 32 et 36% Hypochrome si la CCMH est < 32% Si le taux de réticulocytes est > 120 000 l’anémie est dite régénérative Si le taux de réticulocytes est < 120 000 l’anémie est dite arégénerative Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 125

Polyglobulie c’est l’ élévation de la masse globulaire totale Homme Femme Globules rouges > 6 million/mm3 > 5milion /mm3 Hémoglobine > 18,5 g/dl > 16,5 g/dl hématocrite > 54% > 47% On distingue deux grands types de polyglobulie : La polyglobulie primitive : Maladie de Vaquez. La polyglobulie secondaire : insuffisance respiratoire chronique, cardiopathie congénitale , tabagisme, altitude, intoxication au monoxyde de carbone, sténose de l’ artère rénale , tumeurs (foie, rein, cervelet, ovaire, utérus ), maladie de Cushing, phéochromocytome . Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 126

A – 2 ) Anomalies qualitatives : au microscopie optique : Anomalies de taille : anisocytose = GR de différente tailles : GR de grande taille = macrocytes GR de taille normale= normocytose GR de petites taille = microcytose Anomalies de coloration : Hypochromie ( anulocytes cellules cibles…….) Anomales de formes : poikilocytose Drépanocytes Dacryocytes Ovalocytes Stomatocytes Acanthocytes Des globules rouges en rouleaux Schizocytes Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 127

Inclusionsérythrocytaires Corps de Jolly (Granule foncé unique dans le GR (reste de chromosome)) : splénectomie , myélodysplasies , drépanocytose , lupus, maladie cœliaque. Corps de Heinz (Inclusion d’ Hb dénaturée (coloration spéciale )) : déficit en G6PD, Hb instable. Ponctuations basophiles (Granulations bleutées dispersées dans le GR): intoxication au plomb, hémolyse , hémoglobinopathies . Anneau de cabot (Filaments circulaires rouges) : splénectomie , myélodysplasies , drépanocytose , lupus, maladie cœliaque. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 128

B – anomalies des Globule blanc : B-1 Anomalies quantitatives : Si le taux des globules blanc est augmenté : plus de 10000 elt /mm3 = hyperleucocytose si le taux des globules blanc est diminué : Moins de 4000 : une leucopénie Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 129

Polynucléaire neutrophile : Polynucléose neutrophile PNN > 7000 elt /mm3: physiologique : - après un effort physique - troisième trimestre de grossesse - nouveau-né Pathologique Infections bactériennes Maladies inflammatoires Nécrose tissulaire Corticothérapie Tabagisme Neutropénie : taux de PNN < 1500 500 < PNN < 1500 modérée < 500 sévère (agranulocytoses) Causes : Bactériennes : fièvre typhoïde ; brucellose ; Tbc Virales : grippe ; hépatites, Parvovirus B19 Parasitaires : paludisme , Kala-azar Toxiques : radiothérapie, benzène, pesticide Médicamenteux : Ibuprofène, phénobarbital Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 130

Polynucléaire éosinophile >500 en cas d’allergie, ou une parasitose Monocytose > 1000 elt /mm3 : en cas infection virales et bacteriennes , hémopathies malignes Une basophilie : allergie , hémopathies malignes. Les lymphocytes lymphocytose > 4000 elt /mm3 - bénignes : réactionnelles = infectieuses (bactérienne , virales …) maligne (syndrome lymphoproliferatifs) Lymphopénie < 800 : infectieuse virale HIV, aplasie médullaire…. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 131

B-2 Anomalies qualitatives : le frottis sanguin permet de : Faire l’équilibres leucocytaire : inversion de l’équilibre (lymphocytose ) Anomalies morphologiques: - PNN hyposegmenté ( infection, anomalies de Pelger Huet [ myélodysplasies ]) PNN hypersegmenté ( carence en B12, ) PNN hypogranulaire (Syndrome myélodysplasique [MDS], infections bactériennes) Cellules immatures : blastes , myélemie erythroblastes , plasmocytes Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 132

Formule d’ Arneth PNN hyper segmenté Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 133

Myélémie La myélémie se définit par le passage dans le sang de formes immatures de la lignée granuleuse ( métamyélocytes , myélocytes ) et moins souvent, promyélocytes . Une myélémie significative ( supérieure à 2%) est pathologique. Les principales étiologies des myélémies : •Transitoires: septicémie , anémies hémolytiques , chimiothérapie . • Chroniques : syndromes myéloprolifératifs , métastases médullaires . • L’ érythroblastose sanguine • L’ érythromyélémie est l’association d’une myélémie et d’une érythroblastose sanguine. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 134

C – Anomalies des plaquettes C –1) Anomalies quantitatives : Thrombocytose > 450 000 elt /mm3 primitives Secondaires Thrombopenie < 150 000 elt /mm3 Centrale Périphérique C- 2) Anomalies qualitatives des plaquettes Microplaquettes (volume plaquettaire moyen < 7 fl ) : syndrome de Wiskott -Aldrich Macroplaquettes (volume plaquettaire moyen > 10 fl ) : maladie de Jean-Bernard et Soulier Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 135

1. Myélogramme Aspiration de moelle osseuse au moyen d’un trocart Autre terme = cytoponction médullaire Prélèvement permettant une analyse quantitative et qualitative des cellules hématopoïétiques Buts : Diagnostic : anomalie de la NFS (origine centrale ou périphérique) Ex: myélodysplasies , leucémies aiguës, myélomes, PTI, syndrome d’activation macrophagique … Suivi de maladie résiduelle Pronostic : analyses cytogénétiques Cultures bactériologique, virologique, parasitologique PCR parvovirus B19, HHV8 4.3. MYÉLOGRAMME ET BIOPSIE OSTÉO-MÉDULLAIRE Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 136

Site de ponction Localisation : Dans les os courts et plats (sternum, crête iliaque) Sites de ponction Iliaque postérieur Sites de ponction Iliaque antérieur Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 137

Contre-indications Infection cutanée localisée CIVD Ponction sternale contre-indiquée si : Sternotomie Radiothérapie Enfants < 15 ans Réaliser une ponction iliaque Précautions : Non à jeun En cas de traitement anticoagulant Réalisable même si plaquettes < 10 000 /mm 3 Risques du geste : En sternal : traversée du sternum  perforation de l’aorte, médiastinite , ou pneumothorax En iliaque: hématome au point de ponction Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 138

Mode opératoire: Geste réservé aux médecins et pharmaciens NFS et hémostase avant le geste Asepsie rigoureuse Anesthésie locale : vérifier l’absence d’allergie Patch d’ Emla ® 30 min avant xylocaïne ® 1% non adrénalinée en SC Kalinox ® ou Meopa ® chez les enfants (protoxyde d’azote) Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 139

Etalement des frottis Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 140

Surveillance : Pas de surveillance particulière sauf si kalinox ® (malaise vagal, vomissements) Pansement à garder 24h Au laboratoire d’hématologie : Coloration au May- Grünwald - Giemsa (MGG) Lecture et interprétation par le biologiste Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 141

Estimation de la richesse médullaire Estimation de la quantité de chaque lignée ( mégacaryocytaire , érythroïde et granuleuse) (en % ) Estimation de la qualité de chaque lignée Mégacaryocyte Erythroblastes Précurseurs myéloïdes Polynucléaires neutrophiles Globules rouges Lecture et interprétation: Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 142

2. Biopsie ostéo-médullaire Prélèvement d’une carotte osseuse d’ 1 à 2 cm de long pour une analyse histologique (laboratoire d’anatomo-pathologie) Buts : Diagnostic : lymphomes, métastases médullaires, granulomatoses, syndromes myéloprolifératifs , aplasies médullaires, myélofibroses Bilan d’extension des lymphomes Localisation : Crète iliaque postérieure (éviter en antérieure) Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 143

Contre-indications : CIVD Infection cutanée localisée TP < 50% Ratio TCA > 1.2 Plaquettes < 50 000/mm 3 Traitement anti-agrégant plaquettaire Risques du geste : ostéite, hématome Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 144

Mode opératoire: Geste réservé aux médecins, invasif Tenir compte de l’état du patient (éviter chez les sujets très âgés, patients de réanimation) NFS et hémostase avant le geste Bien expliquer le geste au patient Prémédication pr les patients anxieux : ( sur prescription médicale) Xanax ® 0,25 mg en sublingual 30 min avant Geste stérile (champ et gants stériles, aseptie rigoureuse) Anesthésie +++ (vérifier si allergie) xylocaïne ® SC (1 ou 2% sans adrénaline) ou Kalinox ® + xylocaïne ® SC ou Emla ® + xylocaïne ® SC Enfants : anesthésie générale Myélogramme éventuel avant la BOM Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 145

Mode opératoire (suite) : Trocart à BOM enfoncé au niveau de l’os puis le mandrin est enlevé et le trocart enfoncé sur une longueur de 1 à 1,5 cm. Mouvements circulaires et mobilité en croix de l’extrémité du trocart pour extraire le trocart et bien décrocher la carotte osseuse Compression immédiate pendant 10-15 min (sac de sable) Carotte poussée hors du trocart à l’aide d’un mandrin spécial Réalisation d’ empreintes de BOM (carotte délicatement roulée entre deux lames) Introduction de la carotte dans son milieu de conservation (solution de bouin ou formol) Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 146

Biopsie ostéo-médullaire Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 147

Surveillance : Pansement compressif ( Mefix ® , Elastoplaste ® ) pendant 24h Mettre le malade en décubitus dorsal pour qu’il poursuive la compression par son poids pdt 30 minutes Prescrire si besoin des antalgiques uniquement à base de paracétamol Pas de bain pendant 2 jours Surveiller si saignements, douleur persistante, signes inflammatoires Au laboratoire d’Hématologie : Coloration des empreintes au MGG Lecture et interprétation par le biologiste Au laboratoire d’anatomo-pathologie : Décalcification 24h, déshydratation, inclusion en paraffine Colorations Lecture et interprétation par l’anatomo-pathologiste Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 148

Analyse histologique: richesse et architecture Tissu osseux Tissu de soutien et vaisseaux ( myélofibrose ) Richesse médullaire , topographie Marquages immuno -histochimiques Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 149

4.4. EXPLORATION DES ÉTATS ANÉMIQUE macrophages compartiments de stockage Hépatocytes Plasma (4mg) érythroblastes (20 mg) hématies (2500 mg) 1000 mg 1-2 mg / jour fer alimentaire transferrine plasma hépatocytes 1-2,5 mg/jour 25-30 mg/jour 10-25 mg/j 10% Fer 1. Carence martiale autres tissus 300 mg Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 150

Globules rouges Macrophage (rate, moelle, foie) Hème oxygénase F e(II) Céruloplasmine F e(II) F e(III) Fe(III)-Tf Ferroportine Apo-Tf recyclage du fer héminique La Tf est normalement saturée en fer à 30 %. Si < 16 % : carence sévère en fer Si > 45 % : surcharge en fer. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 151

Les principaux marqueurs biologiques du bilan martial sont : la ferritinémie (compartiment des réserves), le fer sérique (compartiment circulant), la transferrine et la capacité totale de fixation (CTF) (compartiment circulant), le récepteur soluble à la transferrine ( rs -TF) (compartiment fonctionnel). Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 152

a. Ferritinémie Elle reflète les réserves en fer de l’organisme. Son taux normal : 12 et 300 μ g/L. Une hypoferritinémie représente le signe le plus précoce de la carence martiale. Elle est physiologiquement plus basse chez la femme que chez l’homme. Une hyperferritinémie est causée par : surcharge en fer (hémochromatose), dysérythropoïèse , thalassémie majeure, aplasie médullaire, transfusions excessives. inflammations éthylisme chronique. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 153

b. Fer sérique ou sidérémie Le prélèvement pour dosage du fer sérique doit être réalisé sur tube sec, entre 8h et 10h du matin à jeun, et toujours à la même heure s’il s’agit d’un suivi. Le fer sérique présente en effet d’importantes variations nycthémérales : maximale à midi, minimale à minuit, avec une amplitude de 30% à 40% en moyenne. Valeurs normales du fer sérique en fonction de l’âge et du sexe Le fer sérique s’abaisse en cas de carence en fer , ou en cas d’ inflammation ou d’affection maligne . Le fer sérique est augmenté en cas de surcharge en fer , hépatite , cirrhose , alcoolisme chronique , hémolyse et dans les anémies sidéroblastiques . Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 154

c. Transferrine et capacité totale de fixation (CTF) La transferrine est un paramètre habituellement exprimé par la capacité totale de fixation (CTF) : CTF ( μ mol/L) = Transferrine (g/L) x 25. Coefficient de saturation en fer de la transferrine (CST) = Fer sérique / CTF. Il n’y a pas de cycle nycthéméral pour la transferrine et CTF. Valeurs normales de la transferrine et de la CTF en fonction de l’âge La transferrine diminue au cours d’un syndrome inflammatoire , surcharge en fer , insuffisance hépatocellulaire , dénutrition majeure . La transferrine augmente au cours de la carence en fer , la grossesse , la contraception orale . Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 155

Exploration des anémies microcytaires anémie ou microcytose et/ou hypochromie dosage fer + transferrine + CS ou ferritinémie fer sérique  transferrine  CS  ou ferritinémie  CARENCE MARTIALE fer sérique  transferrine N ou  CS  ou ferritinémie N ou  + syndrome inflammatoire ++ fer sérique N ou  ANEMIE INFLAMMATOIRE TROUBLE D’UTILISATION DU FER électrophorèse de l’hémoglobine Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 156

Exploration des carences vitaminiques Le dosage de la vitamine B12 et de la vitamine B9 est demandé devant une anémie macrocytaire devant la suspicion d’une origine carentielle. a. Vitamine B12 (cobalamine) La valeur normale est de 200 à 400 ng /L. On parle de carence en vitamine B12 lorsque sa concentration sérique est < 200 ng /L. L’abaissement du taux sérique de la vitamine B12 survient lorsque les réserves hépatiques sont épuisées (3 à 4 ans). L’élévation de l’homocystéine dans le sérum et dans les urines et l’élévation de l’excrétion urinaire d’acide méthylmalonique sont des tests de carence en vitamine B12 Le test de Schilling permet d’évaluer la malabsorption de la vitamine B12. Recherche des anticorps anti-facteur intrinsèque ( Ac anti-FI) est hautement spécifique de la maladie de Biermer. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 157

b - Vitamine B9 (folates) La valeur normale des folates sériques est entre 5 μ g/L et 15 μ g/L. L’abaissement du taux de folates sériques se produit lorsque les réserves hépatiques sont épuisées (2 à 4 mois). La valeur normale des folates érythrocytaires est > 200 μ g/L. Les folates érythrocytaires représentent le reflet des réserves tissulaires, alors que les folates sériques sont un reflet instantané des folates circulants. Le diagnostic d’une carence en folates repose sur le dosage des folates érythrocytaires. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 158

4.5. DIAGNOSTIC D’UNE HÉMOGLOBINOPATHIE Un bilan standard pour la recherche d’une hémoglobine anormale doit inclure 3 tests phénotypiques distincts , dont au moins une technique électrophorétique avec interprétation. Les techniques utilisées sont : soit séparatives : pour différencier les hémoglobines en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques (électrophorèse et chromatographie), soit non séparatives , mais mettant en évidence des propriétés spécifiques : test Itano (ou test de précipitation de l’ HbS ), recherche de corps de Heinz … Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 159

a. E lectrophorèse d’hémoglobine Elle sépare les hémoglobines en fonction de leur différence de charge dans un champ électrique. Nous distinguons plusieurs types : l’électrophorèse de zone à pH alcalin , l’électrophorèse à pH acide , l ’ isoélectrofocalisation , l ’électrophorèse capillaire . Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 160

b. chromatographie La chromatographie liquide haute performance (CLHP) sépare les différentes fractions d’hémoglobines en fonction de la force de leurs interactions ioniques sur une colonne échangeuse de cations. c. La spectrophotométrie de masse Elle permet la séparation de différents fragments protéiques de masses différentes . d. Test de solubilité de l’ HbS Le test Itano : il est essentiel pour confirmer la présence d’ HbS et repose sur le principe que seule l’ HbS désoxygénée précipite en milieu réduit. Le test de falciformation de Emmel : elle met en évidence les drépanocytes sur lame lorsque le frottis est mis en condition hypoxique. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 161

Morphologie des hématies dans la drépanocytose Forme de faucilles Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 162

Anomalies biologiques de la drépanocytose  Anémie normochrome , normocytaire, régénérative  Frottis : sujet homozygote : drépanocyte, corps de jolly , hematies polychromatophiles , érythroblaste  Diminution de l’haptoglobine, augmentation de la bilirubine non conjugué  Phénotypage : HbS électrophorèse en milieu acalin CLHP Génotypage : déterminé par Taux des différentes fractions de l’hémoglobine (homozygote ou hétérozygote S, hétérozygote composite SC ou S β ) Etude familiale Séqençage de l’ADN ou Southern Blot Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 163

e. Technique d’ immunochromatographie 1. HemoTypeSC TM TEST UTILISE POUR LE DIAGNOSTIC NEONATAL Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 164

2. Sickle SCAN TEST PERFORMANT MAIS NON-UTILISE POUR LE DIAGNOSTIC NEONATAL Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 165

2. THALASSEMIE Définition  A hémolytique congénitale ( corpusculaire )  Caractérisée par une diminution de synthése d’une ou plusieurs chaines de globines -  Thalassémie = Absence d’une ou plusieurs chaines  et synthèse d’autre globines en excés -  Thalassémie = Absence d’une ou plusieurs chaines  et synthèse d’autre globines en excés .  Maladies génétique , autosomale récessive,de pronostic sévère dans les formes homozygotes . Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 166

3. DÉFICIT EN G6PD Le déficit en G6PD est une anémie hémolytique corpusculaire aiguë due à un déficit en une enzyme érythrocytaire , glucose 6-phosphate déshydrogénase (G6PD) , intervenant dans la glycolyse érythrocytaire : la voie du shunt des pentoses. Les gènes codant cette enzyme sont portés par le chromosome X : transmission récessive liée à l’X, ne concernant donc que les hommes. Elle touche avec prédilection les sujets de race noire, les populations du pourtour méditerranéen et d’extrême orient. En RDC, elle est tres rependue en region Nord-Est dans l’ethnie kakwa et logo. Définition Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 167

Physiopathologie Le globule rouge est constamment soumis à des agents oxydants menaçant l’intégrité de la membrane et de l’hémoglobine. Son métabolisme comporte une voie de synthèse d’agents réducteurs appelée voie des pentoses. Les agents oxydants tels que O2- ou H2O2 sont produits par des facteurs exogènes (médicaments, infection) La lutte contre ces agents se fait en permanence grâce au glutathion (GSH). La G6PD permet la synthèse de la NADPH nécessaire à la synthèse du GSH. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 168

Diagnostic biologique 1. Hémogramme Il montre une anémie profonde (4 à 6 g/dl) normochrome normocytaire. Les globules blancs sont normaux ou augmentés éventuellement avec une myélémie discrète. Les plaquettes sont normales. Les réticulocytes sont très élevés. 2. Frottis sanguin La morphologie des globules rouges est normale. Des sphérocytes peuvent se voir dans les cas sévères. De nombreux corps de Heinz sont fréquemment retrouvés sur les colorations vitales. 3. Biochimie « Spot-test » de Beutler : méthode la plus simple pour détecter un déficit en G6PD à distance d’un épisode hémolytique. Il est utilisé pour le dépistage néonatal . Dosage enzymatique : Le dosage spectrophotométrique de l’activité enzymatique est la méthode diagnostique de certitude. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 169

4.6. IMMUNO-HÉMATOLOGIE ÉRYTHROCYTAIRE 1. Groupage ABO-Rhésus (voir plus haut) 2. Recherche d’agglutinines irrégulières Appelée d’anticorps irréguliers, car les anticorps recherchés sont des hémolysines de classe IgG et non pas des agglutinines de classe IgM . Ce sont des anticorps antiérythrocytaires dirigés contre des antigènes de groupe sanguin autres que ceux du système ABO. Ils sont dits irréguliers car, in vitro, ils n’agglutinent pas directement les globules rouges porteurs de l’antigène. Pour les mettre en évidence, il faut traiter les hématies par des enzymes (papaïne, trypsine) ou les placer en milieu albumineux. La plupart sont immuns, apparus à la suite d’une grossesse (l’allo-immunisation foeto-maternelle ) ou de transfusions (allo-immunisation tranfusionnelle ). Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 170

Test de Coombs Le test de Coombs , ou test à l’ antiglobuline , cherche à mettre en évidence des anticorps fixés à la surface des hématies et susceptibles de provoquer des hémolyses immunologiques. 1. Test de Coombs direct Il met en évidence des anticorps (immunoglobulines) fixés à la surface des hématies par une réaction d’agglutination réalisée au moyen d’ antiglobulines humaines (des anticorps anti-anticorps) : une antiglobuline polyvalente, une antiglobuline anti-IgG et une antiglobuline anti-complément (C3d). L’anticorps est titré par dilutions croissantes du sérum antiglobulines . Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 171

1. Test de Coombs direct Test de Coombs direct met en évidence des anticorps fixés sur la membrane du GR Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 172

Le test de Coombs direct sera utilisé : dans le cadre d’une maladie hémolytique du nouveau-né, pour démontrer la sensibilisation des GR du nouveau-né par les allo- Ac de nature IgG d’origine maternelle. Le test de Coombs direct est négatif en cas d’incompatibilité foeto-maternelle . dans le cadre d’une réaction transfusionnelle pour démontrer le plus souvent la sensibilisation des GR du donneur par les Ac du receveur. Il permettra ainsi de confirmer l’origine immuno -hémolytique de l’incident. dans le cadre d’une anémie hémolytique auto-immune pour démontrer la sensibilisation des GR du patient par les auto- Ac et/ou par du complément. 1. Test de Coombs direct Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 173

2 . Test de Coombs indirect Ce test a pour objet de mettre en évidence des anticorps antiérythrocytaires dans le sérum du malade. Il est dit indirect parce qu’il se pratique en deux temps : dans un premier temps, le sérum du patient est mis en présence d’un « panel » d’hématies étrangères, de phénotype connu, afin que les anticorps se fixent sur les cellules qui possèdent l’antigène de membrane correspondant. dans un second temps est réalisé un test de Coombs direct comme précédemment. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 174

Le test de Coombs indirect sera utilisé : dans le cadre de la recherche d’agglutinines irrégulières. dans le cadre d’un titrage d’Ac irréguliers chez une femme en période d’activité génitale. dans le cadre d’un phénotypage érythrocytaire. 2 . Test de Coombs indirect Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 175

4.7. MARQUEURS BIOLOGIQUES DE L’INFLAMMATION Protéines sériques de l’inflammation Caractéristiques à amplitudes de variation élevée : CRP ( proteine C réactive) , procalcitonine , SAA : jusqu’à 1000 fois la normale Cinétiques rapide (6h) et demi-vie courte (1jr) Processus inflammatoire débutant à amplitude de variation modérée : Fibrinogène , orosomucoïde , haptoglobine : de 200 à 400 fois la normale Cinétique 12 à 14h et demi-vie 2 à 6 jrs Recherche et suivi d’un processus inflammatoire à amplitude de variation faible : Céruléoplasmine , fraction C3 du complément : 2 fois la normale Cinétique d’ apparution > 48h et demi-vie de 3 à 6 jrs Indication : recherche et suivi d’un processus inflammatoire à amplitude de variation négative : Albumine , préalbumine et transferine Au cours des syndromes inflammatoires prolongés, on peut voir une hypoalbuminémie inférieure à 30g/L Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 176

Vitesse de sédimentation (VS) La VS est représentée par la mesure de la hauteur de la colonne globulaire formée au bout de 1 heure par le tassement des globules rouges dans un tube vertical. La VS après 1 heure est normalement inférieure à 10 mm chez l’homme, 20 mm chez la femme. Chez les sujets de plus de 50 ans, les valeurs normales peuvent atteindre 20 mm chez l’homme, 30 mm chez la femme et même 40 à 50 mm chez le vieillard. Physiologiquement, la VS est plus élevée chez la femme que chez l’homme ; elle se majore avec l’âge et lors de la grossesse. La VS est augmentée au cours des syndromes inflammatoires (les protéines de l’inflammation facilitent l’agrégation des GR), au cours de la grossesse surtout au troisième trimestre (du fait de l’hémodilution et de l’ hyperfibrinogénémie ), lorsque le taux d’hématocrite est diminué (anémie, hémodilution), dans les macrocytoses , les hypercholestérolémies, et au cours des traitements par oestroprogestatifs et par héparine. Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 177

Électrophorèse des protéines sériques L’électrophorèse des protéines sériques permet d’étudier le profil des protéines sériques de l’inflammation. Les protéines sont séparées en 5 fractions en fonction de leur poids moléculaire, du plus faible au plus élevé. Valeurs normales des 5 fractions des protéines sériques de l’inflammation Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 178

Une hypoalbuminémie peut être présente lors des syndromes inflammatoires sévères. L’élévation de la fraction α1- globulines est observée lors d’un syndrome inflammatoire à son début, tandis que l’augmentation des α2- globulines évoque un syndrome inflammatoire constitué. L’augmentation isolée des β- globulines est le témoin d’une élévation des taux de transferrine lors d’une carence martiale. L’hyper γ globulinémie peut être polyclonale ou monoclonale. Polyclonale , elle témoigne soit d’un processus infectieux chronique, soit d’une maladie auto-immune, soit d’une hépatopathie chronique. Monoclonale, elle doit faire rechercher un myélome. Électrophorèse des protéines sériques Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 179

Électrophorèse des protéines sériques Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 180

4.8. BILAN D’HÉMOSTASE Les tests de l’hémostase sont utilisés pour le diagnostic étiologique d’un syndrome hémorragique, ou pour évaluer le risque hémorragique avant une intervention chirurgicale. 1. Tests explorant l’hémostase primaire Numération des plaquettes Temps de saignement (TS) Temps d’occlusion plaquettaire Dosage du facteur Willebrand ( vWF ) Autres tests : Étude des fonctions plaquettaires par agrégométrie Étude des récepteurs membranaires plaquettaires par cytométrie de flux Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 181

2. Tests explorant la coagulation Tests globaux : Temps de céphaline activée (TCA) Temps de Quick (TQ) b. Dosage spécifique des facteurs de la coagulation. Dosage du fibrinogène Dosages séparés des facteurs de coagulation Dosage des inhibiteurs de la coagulation Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 182

3. Tests explorant la fibrinolyse a. Tests globaux : Ces tests sont historiques pour la plupart. - Test de lyse du caillot : valeur normale > 72 heures. Test de lyse des euglobulines : valeur normale > 3 heures. Un temps de lyse des euglobulines inférieur à 3 heures témoigne d’une hyperfibrinolyse . b. Tests indirects Dosage des produits de dégradation de la fibrine et du fibrinogène (PDF) Dosage des D-Dimères c. Dosage des facteurs du système fibrinolytique On peut doser : le plasminogène, les activateurs du plasminogène, les inhibiteurs de la fibrinolyse (anti-activateurs du plasminogène, α2 antiplasmine ). Prof. Dr Serge TONEN WOLYEC 183

2022-2023 Prof TONEN CHAPITRE V : LES EXPLORATIONS BIOCHIMIQUES Les analyses biochimiques sanguines mesurent la quantité de certaines substances chimiques ( chimie du sang ) et permettent d’évaluer la qualité de fonctionnement de certains organes et aussi de détecter des anomalies. Il y a de nombreux types d’analyses biochimiques sanguines. Elles mesurent des substances chimiques dont les enzymes les électrolytes les graisses (lipides), les hormones les sucres, les protéines les vitamines et les minéraux. Il arrive souvent que plusieurs substances chimiques soient regroupées et mesurées en même temps.

2022-2023 Prof TONEN Le prélèvement nécessite parfois qu e ca se passe en jeun. Un spectrophotomètres est l’appareil qui permet de déterminer la concentration d'une espèce chimique dans une solution . Pour se faire, l'appareil mesure l'intensité de la lumière (I) qui passe à travers un échantillon. LES EXPLORATIONS BIOCHIMIQUES

2022-2023 Prof TONEN 5.1. EXPLORATIONS BIOCHIMIQUES DES FONCTIONS DU FOIE Principales fonctions metaboliques hépatocellulaires A-Métabolisme glucidique néoglucogenèse synthèse et catabolisme du glycogène B-Métabolisme lipidique synthèse des AG, TG, PL synthèse et excrétion du cholestérol; synthèse des lipoprotéines ; C-Métabolisme protidique synthèse de l’albumine synthèse des globulines (sauf immunoglobulines) synthèse des facteurs de coagulation synthèse de l’urée d-Métabolisme hormonal et vitaminique métabolisme et excrétion des hormones stéroïdiennes ( œstriol E3) métabolisme des hormones polypeptidiques ( angiotensinogène ) E-Stockage sang, glycogène ,vitamine A ,vitamine B12 , f er

2022-2023 Prof TONEN f. fonction biliaire : - De nombreuses substances toxiques sont excrétés par voie biliaire sous forme de bile . - De plus les acides biliaires contenus dans la bile assurent une digestion et une absorption adéquate des graisses alimentaires. Principales fonctions metaboliques hépatocellulaires

2022-2023 Prof TONEN g. Fonction d’épuration – détoxification : - Uréogenèse - Détoxification de l’ammoniaque - Métabolisation des xénobiotiques ( medicaments , toxiques…) - Réactions conjugaison (bilirubine) - Activité phagocytaire des cellules de Kupffer Principales fonctions metaboliques hépatocellulaires

2022-2023 Prof TONEN LES MARQUEURS HEPATIQUES

Tests explorant les capacités de conjugaison et d'excrétion bilirubine totale : normale : entre 3 et 17 mol/l produit de dégradation de l'hémoglobine, présente sous forme conjuguée et non conjuguée (libre) Augmentation de la bilirubine non conjuguée : excès de production = hémolyse défaut de conjugaison par le foie (ictère du nouveau néet maladie de Gilbert) Augmentation de la bilirubine conjuguée anomalie hépatocytes : hépatite, cirrhose, cancer, médicaments cholestase intra-hépatique ictère post-opératoire bénin obstruction des voies biliaires : lithiase, cancer, sténose, atrésie cholangite sclérosant, cirrhose biliaire primitive bilirubine urinaire

Transaminases : normale entre 20 et 40 UI/l ASAT = SGOT = Aspartate amino transférase ALAT = SGPT = Alamine amino transférase ASAT : non spécifique du foie ( coeur , muscle, rein, pancréas, hématies) ALAT : plus spécifique Si élévation des ALAT : suggère la présence d'une nécrose hépatocytaire Si ALAT augmentent fortement (> 1000 UI/l) : très évocateur d'une hépatite virale ou toxique Si ASAT/ALAT > 1.2 = évocateur alcool Si ASAT/ALAT < 0.8 = autres causes LDH : Lactate DesHydrogénase peut s'élever au début d'une hépatite virale non spécifique Ferritine et B12 Tests reflétant les dommages au niveau du foie

Tests indiquant un obstacle à l'écoulement biliaire Phosphatases alcalines : PA présentent dans presque tous les organes les PA plasmatiques proviennent du foie et de l'os donc leur élévation n'est pas spécifique d'une maladie hépatique élévation modérée avec l'âge élévation en cours de grossesse (X 2) Causes d'élévations d'origine hépatique assez peu nombreuses : métastases hépatiques cirrhose biliaire primitive lithiase biliaire (et compression biliaire) GT : Glutamyl Transférase ( g GT s'élève dans 90 % des maladies du foie non spécifique d'une maladie donnée élevées au cours de l'alcoolisme mais se normalisent après quelques semaines d'abstinence 5'- nucléotidase : fait partie des phosphatases alcalines permet de confirmer l'origine hépatique d'une augmentation des PA

Tests renseignant sur les capacités de synthèse Albumine sérique : normale entre 35 et 50 g/l synthétisée par le foie donc diminuée au cours des maladies hépatiques mais peut aussi être modifiée par d'autres facteurs utile au cours d'une maladie du foie afin de quantifier le degré d'insuffisance hépatocellulaire Facteur V

2022-2023 Prof TONEN Que retenir de l’exploration de la fonction hépatique ?

L’homéostasie du milieu intérieur est assurée en majeur partie par le rein. Les reins en bonne santé contrôlent le volume du liquide organique et sa composition (sels, substances nutritives, déchets, etc.). De plus le rein à de nombreux rôles liés au système cardio-vasculaire, au système digestif et au système endocrinien. 5.2. EXPLORATIONS BIOCHIMIQUES DES FONCTIONS RENALES

Les fonctions rénales Maintenir l’équilibre hydroélectrolytique et acido-basique. Élimination des déchets d’origine métabolique (urée, acide urique…). Fonctions endocrines : synthèse de rénine, d’érythropoïétine et de vitamine D. Elimination des substances exogènes ( Mdcmts ). Cependant le rôle principal du rein dans le métabolisme de l’organisme est la formation de l’ urine . Fonction qui englobe : Excrétion des déchets Pouvoir de préservation La fonction de régulation

Exploration biologique de la fonction rénale Les principaux paramètres du bilan rénal sont: Le dosage de l’urée et de la créatinine ; Évaluation de la clairance de la créatinine ; L’ionogramme sanguin et urinaire ; Calcémie, phosphorémie ; Autres déterminations (pH) et Bandelette Urinaire ; Recherche d’une protéinurie.

Urée : L’urée est synthétisée au niveau du foie, elle représente le terme ultime de l’élimination de l’azote aminé excédentaire de l’organisme. Elle s’élimine à 90% dans les urines. Dépend du régime alimentaire (protéique), de l’état d’hydratation et du catabolisme protéique. L'urée n'est pas toxique en elle-même mais elle signe le plus souvent une insuffisance rénale.

Urée sanguine : Normes : 3 – 8.5 mmol /l ; 0.15 – 0.50 g/l Variations pathologiques : - : signe d’IR – hypovolémie – régime riche en protéine. - : pathologie du foie – régime pauvre en protéine. Urée urinaire : 200 – 500 mmoles /24H.

La créatinine La créatinine est produite par le muscle après déshydratation de la créatine-P. Cette dernière est formé au niveau du foie à partir de la glycine et de l’ arginine . La créatinine formée dans le muscle, est libérée dans le sang, atteint le rein où elle est filtrée. Elle ne subit ni réabsorption, ni sécrétion tubulaire  Clairance de la créatinine. La créatininémie est donc un paramètre fidèle de la fonction rénale. Dépend du sexe (plus basse chez la femme), de l’âge, de la masse musculaire et de l’exercice physique.

Normes : 50 – 120 µmol/l 6 – 13 mg/l Homme : 7 – 13 Femme : 6 – 12 Enfant : 3 – 5 Nourrisson : 0 – 5 Variations pathologiques : - : IR – masse musculaire augmente - : femme enceinte (DSR) - masse musculaire diminue Créatininémie

La clearance de la créatinine La clearance ou coefficient d’épuration plasmatique est le volume de plasma épuré par le rein par unité de temps. La clearance est donnée par la formule suivante: clearance C = (U x V)/P U: la créatinine urinaire en mg/l V: la diurèse des 24h en ml/min P: la créatinine plasmatique en mg/l La valeur normale de la clearance de la créatinine est de 120 ± 20 ml/min pour une surface corporelle de 1,73 m². La clearance doit être toujours corrigée: Cl corrigée = cl calculée x 1,73 / surface corporelle

Les conditions à respecter pour une évaluation correcte de la clearance: Le sujet doit boire 2 litres d’eau, au minimum, lors de la réalisation de l’épreuve; Le poids et la taille du sujet doivent être connus pour corriger la clearance; Le prélèvement sanguin doit être effectué le jour du dosage; Bien chiffrer la diurèse des 24h. La clearance de la créatinine

Il existe de nos jours plusieurs formules pour estimer la clearance de la créatinine, la plus utilisée est la formule de COCKROFT et GAULT : Cl de la créat = (140 – âge ) x poids (kg) x A créatininémie (µmol) - A = 1.23 (homme) 1.04 (femme) Cette formule est valable chez l’adulte, à partir de 18 ans, est moins précise chez le sujet âgé (>75ans) et le patient très obèse. La clearance de la créatinine

2022-2023 Prof TONEN TPE Recherchez la formule permettant d’estimer le débit de filtration glomérulaire : 1. CKD-EPI 2. MDRDs

Ionogramme plasmatique et urinaire Ionogramme plasmatique : La détermination des ions Na+, K+, Cl-, Ca2+ et bicarbonates est indispensable pour apprécier l’équilibre hydro-électrolytique dont le rein est le principal garant. Ces dosages sont indispensables pour la surveillance d’une IR Ionogramme urinaire: Na/K urinaire sert effectivement à distinguer les IR fonctionnelles (rapport <1) des IR organiques (rapport > 1). CBS-500 pH, K+, Na+, Cl-, Ca2+

2022-2023 Prof TONEN Valeurs usuelles Le trou anionique (TA) plasmatique représente la différence entre les cations mesurés et les anions mesurés. E tant donn é que le sodium est le principal cation mesu ré et que le chlore et les bicarbonates sont les principaux anions mesurés, le trou anionique est donn é par la formule : TA = [Na] – [Cl – HCO3] Valeur normale : 12 ± 4 mEq /L.

Déterminations effectuées sur l’urine Aspect macroscopique de l’urine: L’urine normal est claire de couleur jaune paille due à des pigments hétérocycliques: l’urochrome, l’ uréorythrine … Aspect microscopique HÉMATIES : moins de 5 hématies par mm3 LEUCOCYTES moins de 10 000 leucocytes/ml. LES CRIST AUX n'ont pas de signification pathologique. LA PRÉSENCE DE GERMES à l'examen direct nécessite une uroculture .

Conditions de prélèvement uniraire La majorité des dosages se font sur une Diurèse de 24 heures. Collecte des Urines 24 H : Faire uriner le patient par exemple à 8 H, éliminer ces urines. A partir de ce moment le patient collectionnera toute miction dans un bocal approprié (conserver au réfrigérateur), le lendemain à 8 heures, le patient videra sa vessie dans le bocal.

Analyse chimique par les bandelettes réactives L’examen « chimique » des urines est orienté à l’aide de bandelettes réactives. C’est un test qualitatif et semi-quantitatif. Les bandelettes sont constituées par un support plastique rigide sur lequel sont fixées des plages réactives distinctes. il convient d'utiliser une urine fraîche, en recueillant les urines après la toilette génitale et au milieu du jet. Le temps de lecture varie entre 0 et 60 secondes. Toute anomalie impose une confirmation par des examens de laboratoire.

Elles comportent les paramètres suivants : pH Leucocytes : symptôme d'infection urinaire. Nitrite : infection bactérienne des reins ou des voies urinaires. Densité : symptôme d'infection urinaire. Glucose , cétone . Protéines . Sang : traumatisme urinaire, menstruations, infections graves des reins et des voies urinaires, urolithiase , soupçon de tumeur des reins ou de la vessie. Bilirubine , Urobilinogène . Analyse chimique par les bandelettes réactives

Protéinurie La protéinurie est la plus fréquente des anomalies urinaires, voire le seul signe d’une atteinte rénale. Sa mise en évidence, lors de contrôles systématiques, le plus souvent à l'aide de bandelettes réactives La protéinurie physiologique varie de 20 à 100 mg/24 h ; elle est composée de 30% d’albumine et 70 % de globulines

La protéinurie est dite pathologique lorsqu'elle est supérieure à 150 mg /24 h et qu'elle possède un caractère permanent Protéinuries d'origine glomérulaire : ce sont les plus fréquentes (90 % des cas). Elles sont liées à une altération de la membrane basale glomérulaire Protéinuries d’origine tubulaire Protéinuries monoclonales ou pré-rénales (Ex. Bence Jones dans le myelome multiple ) Protéinurie

2022-2023 Prof TONEN Protéinurie NB: Dosage de la microalbuminémie comme marqueur de la maladie rénale chronique

2022-2023 Prof TONEN 5.3. EXPLORATIONS BIOCHIMIQUES DES FONCTIONS TYROÏDIENNES L’hormone thyréostimulante (TSH) est produite par les cellules thyréotropes de l’ antéhypophyse . les taux de TSH sont corrélés avec ceux de T4 (thyroxine) : une réduction de moitié de la T4 libre multiplie par 100 la concentration de TSH. La tri- iodothyronine est l’hormone la plus active. La majorité de la T3 circulante (80 %) provient de la désiodation de la T4 au niveau des tissus périphériques (foie, rein, muscle, cerveau, etc.).

- + trh - + tsh hormones thyroidiennes hypothalamus Antéhypophyse thyroïde Rétrocontrôle négatif Rappel physiologique

TSH : -Hormone hypophysaire à 2 sous unités α , β - indicateur le plus sensible pour évaluer une dysthyroidie Une TSH ==> hyperthyroidie Une TSH == > hypothyroidie Un taux normal exclut toute affection thyroidienne . Elle est également indiquée dans la surveillance des traitements des dysthyroidie Paramètres d’exploration de la thyroide

Paramètres d’exploration de la thyroide T4 : - thyroxine libre - ½ vie : 6j - adulte : 12 - 22 pg /ml T3 : - ½ vie :1 j - adulte :2,8 - 7 pg /l

Anticorps ; 1- anti-peroxydase ( ATPO ) ; - peroxydase ; glycoprotéine cellulaire de surface - Diagnostic d’une maladie thyroidienne Auto-immune 2- AC ANTI-THYROGLOBULINE ( AAT ) - thyroglobuline ; stokée dans la colloide - peuvent provoquer une interférence dans le dosage de la thyroglobuline intérêt : - Diagnostic d’une maladie thyroidienne auto-immune -validation d’un dosage de la thyroglobuline 3-AC ANTI-RECEPTEURS DE LA TSH (TRAC) : Paramètres d’exploration de la thyroide

CALCITONINE : hormone hypocalcémiante -synthétisé parles cellules C parafolliculaire - interèt : -marqueur de reference du Kc medulaire de la thyroide ( DC ) - +suivie aprés thyroidectomie totale - valeur normale : < 10pg/ml Paramètres d’exploration de la thyroide

2022-2023 Prof TONEN 5.5. EXPLORATIONS BIOCHIMIQUES DU DIABETE SUCRE Les outils biologiques : Glycémie (VN dépend du moment de prélèvement) Hémoglobine A1c (< 7 %) Insuline Peptide C (VN : 0,5 et 5 ng / mL ou 0,2 à 1,7 nmol /L) Auto-anticorps anti-insuline Anticorps anti-cellules pariétales Cétonurie Glycosurie Les tests dynamiques : Epreuve à jeun : 3,9 à 5,5 mmol /L (0,70 à 1 g/L). Post-prandiale : < 7,8 mmol /L HGPO (ingestion de 100 gr de glucose) test de O’Sullivan (ingestion de 50 gr de glucose chez les femmes enceintes)

2022-2023 Prof TONEN 5.6. EXPLORATIONS BIOCHIMIQUES DES DYSLIPIDEMIES TP à envoyer avant samedi

2022-2023 Prof TONEN 5.6. MARQUEURS TUMORAUX TP à envoyer avant samedi

1. EXAMENS DES SELLES 1. Coprologie parasitaire Examens parasitologiques des selles Tout examen parasitologique des selles comporte : - un examen macroscopique des selles ; - un examen microscopique des selles ou examen direct ; - un examen microscopique après concentration ; - éventuellement on applique un examen spécial pour identifier certains parasites après avis du biologiste. 2022-2023 Prof TONEN CHAPITRE V : LES EXPLORATIONS SUR DES ECHANTILLONS NON SANGUINS

2. Prélèvement des selles Cet examen doit être pratiqué 2 à 3 fois et quelques jours d’intervalle Une partie du prélèvement sera fixée dès l’émission selon deux méthodes : - Méthode de SAPERO LAWLESS et STRUME (MIF) Dans un tube à hémolyse mélanger 0,15ml (ou 3 gouttes) de Lugol à 5% à 2,35ml de solution de MI ( Merthilate formol) puis déposer aussitôt une quantité de selles et homogénéiser l’ensemble avec 1 agitateur. Cette première méthode permet de conserver des formes végétatives des protozoaires ; - Eau formolée à 5% pour les selles fermes à 10% pour les selles pâteuses à 15% pour les selles liquides. Cette deuxième méthode permet la lyse des formes végétatives des protozoaires. 2022-2023 Prof TONEN

3. Examen macroscopique des selles - l’aspect des selles (selles dures, moulées, molles, pâteuses ou liquide) - la couleur - la présence des sangs ou des glaires - la présence d’éléments nutritionnels - la présence des parasites (anneaux des ténias, oxyures, ascaris). - leur abondance 2022-2023 Prof TONEN

4. Examen microscopique des selles Examen direct pour la recherche des parasites Examen après coloration des selles Coloration en solution de Lugol double Coloration au MIF ( Merthiolate iode formol) Coloration sur lame Coloration en tube 2022-2023 Prof TONEN

5. Techniques de concentrations ou d’enrichissement des selles Technique de sédimentation en eau glycérinée Technique de flottation de WILLIS Technique MIF concentration (diphasiques). 2022-2023 Prof TONEN

2. EXAMEN CYTO-BACTERIOLOGIQUE DU LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN 2022-2023 Prof TONEN Prélèvement : Ponction lombaire La PL est un acte pouvant être réalisé en urgence, pour diagnostiquer une maladie telle qu’une méningite bactérienne. C ontre-indications. hypertension intracrânienne thrombopénie sévère (baisse des plaquettes dans le sang), troubles de l’hémostase et de la coagulation Infection au site de la ponction

2022-2023 Prof TONEN Aspect macroscopique : Le LCR est normalement clair, souvent qualifié de l’eau de roche. Cependant, cet aspect normal peut subir des modifications : - Liquide hémorragique : Traumatisme vasculaire lors du prélèvement ou une hémorragie méningée. - Liquide xanthochromique : de couleur jaune : Ce liquide peut évoquer une hémorragie méningée ancienne ou une atteinte tuberculeuse des méninges - Liquide trouble : Modification provoqué par une hypercytose et oriente vers une méningite purulente bactérienne.

Dosage de glucose dans le LCR ou Glycorachie 2022-2023 Prof TONEN

3. EXAMEN DU LIQUIDE SEMINAL, VAGINAL ET DES LIQUIDES D’EPENCHEMENT EXAMEN DU LIQUIDE SEMINAL Pour contrôler la fertilité masculine, on effectue les analyses suivantes au laboratoire. On mesure d’abord de volume, on mesure aussi : Le pH ; Estimation du % des spermatozoïdes mobiles et viables ; ou encore La recherche des cellules et des bactéries ; Numération des spermatozoïdes ayant une morphologie normale à partir d’une préparation colorée. 2. FROTTI VAGINAL, RECTO-VAGINAL, URETHRAL 3. ANALYSES DU LIQUIDE D’ASCITE (Cytologie, Albumine [gradient d’albumine ou le Rivalta ]) 2022-2023 Prof TONEN

2022-2023 Prof TONEN Merci pour votre attention

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