Cell Journal November 12 2010 Volume 143 Number 4 Cell Press

Cell Journal November 12 2010 Volume 143 Number
4 Cell Press download
https://ebookbell.com/product/cell-journal-
november-12-2010-volume-143-number-4-cell-press-2499490
Explore and download more ebooks at ebookbell.com

Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Cell Journal November 24 2010 Volume 143 Number 5 Cell Press
https://ebookbell.com/product/cell-journal-
november-24-2010-volume-143-number-5-cell-press-2500400
Cell Journal 1 April 2011 Volume 145 Issue 1 Pp 1162 Emilie Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-
journal-1-april-2011-volume-145-issue-1-pp-1162-emilie-marcus-2134186
Cell Journal 4 March 2011 Volume 144 Issue 5 144 5 Emilie Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-
journal-4-march-2011-volume-144-issue-5-144-5-emilie-marcus-2087188
Cell Journal 18 March 2011 Volume 144 Issue 6 Pp 8271000 144 6 Emilie
Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-
journal-18-march-2011-volume-144-issue-6-pp-8271000-144-6-emilie-
marcus-2107840

Cell Journal 29 April 2011 Volume 145 Issue 3 145 3 Emilie Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-
journal-29-april-2011-volume-145-issue-3-145-3-emilie-marcus-2222270
Cell Journal 13 May 2011 Volume 145 Issue 4 145 4 Emilie Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-
journal-13-may-2011-volume-145-issue-4-145-4-emilie-marcus-2246720
Cell Journal 27 May 2011 Volume 145 Issue 5 145 5 Emilie Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-
journal-27-may-2011-volume-145-issue-5-145-5-emilie-marcus-2258844
Cell Journal Volume 145 Number 6 June 10 2011 Volume 145 Issue 6
Emilie Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-journal-
volume-145-number-6-june-10-2011-volume-145-issue-6-emilie-
marcus-2351770
Cell Journal 22 July 2011 Volume 146 Issue 2 Emilie Marcus
https://ebookbell.com/product/cell-
journal-22-july-2011-volume-146-issue-2-emilie-marcus-2411544

Leading Edge
InThisIssue
Making Neurons from Rett Patient Stem Cells
PAGE 527
Using Rett syndrome (RTT) as a prototype autism spectrum disorder (ASD),
Marchetto et al. generated induced pluripotent stem cells (iPSCs). Neurons
derived from RTT-iPSCs had fewer synapses and altered connectivity
when compared to control neurons. Strikingly, synaptic defects in RTT
neurons could be rescued pharmacologically, suggesting that there is
a developmental window in an autism syndrome when potential therapies
could be effective. These RTT patient-derived neurons also provide a prom-
ising cellular tool for drug screening, biomarker identiﬁcation, and person-
alized treatment.
Translation Gets Pol II’s Stamp of Approval
PAGE 552
Rpb4/7, a heterodimer of RNA polymerase II (Pol II) subunits, regulates pre-
mRNA synthesis. It stays bound to the mRNA and accompanies it to the cytoplasm where, Harel-Sharvit et al. now
report, the dimer interacts directly with eIF3 to regulate translation. Efﬁcient translation depends on Rpb4/7’s prior
association with RNA Pol II in the nucleus. Thus, Rpb4/7 integrates the various stages of gene expression into one func-
tional system.
Strippers for Protein Polyglutamylation
PAGE 564
Proteins can be polyglutamylated, but the enzymes that remove these groups are unknown. Rogowski et al. now
identify several protein deglutamylases as members of the cytosolic carboxypeptidase (CCP) family and describe
the enzymatic mechanism of protein deglutamylation. Mice lacking CCP1 are subject to hyperglutamlyation of tubulin,
and subsequent neurodegeneration, suggesting regulatory roles for control of polyglutamylation.
Hrd-ing Misfolded Proteins out of the ER
PAGE 579
Misfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) need to be transported back into the cytosol for polyubiquitination
and degradation. In this issue, Carvalho et al. show that the ubiquitin ligase Hrd1p is the crucial membrane component
in this retrotranslocation. The authors propose that Hrd1p cooperates with the cytosolic Cdc48p ATPase complex to
move misfolded proteins through the ER membrane.
Paused Polymerase Takes On DNA-Encoded
Nucleosome Formation
PAGE 540
Pausing of RNA polymerase II during early elongation was initially thought
to be a rare mechanism for attenuating transcription; however, it’s now
known to be widespread, raising questions about the role of paused poly-
merase. Here, Gilchrist et al. report that pausing stimulates transcription
potential by preventing formation of repressive promoter chromatin. Their
ﬁndings suggest that competition between paused polymerase and nucle-
osomes for promoter occupancy has evolved as a prevalent gene regula-
tory strategy.
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.487

T Cells Help B Cells Help Themselves
PAGE 592
Selection for B cells with high-afﬁnity B cell receptors occurs in the germinal
centers (GCs). This process was thought to involve competition of B cells
for antigen in the GC. Using a novel live-microscopy approach, Victora
and colleagues visualize the dynamics of GC selection. Their ﬁndings
suggest that access to help from GC-resident T cells, and not competition
for antigen, is the limiting factor in GC selection.
UPBEAT in the Zone
PAGE 606
InArabidopsis, stem cell progeny at the root tip rapidly proliferate in an
amplifying zone and then increase in size and differentiate in an adjacent
elongation zone. In this issue, Tsukagoshi et al. identify a transcription
factor, UPBEAT1 (UPB1), that regulates the balance between proliferation
and differentiation at the interface of these two zones. UPB1 regulates levels of reactive oxygen species (ROS) in the
transition zone by controlling the expression of a set of peroxidases. Comparison to ROS-regulated growth control in
animals suggests that a similar mechanism is used in plants and animals.
A Gemisch of EpiSCs
PAGE 617
Pluripotent stem cells contribute to teratomas when injected into an organism or to chimeras when injected into an early
embryo. However, stem cells derived from mouse epiblast tissue (EpiSCs) show restricted pluripotency and rarely form
chimeras. Han et al. now show that EpiSCs actually comprise two different subpopulations of cells in culture. The major
subpopulation shares features with late mouse epiblast cells and cannot form chimeras, whereas cells in the minor
population resemble early mouse epiblast cells and can readily form chimeras, thus explaining the restricted potency
of EpiSCs.
Sounds Painful
PAGE 628
Acute and chronic pain affects millions of people worldwide. In this issue,
Neely et al. use genome-wide RNAi screening inDrosophilato identify
genes involved in heat nociception. Mice mutant for one of these genes,
a2d3(straightjacketin ﬂies), have impaired heat pain sensitivity, and in
humans,a2d3 SNP variants associate with reduced sensitivity to acute
noxious heat and chronic back pain. Surprisingly, functional brain imaging
ofa2d3mutant mice indicated that thermal pain and tactile stimulation
trigger strong sensory cross-activation of brain regions involved in vision,
olfaction, and hearing.
Metabolites Move up the Regulatory Chain
PAGE 639
Small metabolites represent the vast majority of molecules in a cell. Li et al.
now provide insight into protein-metabolite interactions, suggesting that they have an extensive role in the regulation of
protein activity. Among the many prospective interactions identiﬁed, the authors speciﬁcally characterize those
involving ergosterol, the yeast analog of cholesterol, which they show binds to many proteins including kinases, thereby
affecting their functions and levels.
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.489

Leading Edge
Select:ManipulatingCellularMachinery
Cells can be manipulated for any number of purposes, owing to the emergence of synthetic biology
and bioengineering tools. Recent biotechnological advances have generated improved therapeu-
tics, sophisticated biosensors, and new energy sources. The ﬁndings presented in this Select high-
light innovative ways to both dissect and reconstruct various cellular machineries and components.
An Untaxing Way to Produce Taxol Precursors
Taxol (paclitaxel) is a potent anticancer therapeutic typically used to treat
breast, lung, and ovarian cancers. Historically it has been produced by
synthetic or semisynthetic routes, requiring as many as 51 synthesis steps or
the use of a plant-derived intermediate, baccatin III, respectively. Ajikumar
et al. (2010) introduce a new approach to produce Taxol: engineering the iso-
prenoid pathway inEscherichia coli. There are two pathways to consider for
Taxol biosynthesis: the native upstream isoprenoid pathway produces meta-
bolic precursors, and the downstream taxadiene pathway has been recon-
structed successfully inE. coli. To date, most groups have assumed that these
pathways are additive, without paying due attention to toxic side effects of
intermediate metabolites or competing pathways and metabolites that could
inhibit the drug production. With traditional combinatorial approaches unavail-
able for taxadiene, the team undertook a ‘‘multivariate modular pathway engi-
neering’’ approach, splitting the pathway into two individually addressable
modules. The upstream module focused on the four rate-limiting genes of the
methylerythritol phosphate pathway. The downstream module comprised the
two-gene pathway, resulting in taxadiene. By tweaking various genetic compo-
nents and expression levels in the modules, the authors were able to optimize
taxadiene production to levels 15,000-fold greater than the control, yielding
1.02 g/l (to date, the highest reported titers from metabolically engineered
microbes have been a modest10 mg/l). These yields notwithstanding, the key challenge in the generation of Taxol-
producing microbes is the oxidation of taxadiene to taxadien-5a-ol via CYP450, a plant enzyme that is difﬁcult to express
inE. coli. By generating a chimeric CYP450, the authors are able to produce the alcohol but discover drastic reductions in
taxadiene production, with concomitant increases in a pathway inhibitor, indole. Improvements to the CYP450-based oxida-
tion chemistry that converts taxadiene to taxadien-5a -ol will open the door to commercial-scale synthesis of Taxol and other
high-value terpenoids for use as chemicals or fuels.
P.K. Ajikumar et al. (2010). Science343, 70-74.
This Cell Can Smell
Whole-cell biosensors have attracted great interest in recent years, owing to their ability
to detect environmental contaminants with high speciﬁcity and sensitivity. Misawa et al.
(2010) now show that oocytes fromXenopus laeviscan also be engineered for use as
chemical sensors, detecting odorants under controlled conditions in a portable ﬂuidic
device. Because of their large size ( 1 mm in diameter), oocytes have been used as
model systems in electrophysiology experiments; and, like all living systems, they can
respond to certain chemicals by converting chemical signals into an ampliﬁed current
signal, which can be detected using capillary electrodes. The authors use microinjec-
tions to introduce RNAs encoding the odorant or pheromone receptors from moths or
ﬂies that detect bombykol, bombykal, Z11-16:Ald, or 2-heptanone. The oocytes are trap-
ped within a microﬂuidic chamber under optimized temperature and ﬂow conditions. The
modiﬁed oocytes can ‘‘smell’’ odorants down to a concentration of 10 nM, with variation
in sensing capabilities most likely due to variability in receptor expression levels. The live-
cell sensor is also able to discriminate between bombykol and bombykal, which differ
only by a terminal alcohol or aldehyde, respectively, thereby highlighting the sensor’s
inherent speciﬁcity in detecting slight differences in chemical structures. The bio-hybrid
sensor is ultimately interfaced with a robot to demonstrate that it retains the capacity for
chemical sensing under shaking conditions to mimic ‘‘real world’’ implementation of the
technology.
N. Misawa et al. (2010). Proc. Natl. Acad. Sci.107,15340-15344.
Microbes can be instructed to build complex
chemical networks. Image courtesy of G. Steph-
anopoulos.
A portable ﬂuidic device that detects odorants can be attached to a human-like robot. Image courtesy of S. Takeuchi.
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.491

Fast Track to Biofuels with Cellodextrin Transport
The plant cell wall is highly resistant to degradation, which poses a signiﬁcant challenge to the bioethanol industry.Saccha-
romyces cerevisiaeis currently the yeast-of-choice for fermenting sugars from cornstarch or sugarcane; but these yeasts are
unable to naturally ferment cellodextrins derived from plant cell walls without the assistance of cellulase cocktails containing
b-glucosidases, which release yeast-fermentable glucose. The degradation of cellodextrins exhibited by the cellulolytic
fungusNeurospora crassahas inspired Galazaka et al. (2010) to create new yeast strains for enhanced growth and production
of bioethanol. Two sugar transporters, CDT-1 and CDT-2, are important for plant-fungi symbiosis and plant degradation.
Genes encoding intracellularb-glucosidases are also widespread in fungi, attesting to their importance for optimal growth
of fungi on cellulose-derived sugars. Toward complete cellodextrin catabolism and production of lignocellulosic biofuels,
the authors re-engineered anS. cerevisiaestrain to contain the functional cellodextrin transport system fromN. crassa
(CDT-1, CDT-2, and ab-glucosidase, GH1-1). Simultaneous sacchariﬁcation and fermentation (SSF) is typically limited by
the need for complete extracellular conversion of cellodextrin to glucose, which is then transported into the cell. For SSF
in yeast re-engineered to expresscdt-1andgh1-1, the authors bypassed this extracellular step to allow the cell to take up
cellodextrin via CDT, with intracellular conversion to glucose viab-glucosidases. The result is a biofuel-producingS. cerevi-
siaestrain that sidesteps the fermentation bottleneck for lignocellulosic biomass, with yields comparable to those reported
from the bioethanol industry.
J.M. Galazka et al. (2010). Science330, 84-86.
Redecorating the Walls
Antibiotic-resistantStaphylococcus aureushas emerged as a major public health threat, with
the number ofS. aureus-infection-related deaths on the rise. Nelson et al. (2010) present an
innovative engineering approach to incorporate nonnative small molecules into theS. aureus
cell wall—a technique that could have myriad implications for imaging bacteria, engineering
organisms with novel functions, and, perhaps most importantly, discovering new therapeu-
tics. To incorporate small molecules into the bacterial cell wall, small molecules conjugated
to ‘‘cell wall sorting’’ peptides with the sequence LPETG were administered toS. aureus.
These peptide sequences were recognized by the periplasmic enzyme sortase A, which
covalently cleaves the peptide and attaches the new N terminus to lipid II in the cell wall.
The authors conﬁrm, using immunocryoelectron microscopy and mass spectrometry, respec-
tively, that the peptides localize and covalently attach to the cell wall. Covalent attachment of
small molecules then permits the incorporation of azido groups into the cell wall, which can
undergo click reactions with alkyne groups in a manner that does not interfere with native
cellular biochemistry. Thus, the authors demonstrate the ability to functionalize the bacterial
surface with an array of reactive molecules, which could enable further perturbation and
studies of bacterial process in vitro and in vivo.
J.W. Nelson et al. (2010). ACS Chemical Biology published online October 5, 2010. 10.1021/cb100195d.
High-Frequency Genes, High-Speciﬁcity Antibodies
Antigen-speciﬁc monoclonal antibodies are typically identiﬁed by screening immortalized B cells or recombinant antibody
libraries. Both in vivo and in vitro methods suffer from complex design and technical drawbacks that limit their use for rapid
and reliable antibody selection. In a recent report, Reddy et al. (2010) present an antibody isolation method that uses high-
throughput DNA sequencing to analyze thevariable heavy(V
H) andlight(V
L) gene repertoires of antibody-secreting bone
marrow plasma cells from immunized mice. Bioinformatic analysis then ranks the frequency ofVgenes, which permits the
identiﬁcation of highly expressedV
HandV
Lgenes whose products are the most likely to be antigen speciﬁc.Vgenes appear-
ing at roughly the same frequency are reasoned to be expressed as a pair in the same plasma cell; these pairs are then synthe-
sized and expressed as antibody fragments inEscherichia colior as full-length immunoglobulin in mammalian cells. An anti-
body speciﬁc for the complement protein C1s isolated using this approach demonstrated subnanomolar binding afﬁnity and
functionality in ELISA and immunoprecipitation assays. Because this methodology relies on analysis of theVgene repertoire
from bone marrow plasma cells, which produce the most abundant type of circulating antibodies, the authors hypothesize
that this screening-free, rapid isolation approach could be used to generate therapeutic antibodies. In addition, this approach
can be extended to other B cell populations and thus allow for the generation of antibodies that are tailored to an individual
patient’s immune system.
S.T. Reddy et al. (2010). Nature Biotechnology28, 965-969.
Megan Frisk
TheS. aureuscell wall is visu-
alized using a biosynthetically
incorporated small molecule
ﬂuorophore. Image courtesy
of D. Spiegel.
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.493

Leading Edge
Previews
ModelingRettSyndromewithStemCells
Ryan M. Walsh
1,2,3
and Konrad Hochedlinger
1,2,3,*
1
Howard Hughes Medical Institute at Massachusetts General Hospital, Center for Regenerative Medicine and Cancer Center, Boston,
MA 02114, USA
2
Harvard Stem Cell Institute, 42 Church Street, Cambridge, MA 02138, USA
3
Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University and Harvard Medical School, 7 Divinity Avenue, Cambridge,
MA 02138, USA
*Correspondence:[email protected]
DOI10.1016/j.cell.2010.10.037
The discovery that somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs)
raised the exciting possibility of modeling diseases with patient-speciﬁc cells.Marchetto et al.
(2010)now use iPSC technology to generate, characterize, and treat an in vitro model for the autism
spectrum disorder Rett syndrome.
Rett syndrome is a severe X-linked neuro-
developmental disorder that affects 1 in
10,000–20,000 girls worldwide, making it
one of the most common forms of mental
retardation in females (Percy and Lane,
2005). A seminal discovery by Huda
Zoghbi’s lab in 1999 identiﬁed a causative
link between mutations in the methyl-CpG
binding protein, MeCP2, and Rett syn-
drome (Amir et al., 1999), thus enabling
mechanistic studies and providing a target
for potential treatments. Importantly,
restoration of MeCP2 function in a mouse
model of the disease reverses the neuro-
logical symptoms in adult mice (Guy
et al., 2007), raising the possibility that
this disorder may be treatable in humans.
Despite this progress, it remains unclear
how loss of MeCP2 function leads to
neurological defects, and no effective
pharmacological treatments have yet
been developed. A main limitation for
human studies and thus drug develop-
ment has been the inaccessibility of live
neurons from human patients. To circum-
vent this shortcoming, Marchetto and
colleagues (Marchetto et al., 2010[this
issue ofCell]) use induced pluripotent
stem cells (iPSCs) to establish a human
cellular model for Rett syndrome that is
amenable to mechanistic studies and
drug screens.
To generate a human model of Rett
syndrome,Marchetto et al. (2010)isolate
ﬁbroblasts from four female Rett patients
and ﬁve healthy control individuals
and then reprogram these ﬁbroblasts
into iPSC lines (Figure 1). These cell
lines express the expected pluripotency
markers and give rise to cell types of all
germ layers in teratomas (solid tumors
derived from pluripotent cells), thus qual-
ifying these cell lines as bona ﬁde pluripo-
tent cells. Given that hallmarks of Rett
syndrome include changes in neuronal
density and in brain size, the authors ﬁrst
determine whether these phenotypes are
likely due to the abnormal proliferation
of neural progenitor cells derived from
iPSCs. Notably, they observe no overt
defects in the cell cycle of neural progen-
itor cells, consistent with the notion that
Rett is a disease of mature neurons.
In contrast to neural progenitor cells,
mature neurons derived from Rett iPSCs
do show defects in structure and function
when compared to neurons obtained from
control iPSCs or embryonic stem cells
(ESCs). For example, the authors detect
a signiﬁcant reduction in the number
of synapses in glutamatergic neurons
derived from Rett iPSCs when compared
to neurons derived from either control
iPSCs or ESCs. This reduction is likely
the direct consequence of losing MeCP2
function, given that reducing the expres-
sion ofMeCP2in control ESCs produces
a similar defect whereas the reintroduc-
tion of wild-type MeCP2 into mutant cells
rescues the phenotype.
The authors further conﬁrm MeCP2’s
role in regulating synapse formation by
showing that overexpression ofMeCP2
in control iPSCs leads to an increase in
glutamatergic synapse numbers. These
results are in accordance with observa-
tions from mouse models in which the
loss or overexpression of MeCP2 leads
to a respective decrease or increase of
glutamatergic synapses (Chao et al.,
2007). In further agreement with research
performed with mouse cells (Chen et al.,
2001; Guy et al., 2001) and on human
autopsies, neurons derived from Rett
iPSCs are smaller in size and have fewer
dendritic spines when compared to
control iPSC and ESC neurons.
Importantly, neurons derived from Rett
iPSCs are also functionally impaired
when compared to neurons derived from
control iPSCs. Speciﬁcally, neurons
derived from Rett iPSCs exhibit a reduc-
tion in the transient rise of intracellular
calcium levels typical of active synapses.
They also show a decrease in the
frequency and amplitude of spontaneous
excitatory and inhibitory postsynaptic
currents when compared to control cells.
Together, these ﬁndings provide compel-
ling evidence that molecular and func-
tional defects found in Rett syndrome
patients can be recapitulated in iPSC-
derived neurons.
Given the reversibility of the Rett
phenotype in mouse,Marchetto et al.
(2010)then ask whether they could rescue
their in vitro phenotype using candidate
drugs. First, they examine the effects of
insulin-like growth factor 1 (IGF1), which
had previously been shown to partially
rescue Rett symptoms inMecp2-deﬁ-
cient
mice (Tropea et al., 2009). Indeed,
treating neurons derived from human
Rett iPSCs with this growth factor
increases the number of glutamatergic
synapses.
Because the majority ofMeCP2muta-
tions create premature stop codons in
the gene (i.e., nonsense mutations), the
authors also test the effect of the drug
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.499

gentamicin, which facilitates ribosomal
readthrough of stop codons. Following
treatment with low doses of gentamicin,
Rett neurons harboring nonsense muta-
tions in theMeCP2gene express elevated
levels of MeCP2 protein and display
a striking increase of glutamatergic
synapses, reaching levels similar to those
seen in control neurons. Whether IGF1 or
gentamicin treatment leads to a functional
recovery of neurons, however, remains
unexplored in this study. In summary,
these results show that previously identi-
ﬁed drugs are effective on neurons
derived from Rett iPSCs and thus validate
the use of large-scale drug screens to
identify new and more effective com-
pounds that could ameliorate the symp-
toms of Rett.
Given the recent recognition that
mouse iPSCs can exhibit molecular and
functional differences compared with
mouse ESCs (Stadtfeld and Hochedlin-
ger, 2010), it will be important to ensure
that any cell culture disease model is an
accurate representation of its in vivo
counterpart rather than an artifact of the
reprogramming procedure. In that regard,
data presented by Marchetto and
colleagues for their Rett syndrome model
agree well with what is known from mouse
models of Rett syndrome and post-
mortem analyses in humans. However,
the observation by the authors that differ-
entiated neurons derived from Rett iPSCs
exhibit a severe skewing of X chromo-
some inactivation—meaning that one
copy of the X chromosome is more likely
to undergo inactivation than the other—
remains unexplained. This observation is
of particular relevance becauseMeCP2
is an X-linked gene and patients’ cells
in vivo are mosaic for theMeCP2mutation
due to random X chromosome inactiva-
tion. One possible explanation for the
skewing of X inactivation in vitro is that
the previously inactive X chromosome in
Rett ﬁbroblasts does not fully reactivate
in iPSCs and remains inactive in iPSC-
derived neurons. Indeed, a recent study
on skewed X chromosome inactivation in
human iPSCs by Kathrin Plath’s lab is
consistent with this interpretation (Tchieu
et al., 2010). If the skewing reﬂects incom-
plete reactivation, then the studies per-
formed by Marchetto and colleagues
likely relied exclusively on iPSC clones
derived from Rett ﬁbroblasts that had
inactivated the wild-typeMeCP2allele.
Thus, to harness the power of cell culture
disease models, future work will need to
further explore the differences between
iPSCs and ESCs.
The ability to produce disease-speciﬁc
differentiated cells is one of the major
promises of iPSC technology because it
holds the potential for disease modeling,
drug development, and ultimately cell
therapy. The model of Rett syndrome pre-
sented by Marchetto and colleagues is
not only an additional proof of principle
that human iPSCs may be useful in drug
development but also a promising oppor-
tunity to gain insights into the pathology of
Rett syndrome in live human neurons.
ACKNOWLEDGMENTS
K.H. is an advisor for iPierian, Inc.
REFERENCES
Amir, R.E., Van den Veyver, I.B., Wan, M., Tran,
C.Q., Francke, U., and Zoghbi, H.Y. (1999). Nat.
Genet.23, 185–188.
Chen, R.Z., Akbarian, S., Tudor, M., and Jaenisch,
R. (2001). Nat. Genet.27, 327–331.
Chao, H., Zoghbi, H.Y., and Rosenmund, C. (2007).
Neuron56, 58–65.
Guy, J., Hendrich, B., Holmes, M., Martin, J.E., and
Bird, A. (2001). Nat. Genet.27, 322–326.
Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., and Bird, A.
(2007). Science315, 1143–1147.
Marchetto, M.C.N., Carromeu, C., Acab, A.,
Yu, D., Yeo, G., Yangling, M., Chen, G., Gage,
F.H., and Muotri, A.R. (2010). Cell143, this issue,
527–539.
Percy, A.K., and Lane, J.B. (2005). J. Child Neurol.
20, 718–721.
Stadtfeld, M., and Hochedlinger, K. (2010). Genes
Dev.24, 2239–2263.
Tchieu, J., Kuoy, E., Chin, M.H., Trinh, H., Patter-
son, M., Sherman, S.P., Aimiuwu, O., Lindgren,
A., Hakimian, S., Zack, J.A., et al. (2010). Cell
Stem Cell7, 329–342.
Tropea, D., Giacometti, E., Wilson, N.R., Beard, C.,
McCurry, C., Fu, D.D., Flannery, R., Jaenisch, R.,
and Sur, M. (2009). Proc. Natl. Acad. Sci. USA
106, 2029–2034.
Figure 1. Using iPSCs to Model Rett Syndrome In Vitro
Mutations in themethyl-CpG binding protein (MeCP2)gene cause the neurodevelopmental disorder Rett
syndrome.Marchetto et al. (2010)isolate ﬁbroblasts from Rett patients withMeCP2mutations. They then
reprogram these cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by the exogenous expression of the tran-
scription factorsOct4,Sox2,Klf4, andc-Myc. These Rett iPSCs can then differentiate into neurons in vitro,
recapitulating several of the defects found in Rett syndrome patients and in animal models of the disease.
These defects can be partially reversed by candidate drugs, suggesting that this disease model will facil-
itate large-scale drug screens and future mechanistic studies of Rett syndrome.
500Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.

Leading Edge
Previews
TranslationbyRemoteControl
Pascal Preker
1,*and Torben Heick Jensen
1,*
1
Centre for mRNP Biogenesis and Metabolism, Department of Molecular Biology, C.F. Møllers Alle´3, Building 1130, Aarhus University,
8000 Aarhus, Denmark
*Correspondence:[email protected](P.P.),[email protected](T.H.J.)
DOI10.1016/j.cell.2010.10.039
Efﬁcient and accurate gene expression requires the coordination of multiple steps along the
pathway of mRNA and protein synthesis. Now,Harel-Sharvit et al. (2010)show that transcriptional
imprinting of mRNAs with two subunits of RNA polymerase II, Rbp4p and Rpb7p, guides transcripts
to the translation apparatus.
A deﬁning feature of eukaryotic cells is
compartmentalization. Whereas tran-
scription of DNA into mRNA takes place
in the nucleus, translation of the mRNA is
physically separate and occurs in the
cytoplasm, where ultimately the transcript
is also degraded. In prokaryotes, tran-
scription and translation are coupled in
the protoplasm so that the translation
machinery can directly engage the
nascent mRNA. In this issue ofCell,
Harel-Sharvit et al. (2010)provide sur-
prising evidence that transcription and
translation can also be coupled in eukary-
otes—at least in the unicellular yeast
Saccharomyces cerevisiae. The authors
refer to this process as the ‘‘remote
controlling’’ of translation by the transcrip-
tion apparatus. Key to this coupling is
a heterodimer composed of the Rpb4p
and Rpb7p proteins (for review see,
Choder, 2004; Sampath and Sadhale,
2005), a fraction of which forms a stalk-
like and highly conserved protrusion of
the decameric core of RNA polymerase II
(RNAPII), the enzyme responsible for the
production of mRNAs and many noncod-
ing RNAs (Figure 1, inset). This places
the two proteins at a strategic position
near the exit channel of the nascent RNA
(Brueckner et al., 2009), and the hetero-
dimer has been found to associate both
in vivo and in vitro with mRNA in a
transcription-dependent manner (Goler-
Baron et al., 2008; Ujva´ri and Luse, 2006).
Rpb4/7p is only loosely associated with
the RNAPII core, and the degree of its
association varies with physiological
conditions in yeast (Choder, 2004; Sam-
path and Sadhale, 2005). In addition, the
two proteins are in vast excess over other
RNAPII subunits and continuously shuttle
between the nucleus and the cytoplasm
(Figure 1). Indeed, prior work has revealed
a cytoplasmic function for Rpb4/7p in
mRNA decay (for example,Goler-Baron
et al., 2008). Presumably, the proteins
inﬂuence the reversible transition of
mRNA between the active translation
machinery in the form of polysomes and
the so-called processing (P) bodies,
which are believed to be storage sites
for RNAs and their degradation factors.
The present study now demonstrates
that Rpb4/7p also functions in translation,
thus making it a ‘‘coordinator’’ of all major
stages of gene expression.
Using a variety of methods, Harel-
Sharvit et al. ﬁrst show that Rpb4/7p inter-
acts, independent of RNA, with two
subunits (Nip1p and Hcr1p) of the hex-
americ translation initiation factor eIF3,
which serves as a platform for the
assembly of the translation-initiation
complex (Sonenberg and Hinnebusch,
2009). Importantly, eIF3 does not interact
with other RNAPII subunits, implying that
it contacts the soluble pool of Rpb4/7p.
Prompted by these observations, the
authors go on to show that Rpb4/7p is
required for efﬁcient translation initiation
by analyzing a deletion mutant of the
nonessentialRPB4gene (rpb4D) and
a conditional mutant allele of the essential
RPB7gene (rpb7-26). Importantly, the
latter mutation does not markedly affect
transcription or mRNA degradation rates
(Goler-Baron et al., 2008), thus minimizing
the possibility of indirect effects.
They ﬁnd that theRPB4andRPB7
mutant strains are hypersensitive to
translation inhibitors and observe genetic
interactions with regulators of translation.
In addition, the two mutants exhibit
reduced protein synthesis accompanied
by a reduction in polysome content, as
well as loss ofMFA2andHYP2mRNA
from polysomes. They also elicit de-
creased disassembly of P bodies and
slower movement ofMFA2mRNA from
P
bodies into polysomes. This last ﬁnding
is important because mRNAs can also
leave P bodies and (re)associate with
polysomes (Figure 1;Parker and Sheth,
2007). Thus, in addition to directly dock-
ing mRNAs to the translation apparatus
through eIF3, Rpb4/7p might facilitate
translation initiation indirectly by stimu-
lating P body disassembly and/or the
release of mRNA from P bodies, thereby
increasing the pool of translatable mRNA.
Perhaps the most signiﬁcant result of
this work is the ﬁnding that mutations in
two RNAPII subunits (Rpb1p and Rpb6p)
at the interface with Rpb7p, which have
been previously shown to compromise
the recruitment of the Rpb4/7p subcom-
plex to the catalytic core, phenocopy the
defects displayed by theRPB4and
RPB7mutant strains. Similar results are
obtained using a mutation of Rpb4p that
fails to enter the nucleus. Taken together,
these ﬁndings suggest a model whereby
nucleocytoplasmic shuttling and recruit-
ment of Rpb4/7p to the nascent transcript
by the core RNAPII is required for Rpb4/
7p’s cytoplasmic functions (Figure 1).
The physical separation of transcription
and translation has allowed the spread
of intervening sequences (introns) in
the eukaryotic lineage, which in turn is
thought to have fueled genomic evolution
by aiding in the creation of new protein
domains (Schmidt and Davies, 2007).
It now appears that eukaryotes, despite
this segregation of the two main activities
of the central dogma in molecular biology,
have maintained a mechanism that
allows transcription and translation to
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.501

communicate through direct
physical interactions. Apart
from simply making transla-
tion more streamlined and
efﬁcient, what could be the
functional implication(s) of
such a coupling? Earlier ﬁnd-
ings suggested that, in yeast
only,20% of RNAPII mole-
cules contain Rpb4/7p under
optimal growth conditions,
whereas, during stationary
phase, all subunits are stoi-
chiometric (Choder, 2004).
Even though genome-wide
analysis of Rpb7p occupancy
has contradicted these re-
sults (Jasiak et al., 2008), it
would appear that any differ-
ence in the stoichiometry of
Rpb4/7p could have bearing
on the translational efﬁciency
of certain mRNAs under
different environmental con-
ditions. This effect could be
further ﬁne-tuned by the
impact of Rpb4/7p on degra-
dation (Figure 1;Goler-Baron
et al., 2008). The identiﬁca-
tion of the subsets of genes
associated with Rpb4/7p
under various conditions and
an understanding of the
mechanistic details that regu-
late the RNAPII-Rpb4/7p in-
teraction would be required
to foster this attractive hypo-
thesis. Transcription-coupled
imprinting of mRNAs with
the Rpb4/7p subcomplex of
RNAPII in the nucleus could
potentially also serve as
a form of quality control, possibly by
ensuring that only mRNAs that have
been properly terminated and loaded
with Rpb4/7p are translated.
Paralogs of Rpb4/7p can also be found in
the RNA polymerases I and III, raising the
possibility that they might utilize analogous
mechanisms to control RNA metabolism.
Finally, the extent to which
coupling of transcription and
translation by Rpb4/7p is
conserved in higher eukary-
otes remains to be seen. The
high degree of conservation
of the heterodimer and its
interaction partners make it
plausible that whatever the
precise mechanism, it may
have coevolved—all the way
to humans.
REFERENCES
Brueckner, F., Armache, K.J.,
Cheung, A., Damsma, G.E., Ketten-
berger, H., Lehmann, E., Sydow, J.,
and Cramer, P. (2009). Acta Crystal-
logr. D Biol. Crystallogr.65, 112–
120.
Choder, M. (2004). Trends Bio-
chem. Sci.29, 674–681.
Goler-Baron, V., Selitrennik, M.,
Barkai, O., Haimovich, G., Lotan,
R., and Choder, M. (2008). Genes
Dev.22, 2022–2027.
Harel-Sharvit, L., Eldad, N., Haimo-
vich, G., Barkai, O., Dueck, L., and
Choder, M. (2010). Cell143, this
issue, 552–563.
Jasiak, A.J., Hartmann, H., Karaka-
sili, E., Kalocsay, M., Flatley, A.,
Kremmer, E., Stra¨sser, K., Martin,
D.E., So¨ding, J., and Cramer, P.
(2008). J. Biol. Chem.283, 26423–
26427.
Parker, R., and Sheth, U. (2007).
Mol. Cell25, 635–646.
Sampath, V., and Sadhale, P.
(2005). IUBMB Life57, 93–102.
Schmidt, E.E., and Davies, C.J.
(2007). Bioessays29, 262–270.
Sonenberg, N., and Hinnebusch, A.G. (2009). Cell
136, 731–745.
Ujva´ri, A., and Luse, D.S. (2006). Nat. Struct. Mol.
Biol.13, 49–54.
Figure 1. Rpb4/Rpb7p in Transcription, Translation, and Degrada-
tion
The inset (bottom left) represents the relevant interactions of RNA polymerase
II (RNAPII) subunits: Rpb7p forms a heterodimer with Rpb4p and interacts with
the catalytic core through Rpb1p and Rpb6p. The remaining eight subunits
(gray) are placed arbitrarily. In the nucleus, Rpb4/7p is loaded cotranscription-
ally onto the nascent RNA. The mature mRNA carrying a 5
0
cap and a 3
0
poly(A)
tail is exported into the cytoplasm in complex with Rpb4/7p, which targets the
mRNA to the general translation initiation factor eIF3. The latter provides a scaf-
fold for the assembly of other initiation factors, which together recruit ribo-
somes. Translation initiation is further facilitated by interaction between the
initiation complex and the poly(A) tail (not shown). Rpb4/7p and mRNA can
also associate with processing (P) bodies or can return to polysomes. Muta-
tions in theRPB4andRPB7genes both adversely affect the assembly of
mRNA into polysomes and its transition between P bodies and polysomes.
In addition, the mRNA can also be destined for degradation at various stages.
Re-import into the nucleus completes the ‘‘shuttling’’ of Rpb4/7p.
502Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.

Leading Edge
Previews
ShiningaLighton
GerminalCenterBCells
Jason G. Cyster
1,*
1
Howard Hughes Medical Institute and Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, CA 94143, USA
*Correspondence:[email protected]
DOI10.1016/j.cell.2010.10.036
The mechanisms of B cell selection in lymphoid tissues are poorly understood. In this issue,Victora
et al. (2010)use imaging of photoactivatable green ﬂuorescent protein to deﬁne the movements of
B cells in germinal centers and provide evidence that antibody afﬁnity maturation is driven by
competition for T cell help.
Since the discovery in the 1960s that anti-
bodies undergo afﬁnity maturation as
the immune response progresses, immu-
nologists have been fascinated by the
underlying mechanism, which is still only
partially understood. Victora et al. now
reveal the multi-day dynamics of B cell
migration at sites of antibody afﬁnity
maturation and use this insight to further
deﬁne the selection mechanism. Their
efforts also mark a major technical
advance for the study of cell behavior in
a physiological context.
Germinal centers of lymph nodes are
a site of antibody afﬁnity maturation.
They are seeded by small numbers of
rapidly dividing antigen-responding B
cells and form over a period of days into
structures of10,000 cells (MacLennan,
1994). Germinal centers contain a dark
zone and a light zone (named based on-
histological staining); the former contains
mostly B cells, whereas the latter also
contains a small number of helper T cells
and follicular dendritic cells. An early
model posited that the dark zone is the
site of B cell proliferation and somatic
hypermutation of the immunoglobulinV
(variable)gene, and that the light zone
is where the newly mutated B cell
receptors (BCRs) compete for antigen
binding. B cell clones that have a strong
enough BCR signal would then receive
T cell help and survive. It was further
proposed that germinal center B cells
move cyclically between the dark and
light zones to undergo repeated rounds
of mutation and selection, with successful
selection eventually giving rise to plasma
cells and memory B cells (MacLennan,
1994).
Prior imaging studies established that
germinal center B cells migrate in a
continuous manner over the processes
of antigen-bearing follicular dendritic cells
(Allen et al., 2007b; Hauser et al., 2007;
Schwickert et al., 2007). Small numbers
of B cells have been observed moving
bidirectionally between the light and
dark zones, though in these cases the
30–60 min imaging windows were insufﬁ-
cient to determine whether there is a
directional bias (Allen et al., 2007b;
Hauser et al., 2007; Schwickert et al.,
2007). Imaging cell interaction dynamics
further reveals that only a fraction of the
germinal center T cells are in stable
contact with B cells, despite most B and
T cells being speciﬁc for the same antigen
(Allen et al., 2007b). These observations
led to a revised model of afﬁnity matura-
tion in which B cells are selected not
only based on receipt of a BCR signal,
but also on their ability to compete for
T cell help (Allen et al., 2007a).
In the current work,Victora et al. (2010)
obtain gene expression data for cells from
the light and dark zones. To do this they
photoactivate GFP in speciﬁc regions of
the germinal centers using two-photon
microscopy and then immediately isolate
the cells by ﬂow cytometry (Figure 1A).
Although cells from the two regions are
similar in their overall pattern of gene
expression, consistent with previous
studies (reviewed inAllen et al., 2007a),
dark zone cells exhibit higher expression
of genes related to mitosis, whereas light
zone cells have higher expression of acti-
vation markers, cell-surface molecules,
and apoptosis regulators. The small mag-
nitude of these gene expression differ-
ences might reﬂect heterogeneity within
the cell populations. Indeed, previous
ﬁndings indicate that a minority of light
zone cells exhibit plasma cell properties
and nuclear localization of the transcrip-
tion factor NF-kB(Allen et al., 2007a;
Basso et al., 2004).
Victora et al. take advantage of differ-
ences in the expression of cell-surface
markers (speciﬁcally CD83, CD86, and
the chemokine receptor CXCR4) to
convincingly identify dark and light zone
cells by ﬂow cytometry. The authors ﬁnd
that both zones have cells in S phase, in
agreement with other studies (Allen et al.,
2007a), whereas almost all G2/M phase
cells are restricted to the dark zone.
Although this is consistent with long-held
views,
other studies have identiﬁed occa-
sional cells undergoing mitosis in the light
zone (Allen et al., 2007a). It is notable
that the immunization strategy employed
by Victora et al. to induce germinal
center formation avoids use of adjuvant.
Perhaps the level of innate immune stimuli
accounts for these potential differences
in the behavior of light zone cells.
A major achievement of the photoacti-
vation analysis by Victora et al. is the
tracking of cell population behavior over
many hours. They show that dark zone
cells move to the light zone at a rate that
replaces much of this compartment in
6 hr; movement from the light zone to
the dark zone also occurs but is less
prominent. These compelling data pro-
vide quantitative insight into the net ﬂux
of cells between zones and suggest that
movement from the light zone to the
dark zone is possible only for a selected
subset of cells.
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.503

To test the model that germinal center B
cells compete for T cell help, the authors
use an approach to modulate the
amount of peptide bound-major histo-
compatibiltiy complex II (MHC II) on B
cells. In previous work, Nussenzweig,
Steinman, and coworkers demonstrated
that DEC205 antibody-antigen conju-
gates efﬁciently target antigens to
dendritic cells for presentation to T cells.
Conveniently, Victora et al. ﬁnd that
germinal center B cells also express
DEC205, and they show that the same
antigen-loading ‘‘trick’’ works to increase
peptide-MHC II abundance within 6 hr
on wild-type germinal center B cells (Vic-
tora et al., 2010). When immunized mice
harboring a mixture of wild-type and
DEC205-deﬁcient B cells are treated
with DEC205 antibody coupled to the
relevant T cell antigen, there is an early
accumulation of DEC205-positive B cells
in the light zone (at 12 hr) followed by
a remarkable enrichment in the dark
zone by 36–48 hr. The authors note that
the DEC205-negative majority is counter-
selected by focusing T cell help on a
small subset of DEC205-positive cells,
concluding that T cell help is limiting for
clonal expansion (Figure 1B). Although
the cell frequency data are clear, the
conclusion that cells with high amounts
of peptide-MHC II complexes displace
cells with less will be made still stronger
when effects on absolute cell number
are determined. Strikingly, the cells
loaded with antigen via DEC205 fail to
undergo afﬁnity maturation, suggesting
that when cells are equivalent in their
ability to receive T cell help, differential
BCR engagement is not sufﬁcient to
mediate afﬁnity-based selection (Victora
et al., 2010).
The new ﬁndings, combined with the
large body of prior information, support
a model in which light zone cells gather
antigen via their BCRs as they move
over the network of follicular dendritic
cells, with cells that have higher afﬁnity
acquiring greater amounts of antigen per
unit time. Higher antigen uptake via the
BCR then leads to greater presentation
of peptide-MHC II complexes (Batista
and Neuberger, 1998). T cells are thought
to reorient toward cells with the highest
peptide-MHC II levels (Depoil et al.,
2005), forming stable conjugates with
the cells that have captured and pro-
cessed the most antigen, and delivering
CD40 ligand and cytokine signals essen-
tial for selection (Figure 1B).
By turning on a light in germinal center
B cells, Victora and colleagues open
a new chapter in the study of antibody
afﬁnity maturation. Of course, many ques-
tions remain. Do B cells with high afﬁnity
display greater amounts of peptide-
MHC II complexes than low-afﬁnity cells?
How do T cells behave as they encounter
B cells displaying different amounts of
peptide-MHC II complexes? And how do
T cells assist in the decision of a B cell
Figure 1. Germinal Center Dynamics
(A) Transgenic B cells expressing photoactivatible-green ﬂuorescent protein (GFP) are transferred to wild-type hosts in which germinal centers are subsequently
induced by immunization. GFP is selectively photoactivated in the dark zone (left) or light zone (right) by two-photon laser scanning microscopy. The entire lymph
node is then converted to a cell suspension, and GFP-expressing cells are isolated by ﬂow cytometry. Alternatively, the lymph node is examined at 1 hr intervals to
record the movements of photoactivated B cells.
(B) Increased peptide loading onto major histocompatibility complex II (MHC II) is sufﬁcient to give B cells a competitive advantage. A mouse containing a mixture
of wild-type and DEC205-deﬁcient B cells is immunized with antigen. After the germinal center has formed, the mouse is treated with DEC205 antibody coupled to
antigen. The diagram shows a wild-type and DEC205-deﬁcient B cell binding the same amount of antigen in the light zone via their B cell receptors (BCRs), but the
wild-type cell also acquires antigen via DEC205, thus taking up more antigen and generating a greater number of MHC II peptide complexes compared to the
DEC205-deﬁcient cell. As a result it receives a greater level of survival and proliferation signals from helper T cells.
504Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.

to differentiate into an antibody-secreting
cell or return to the dark zone? In addition
to providing a platform for addressing
these questions, the powerful application
of photoactivatable-GFP in this study
should spur broader use of this tech-
nology to relate cell location with gene
expression and cell fate.
ACKNOWLEDGMENTS
The author thanks C. Allen and O. Bannard for
helpful discussions.
REFERENCES
Allen, C.D., Okada, T., and Cyster, J.G. (2007a).
Immunity27, 190–202.
Allen, C.D., Okada, T., Tang, H.L., and Cyster, J.G.
(2007b). Science315, 528–531.
Basso, K., Klein, U., Niu, H., Stolovitzky, G.A., Tu,
Y., Califano, A., Cattoretti, G., and Dalla-Favera,
R. (2004). Blood104, 4088–4096.
Batista, F.D., and Neuberger, M.S. (1998). Immu-
nity8, 751–759.
Depoil, D., Zaru, R., Guiraud, M., Chauveau, A.,
Harriague, J., Bismuth, G., Utzny, C., Muller, S.,
and Valitutti, S. (2005). Immunity22, 185–194.
Hauser, A.E., Junt, T., Mempel, T.R., Sneddon,
M.W., Kleinstein, S.H., Henrickson, S.E., von An-
drian, U.H., Shlomchik, M.J., and Haberman,
A.M. (2007). Immunity26, 655–667.
MacLennan, I.C.M. (1994). Annu. Rev. Immunol.
12, 117–139.
Schwickert, T.A., Lindquist, R.L., Shakhar, G.,
Livshits, G., Skokos, D., Kosco-Vilbois, M.H.,
Dustin, M.L., and Nussenzweig, M.C. (2007).
Nature446, 83–87.
Victora, G.D., Schwickert, T.A., Fooksman, D.R.,
Kamphorst, A.O., Meyer-Hermann, M., Dustin,
M.L., and Nussenzweig, M.C. (2010). Cell143,
this issue, 592–605.
AStraightjacketforPain?
Simon Beggs
1
and Michael W. Salter
1,*
1
Program in Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 555 University Avenue, Toronto, ON M5G 1X8, Canada
*Correspondence:[email protected]
DOI10.1016/j.cell.2010.10.038
Perception of pain involves both the peripheral and central nervous systems. Starting with a whole-
genome RNA interference screen inDrosophila,Neely et al. (2010)identify a mammalian gene that is
required not only for efﬁcient transfer of pain signals between brain centers, but also for the
suppression of inappropriate signaling between other sensory systems.
Even though humanity’s attempts to
control pain can be traced back through
the millennia, much of our current arsenal
of therapies still has its roots in folk
remedies. Originally derived from natural
plant products such as willow bark and
poppies, these medicines have been the
mainstay of chronic pain control for
many years. Unfortunately, even modern
therapies for chronic pain are too often
ineffective, leaving untold numbers of indi-
viduals suffering worldwide. As we move
into the postgenomic era, hopes have
been raised that the problem of pain will
be solved, largely by getting to grips with
the underlying genetic, molecular, and
cellular mechanisms involved in nocicep-
tion. It is also expected that interindividual
variability in pain experience, a major
issue confounding effective treatment,
will be accounted for in some part by vari-
ations in a deﬁnable subset of genes.
The report byNeely et al. (2010)in this
issue ofCellrepresents a major advance
in the search for the genes and mecha-
nisms of pain and variability in its
perception. In an impressively multifac-
eted study that extends from fruit ﬂies to
mice and ultimately to humans, the
authors have uncovered a new molecular
player,a2d3, in pain. Along the way, they
also made some highly unexpected
observations indicating thata2d3 is not
only involved in pain, but also plays
a role in the poorly understood mecha-
nisms that separate one form of sensory
information from another.
The fruit ﬂy provides an ideal model
for unraveling genetic aspects of human
disease, with advantages including a
short generation time and the capacity
to analyze extremely large numbers of
animals in a high-throughput manner.
Genome-wide RNA interference (RNAi)
screens are a powerful investigative tool
given the ﬂy’s relatively small (15,000
genes) but extremely well-annotated
genome and sufﬁcient homology with
the human genome to permit the identiﬁ-
cation of conserved pathways in ﬂies
and humans.
In a Herculean undertaking, Neely et al.
take advantage of the Vienna global
DrosophilaRNAi library (Dietzl et al.,
2007) to individually knock down almost
every gene in the ﬂy genome, speciﬁcally
in neural tissues. Each line was then
painstakingly tested using a behavioral
assay to measure sensitivity to noxious
heat. In total, 580 genes are identiﬁed
that potentially regulate thermal nocicep-
tion and possibly basic neuronal function.
One of the genes identiﬁed isstraight-
jacket, which is one of severala2dgenes
that encode calcium channel subunits.
The mammalian homolog ofstraightjacket
isCACNAD2D3, which encodes thea2d3
subunit. Of interest, a close relative of this
protein,a2d1, is the molecular target for
the analgesics gabapentin and pregabalin
(Field et al., 2006). To further investigate
the function ofa2d3, the authors
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.505

generated a knockout
mouse. Intriguingly, its
expression in the mouse is
entirely restricted to the brain,
being completely absent from
the spinal cord and dorsal
root ganglia. This suggests
that, unlike the function of
Straightjacket in ﬂies,
mammaliana2d3 likely medi-
ates the last leg of the noci-
ceptive relay, the transmis-
sion of the signal from the
thalamus up to the highest
level, the cortex.
To test the relevance of
their ﬁndings in humans,
Neely et al. identify and
screen four single-nucleotide
polymorphisms (SNPs) in the
humanCACNA2D3 gene.
One of these, rs6777055, is
signiﬁcantly associated with
reduced thermal sensitivity.
In these experiments, the
volunteers are given a series
of short pulses of painful heat.
Although the temperature of the pulses
remains the same, most people tend to
perceive the stimulus as becoming
progressively more painful. In a small
number of subjects, however, this does
not occur, and it is these individuals that
are found to express the rs6777055 minor
allele of theCACNA2D3gene.
Surprising similarities emerge between
thea2d3 knockout mouse and humans
with SNPs that interfere witha2d3 func-
tion. For both, it appears that acute pain
sensitivity is reduced (although spinal
reﬂex-mediated events such as tail ﬂick
remain normal, in line with the absence
ofa2d3 expression in peripheral and
spinal sensory circuitry in the mouse).
Furthermore, both thermal hypersensi-
tivity following inﬂammation in mice and
perception of chronic back pain in
humans appear to involvea2d3; patients
expressing the rs6777055 SNP report
reduced pain 1 year after corrective
surgery compared to non-SNP patients.
In addition to the remarkable insight
into pain processing that these studies
reveal, a fascinating and unexpected
phenomenon emerges from their studies
using functional magnetic resonance
imaging (fMRI) of thea2d3-deﬁcient
mice. Noxious thermal stimulation nor-
mally activates a characteristic set of
brain structures associated with pain per-
ception. Known as the pain matrix, this
center includes the thalamus and somato-
sensory cortex. In thea2d3 mutant
mouse, activation of the pain matrix is
markedly diminished, with the fMRI signal
seemingly unable to spread from the thal-
amus to higher cortical regions. There-
fore, it appears that, in mammals,a2d3
is necessary not for the detection of
noxious heat but for the transmission of
thermal nociceptive signals to higher
areas of the central nervous system, in
particular those associated with the pro-
cessing of pain signals.
However, this is not the only ﬁnding of
the fMRI study. When looking at total acti-
vation in the brain, the authors ﬁnd no
difference between control anda2d3-
deﬁcient mice. This at ﬁrst seems coun-
terintuitive, given the large reduction in
fMRI signal from thalamocortical projec-
tions in the mutant mouse. Upon closer
investigation, it becomes evident that
other entirely unrelated brain regions are
instead being activated, including visual,
auditory, and olfactory regions (Figure 1).
Even
more remarkably, when another
sensory modality, tactile stimulation of
the vibrissae, is tested, not only does the
MRI signal in the
primary cortical area (the
barrel ﬁelds of the somato-
sensory cortex) remain
unchanged in mutant
compared to wild-type mice,
but cross-activation to other
sensory brain regions is also
observed. It therefore
appears that mice lacking
a2d3 develop a form of
synesthesia, a condition
whereby stimulation of one
sensory pathway elicits
perception in one or more
other sensory modalities.
Although transmission of
thermal nociception is dimin-
ished, other sensory systems
tested, such as touch, remain
unaffected.
The study by Neely et al.
offers a compelling insight
into nociceptive transmission
in higher areas of the central
nervous system. In doing so,
it also raises many questions
for future investigation. On a molecular
level,a2d3 is known to regulate calcium
channel expression and its targeting to
presynaptic sites (Dolphin, 2009). A
recent report suggests thata2d3 can be
GPI anchored to the membrane and that
this modiﬁcation is necessary fora2d3-
mediated enhancement of calcium
currents (Davies et al., 2010; Bauer
et al., 2010). Evidence is also now
emerging that, inDrosophila,a2d3is
required for synaptic morphogenesis
(Kurshan et al., 2009). Of interest, how-
ever, this function appears to be indepen-
dent of its role in regulating voltage-
gated calcium channels. In light of
this multifunctionality, the question arises
as to what exactly is deﬁcient in the
a2d3-deﬁcient mice. In particular, the
synaptic consequences of eliminating
a2d3 throughout mouse development
remain unknown.
Given the close relationship between
a2d3 anda2d1, it would also be of great
interest to test what happens toa2d3
expression after peripheral nerve injury,
asa2d1 is upregulated in the somatosen-
sory system after nerve injury, concurrent
with the onset of behavioral pain hyper-
sensitivity. Furthermore, although the
human studies presented indicate that
Figure 1. Sounds, Sights, and Smells of Pain
In the mouse brain, nociceptive signals are relayed from the thalamus to the
somatosensory and motor regions of the cortex. Visualized by functional
magnetic resonance imaging (fMRI), mice lacking the gene encodinga2d3
display a signiﬁcant reduction in activation of these regions, consistent with
reduced perception of a painful thermal stimulus. Surprisingly, however, other
regions of the cortex, including those involved in olfaction, vision, and hearing,
are activated by the same stimulus.
506Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.

chronic pain states may indeed be medi-
ated by the action ofa2d3, it remains to
be seen whether this can be modeled in
mice. Finally, the cross-sensory activation
ina2d3-deﬁcient mice raises the question
as to whether synesthesia in humans is in
any way related toa2d3 polymorphisms.
Despite considerable research and
major mechanistic breakthroughs in
recent years, pain remains the most
common cause of disability and impaired
quality of life and, as such, represents
an enormous socioeconomic problem.
The identiﬁcation ofa2d3 as a player in
the mechanisms of pain and a molecule
accounting for a portion of interindividual
pain variability opens up new possibilities
for rationally designed and individualized
pain therapies. The biggest challenge
now is to ﬁnd safe and effective ways to
use this discovery to truly put a straight-
jacket on pain.
REFERENCES
Bauer, C.S., Tran-Van-Minh, A., Kadurin, I., and
Dolphin, A.C. (2010). Curr. Opin. Neurobiol.20,
563–571.
Davies, A., Kadurin, I., Alvarez-Laviada, A., Doug-
las, L., Nieto-Rostro, M., Bauer, C.S., Pratt, W.S.,
and Dolphin, A.C. (2010). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA107, 1654–1659.
Dietzl, G., Chen, D., Schnorrer, F., Su, K.C.,
Barinova, Y., Fellner, M., Gasser, B., Kinsey, K.,
Oppel, S., Scheiblauer, S., et al. (2007). Nature
448, 151–156.
Dolphin, A.C. (2009). Curr. Opin. Neurobiol.19,
237–244.
Field, M.J., Cox, P.J., Stott, E., Melrose, H., Offord,
J., Su, T.Z., Bramwell, S., Corradini, L., England,
S., Winks, J., et al. (2006). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA103, 17537–17542.
Kurshan, P.T., Oztan, A., and Schwarz, T.L. (2009).
Nat. Neurosci.12, 1415–1423.
Neely, G.G., Hess, A., Costigan, M., Keene, A.C.,
Goulas, S., Langeslag, M., Grifﬁn, R.S., Belfer, I.,
Dai, F., Smith, S., et al. (2010). Cell143, this issue,
628–638.
Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.507

Leading Edge
Review
PluripotencyandCellularReprogramming:
Facts,Hypotheses,UnresolvedIssues
Jacob H. Hanna,
1,3,*Krishanu Saha,
1
and Rudolf Jaenisch
1,2,*
1
The Whitehead Institute for Biomedical Research
2
Department of Biology
Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02142, USA
3
Present address: Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, Rehovot 76100, Israel
*Correspondence:[email protected](J.H.H.),[email protected](R.J.)
DOI10.1016/j.cell.2010.10.008
Direct reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells by ectopic expression of
deﬁned transcription factors has raised fundamental questions regarding the epigenetic stability of
the differentiated cell state. In addition, evidence has accumulated that distinct states of pluripo-
tency can interconvert through the modulation of both cell-intrinsic and exogenous factors. To fully
realize the potential of in vitro reprogrammed cells, we need to understand the molecular and epige-
netic determinants that convert one cell type into another. Here we review recent advances in this
rapidly moving ﬁeld and emphasize unresolved and controversial questions.
Introduction
Epigenetic changes, such as modiﬁcations to DNA and histones,
alter gene expression patterns and regulate cell identity
(Goldberg et al., 2007). Global epigenetic states must be tightly
regulated during development to allow for the proper transitions
between cellular states. However, cell fates during development
are neither restrictive nor irreversible. The generation of animals
by the nuclear transplantation of somatic nuclei into eggs
(Gurdon, 1962) demonstrated that indeed the epigenome of
differentiated cells can be reset to a pluripotent state.
Derived from cells at various embryonic and postnatal stages,
stem cells are characterized by self-renewal and the capacity
for differentiation (Jaenisch and Young, 2008). Pluripotent
cells have the ability to form all somatic lineages, and the ﬁrst
pluripotent cells were derived from a type of germline tumor,
called teratocarcinoma. When explanted in tissue culture, the
teratocarcinoma cells generated embryonal carcinoma cells,
demonstrating that cancer cells can be reprogrammed to
pluripotent cells (Hogan, 1976). The next breakthrough in the
ﬁeld came when researchers isolated embryonic stem cells
(ESCs) from normal mouse embryos, creating a platform for
the genetic engineering of animals (Evans and Kaufman, 1981).
The generation of ESCs from human embryos came less than
a decade later (Thomson et al., 1998), and this technology,
combined with the direct reprogramming of somatic cells to
pluripotent cells (Takahashi and Yamanaka, 2006), is now paving
the way for ‘‘personalized’’ regenerative medicine (Hanna et al.,
2007).
This Review focuses on mechanisms that control the transition
of cells between different states of pluripotency and differentia-
tion. We will emphasize new concepts and unresolved questions
in mammalian systems while concentrating on three aspects of
epigenetic reprogramming: (1) the molecular deﬁnition of
different pluripotent states and strategies to convert one cell
state into another; (2) molecular concepts of somatic cell reprog-
ramming to pluripotency; and (3) direct transdifferentiation
between somatic cell states.
Distinct Pluripotent Cells Derived during Development
Development proceeds from a state of totipotency, characteristic
of the zygote and blastomeres during the early cleavage of the
embryo, to cells that are restricted in their potential for develop-
ment. It is from these later stages that pluripotent cells can be
derived. At the 16-cell stage, the outer cells of the mouse embryo
are allocated to two lineages: the trophoblast lineage, which will
form part of the placenta; and the bipotential inner cell mass,
which generates the epiblast and the hyphoblast. The epiblast
and hyphoblast will form the embryo and the yolk sac, respec-
tively. Cells of the epiblast lineage are termed pluripotent because
they are the origin of all somatic cells and germline cells of the
developing embryo. Primordial germ cells emerge at gastrulation
and, in male embryos, give rise to spermatogonial stem cells.
Pluripotent cells have been derived from all of these cell types
by explanting the cells from embryos at different stages of
development (Figure 1). As outlined below, the state of the donor
cells, as well as the culture conditions, have a profound effect on
the characteristics of the derived cells. We focus on pluripotent
cells that have unrestricted developmental potential and thus
can give rise to all cell types in the developing embryo or in the
culture dish.
A. Embryonic Stem Cells
ESCs were the ﬁrst pluripotent cells isolated from normal
embryos. They were created by explanting the inner cell mass
of the embryos from a strain of mice called ‘‘129’’ (Evans and
Kaufman, 1981). Mouse ESCs recapitulate full developmental
potential when injected into mouse blastocysts, contributing
cells to the three germ layers and to the germline of chimeric
animals. Consistent with their origin from the inner cell mass,
ESCs express key pluripotency genes, such asOct4,Sox2,
508Cell143, November 12, 2010ª2010 Elsevier Inc.

Other documents randomly have
different content

VII.
Toinen.
Ankerschmidt'in komea, uusi kastelli, joka oli renaissancen malliin
rakennettu, teki, ettei maantieltä ollenkaan nähnyt tuota vanhaa
rakennusta, jota Adam Garanvölgyi semmoisella itsepintaisuudella ei
tahtonut antaa kenenkään muun omistettavaksi. Vasta kun oli
kartanon ympäri kiertänyt, näki tämän muinais-jäännöksen keskellä
vanhoja kastanja-puita, joitten latvat olivat kallistuneet toinen
toisensa puoleen, ikäänkuin olisivat ottaneet vanhaa asuntoa
myrskyiltä suojellaksensa. Yhtäläistä ystävällisyyttä osotti
rappeutuneille tiiliseinille vihriäinen muratti, jonka köynnökset olivat
akkunain välitse suikerrelleet kattoon asti, kun sen sijaan sen varret
alhaalta olivat pörheät kuin peuran jalka.
Huoneen ympäristöä puitten juureen asti peitti kaunis nurmi ja
siihen saakka ulottui Garanvölgyin alue; tästä ulospäin oli maa
sannoitettu ja se oli jo ritari Ankerschmidt'in. Tämä olikin väli-aidalla
eroittanut vieraan omaisuuden, jottei kukaan vaunuilla tahi ratsain
tuleva voisi erhettyä.

Vanhan kastellin ympärillä saattoi siis ruoho keväästä syksyyn asti
kasvaa niin korkeaksi kuin tahtoi; sitä ei niitetty eikä tallattu maahan.
Mutta neljä kertaa kunakin vuonna, tarkoin määrätyillä väli-ajoilla,
oli Kampós herran tapa tulla sinne avainkimppu kädessä. Hän avasi
silloin ovet, tuuletti suojat ja toimitti siellä, tiesi mitä; puolen tunnin
tarkastuksen jälkeen lukitsi hän taas perästään kaikki ja meni pois.
Että tämä säännöllinen ilmestyminen kunakin vuosineljänneksenä
tuossa vanhassa kastellissa olisi jäänyt huomaamatta Straff'ilta, jota
nyt jo nimitämme hänen oikealla nimellänsä, on tuskin luultavaa.
Straff oli todellakin jäänyt ritarin perheesen, pianonsoiton-
opettajan virkaa toimittaen. Niinkuin tiedämme, osasi hän varsin
hyvästi soittaa pianoa ja puolalaisen emigrantin rôlia näytellä, joksi
lopulta Ankerschmidt itsekin häntä luuli.
Eräänä semmoisena neljännespäivänä Straff, aavistaen Kampós
herran tuloa, hiipi hänen jäljissänsä. ja kun tämä oli sulkenut
perästään huoneen oven, kätkeysi hän erään vanhan seljapensaan
suojaan ja kurkisti sieltä akkunasta siihen huoneesen, johon oli
kuullut toisen menevän.
Huoneesen tultuansa katseli Kampós herra ympärilleen,
peittäisivätkö kartiinit hyvästi akkunoita. Hän ei huomannut, että
yhdestä akkunasta oli lyijy-juotos ulos murrettu ja että joku siitä
sisään pistetyllä seljapensaan oksalla saattoi nostaa kartiinia sen
verran ylös, että reiästä taisi nähdä, mitä huoneessa-olija teki.
Kampós herra oli puettu pitkähiaiseen nuttuun, joka oli varsin
omansa milloin peittämään milloin näyttämään esineitä, niinkuin
silmänkääntäjän japonitsa.

Yht'äkkiä näkyi nyt hänen kädessään pieni, neliöjalan kokoinen
lipas. Mistä hän sen esiin otti, sitä ei voinut hyvästi huomata. Lipas
oli ebenholzista. Ainakin oli se musta, se on varmaa.
Kampós herra otti liivinsä taskusta pienen avaimen ja aukaisi sillä
lippaan. — Paha, että hän seisoi sillä tavoin, jotta lippaan avattu
kansi kokonansa esti näkemästä, mitä sen sisässä oli.
Mutta joku tärkeä esine siinä epäilemättä on, sillä Kampós katselee
kauan lippaasen, siksi kuin hänen silmänsä täyttyvät jollakin
kostealla aineella; hän pyhkii kädellään silmiänsä ja pudistaen sitte
nyrkkejään, tekee hirveitä, uhkaavia liikuntoja ilmassa.
Ja mitä hän lisäksi tekee?
Hän vetää esiin papereita takin-taskustaan ja panee ne lippaasen.
Kovin epäilyttävä sorminta!
Sen jälkeen sytyttää hän kynttilän, etsii lakkaa, vetää sormestaan
sinetti-sormuksen ja lukitsee sinetillä lippaan kiinni.
Suurimmassa määrässä epäilyttävä toimitus!
Sitten ottaa hän taas lippaan käteensä, kääntyy ympäri ja menee
vihdoin ulos huoneesta. Laskiko hän lippaan jonnekunne vai ottiko
hän sen mukaansa? Tuon rikoksessa osallisen nutun tähden sitä ei
voinut havaita. Se vaan on varmaa, että kun hän taas tuli ulos
linnasta, näytti siltä, kuin hän ei mitään myötänsä veisi.
"Corpus delicti" siis epäilemättä oli jäänyt tänne "loco."

Tämä on oleva monessa suhteessa kallisarvoinen saalis. Sellaisista
ilmi-annoista saattavat "komitentit" paljon maksaa.
Kirje kirjoitetaan kiireesti herra Bräuhäusel'ille, tilataan
ylimääräinen posti, käsketään joutua.
Joutuisuutta ei saatakaan valittaa.
Kaksi tuntia puoli-yön jälkeen saapuu suurimmassa hiljaisuudessa
herra Bräuhäusel sihteerinsä, kirjurinsa, komisarjuksensa ja näitä
vastaavan aseellisen apujoukon seurassa, josta yksi osa heti asettuu
vanhan kastellin ulostultavia vartioimaan, kun sen sijaan toinen osa
ynnä viranomaisten kanssa lähtee pää-kapinoitsijaa Kampós'ia kiinni
ottamaan.
Hänen onnistui estää kaikki paon yrityksetkin. Kampós herra oli jo
täysissä vaatteissa ja hankki juuri talleja päin menemään.
— "Seis!" huusi hänelle Bräuhäusel; "mihin matka?"
— "Talliin", vastasi Kampós herra viattomasti.
— "Mitä sieltä sydänyönä etsitte?"
— "Minä olen huoneenhaltia. 'Oculus domini saginat boves'
(isännän silmä lihoittaa karjaa), tietänette. Mutta nyt ei enään ole
yö, sillä aamu jo koittaa."
— "Mikä aamu? Kello kolme keski-yön jälkeen."
— "Sehän juuri on aamulla. Talonpojilla se on byroosen-menon
tunti."

— "Ei mitään viisastelemista! Te tulette kanssamme. Ottakaa
mukaanne aution kastellin avaimet. Herra Mikucsek[47] kahden
miehen kanssa seuraa teitä."
Herra Mikucsek oli laiha, pitkäkaulainen mies; hänen sääriensä
ympäri liehui ahdas, nuuskan-värinen talvilevätti, jolla hänen olisi
ollut kovasti vilu, jos ei iso, kirjava villahuivi olisi häntä suojellut;
vaan tuskin hän nytkään aamukylmältä sai suutansa suljetuksi.
— "No, tulkaa vaan perässäni, amice!" viittasi hänelle Kampós
herra, jolla oli herkeämätön halu juuri sillä hetkellä sytyttää
piippuansa ja sitä varten tuluksilla tulta iskeä, joll'aikaa nuot
kunnioitetut herrat seisokoot pakkasessa.
Herra Mikucsek oli kuitenkin kaikkialla hänen kintereissään.
Käsilyhdyn avulla löydettiin avainkimppu ja sitte lähti koko
vartiojoukko liikkeelle kastellia kohti: edellä herra Bräuhäusel, välissä
Kampós herra vilusta vapisevan Mikucsek'in kanssa sekä perässä ja
ylt'ympäri aseellisia santarmeja.
Kastellille tultua käskettiin virallisesti Kampós herran viipymättä
avata lukitut ovet.
Kampós herra totteli asianomaisten käskyä.
— "Kaksi miestä jää ovelle, eikä saa laskea ketään sisään eikä
ulos!" komensi herra Bräuhäusel. "Eteenpäin, te avainten kanssa!"
Kampós herralle ei kukaan sanonut, mitä haettiin, eikä hän
myöskään kysynyt, mitä tahdottiin löytää.
Sen jälkeen alotettiin varsinainen katsastus.

Ensiksi käytiin lattianpartten kimppuun. Ne nostettiin ylös pitkin
seiniä, suurella taitavuudella, ja niitten kätköjä tutkittiin huolellisesti.
Salaisia hiiren-läpiä ja rotan-sokkeloita tuli lyhdyn valossa ilmi;
niitten pelästyneet asukkaat juoksivat tiehensä tutkijain jalkojen
välitse, eivätkä osottaneet mitään halua kuulusteltaviksi pysähtyä;
tuolla nurkassa tuli näkyviin maailmasta pois vetäyneen, yksinäisen
sirkan pesä, täynnä rikki jyrsittyjä olkia, niinkuin myös satajalkaisen
hedelmämadon ja harmaan kellarisiiran lukuisat sikiöt. Mutta paitsi
näitä, ei mitään salaista keksitty.
Nyt tuli uunien vuoro.
Tässä oli herra Mikucsek oikein omilla elämillänsä ja hän ryhtyi
heti työhön. Suurena käytöllisenä älykkönä hän hyvin tiesi, että
uunien, savupiippujen ja kaminien koloissa löytyy oivallisia
kätköpaikkoja. Nami revittiin sentähden yksitellen irti; niitten
kappaleet tutkittiin; pariin uurnan-muotoiseen koristukseen, joitten
suu oli liian ahdas, lyötiin vielä läpikin kylkeen. Näissä ei kuitenkaan
missään ollut mitäkään, se on, niissä oli hirveän paljon nokea, josta
herra Mikucsek ennen pitkää tuli varsinaisen nokikolarin muotoiseksi.
Paljon puhtaampaa työtä oli jo marmori-levyjen kiskominen
käytävistä; sitä saattoi tehdä kuokalla eikä siinä käsiänsä liiaksi
tahrannut.
Ei sieltäkään mitään löydetty. Herra sihteerin täytyi vääntää kiinni
läkkitolpponsa kansi ja pistää taskuunsa protokolla ilman
minkäänkaltaisia muistoon pantavia tietoja, sill'aikaa kuin herra
Bräuhäusel omassa personassaan näytti lyhtyä kaikkialle, jottei
mitään salakuljetusta voisi tapahtua.

Nyt astuttiin alas kellariin. Muutamia tyhjiä tynnyreitä venyi siellä
vielä lahonneilla aluspuilla; näitten pohjat avattiin ja sisällys
havaittiin viran puolesta sangen ummehtuneeksi ja paitsi sitä
kokonansa tyhjäksi.
Mutta herra Mikucsek on käytöllinen mies. Kellareita ei saa tuolla
tavoin tutkia. Hänen käskystänsä täytettiin yksi tyhjä tynnyri vedellä;
sitte se vieritettiin alas, pohja lyötiin ulos ja tynnyri käännettiin ylös
alaisin, jotta vesi yhtä haavaa joka taholle juoksisi. Tämä tehtiin sitä
varten, että jos johonkin paikkaan kellarissa jotakin olisi alas
kaivettu, se paikka pikemmin imisi veden sisäänsä, kuin muu kovaksi
tallattu maapohja, ja siten ilmaisisi kätköpaikan.
Tutkimuskunta nousi siksi aikaa aluspuille seisomaan, jottei vesi
ehkä pääsisi juoksemaan heidän saapasvarsiinsa.
Kampós herra, kahden miehen välissä vartioituna, katseli vaan
hymyhuulin tätä viekasta toimitusta.
Silloin rupesi yht'äkkiä vesi juoksemaan juuri siihen paikkaan,
jossa
Kampós herra seisoi, ja selvästi syvenemään kuoppaan väleen
katoomaan.
— "Tuossa on! siinä se on!" huusi yhtähaavaa kolme miestä ja
herra Mikucsek teki innoissaan semmoisen poukauksen, että vaipui
nilkkaluuhun asti rapakkoon. "Pois siitä! Lapiot tänne!"
Tämä "pois siitä" oli nähtävästi lausuttu Kampós herralle, joka oli
saattanut itsensä suuressa määrässä epäluulon-alaiseksi sen kautta,
että seisoi juuri tuon vaarallisen paikan päällä, ikäänkuin olisi
tahtonut sitä ruumiillaan peittää.

— "Lapiot tänne!" Aluspuut nostettiin syrjälle ja ruvettiin kiireesti
kaivamaan.
Herra Mikucsek kiversi ylös housunsa, voidaksensa seisoa
likempänä.
Jotakin kilahti.
— "Ahaa! Tässä on jotain!" Kampós herra itsekin oli utelias
tietämään, mitä siihen lienee maahan kaivettuna.
— "Hiljaa vaan, täytyy tarkasti tutkia. Varovasti!" Herra Mikucsek
kaivoi käsillään vetelää multaa kuopasta. Vihdoin joutui hänen
käteensä jotakin; hän veti sen esiin. Mikä se oli? Tyhjä pullo. Siinä ei
ollut mitään. Syvemmäksi! Taas tyhjä pullo. Vieläkin yksi. Ja vielä
lisäksi noin viisitoista pulloa, kaikenmuotoisia: pienempiä,
suurempia; puolenmittaisia, kokomittaisia; sinisen-, vihriän-,
keltaisen-värisiä; tokaji-, ménesi-, sampanjapulloja; mutta kaikki
toinen toisensa laatuiset siinä, ettei niistä saattanut mitään sisällystä
löytää.
Tutkija-herrat katselivat ällistyneinä toisiinsa. "Mitä tämä
merkitsee?"
Kampós herra oli vaan ääneti. Häneltä ei mitään kysytty. Eikä hän
mitään virkkanut. Mutta hänen muistui kohta mieleensä, että
kunnioitetulla herralla kerta oli ollut juoppo heitukka, joka sitte
pantiinkin pois palveluksesta. Hänen aikanansa katosi kellarista
paljon semmoisia viinipulloja, joita Adam herra piti varalla vaan
rakkaimpia vieraitansa varten. Varmaankin oli tuo heittiö ollut se,
joka oli käyttänyt kellarin hiljaisuutta pulloja tyhjentääksensä ja sitte
haudannut nämät mykät rikoksensa todistajat aluspuitten alle. Mutta
ei kukaan Kampós herralta tätä kysynyt, ja hän katseli sentähden

levollisesti, kuinka tutkija-herrat asianomaisella uutteruudella tyhjän
tynnyrin pohjalla kirjoittivat protokollaan, että eräästä kovin
epäiltävästä maan-alaisesta kuopasta oli löydetty tavattoman
salainen kokoelma lasipulloja, yhteensä seitsemäntoista kappaletta,
joilla varmaankin lienee yhteyttä vasta ilmi saatavain asiain kanssa.
Sen jälkeen pantiin pullot viralliseen sinettiin.
Sill'aikaa oli jo aamu ruvennut koittamaan, Kun oli tullut
valoisampi, sopi nyt mennä ullakkoa tarkastamaan. Täällä eneni
herra Mikucsek'in vaiva yölepakkojen kautta, jotka eivät ensinkään
tahtoneet hänen virallista lähetystänsä hyväksyä, vaan kaikista
nurkista ja komeroista lensivät häntä vasten silmiä ja, jos hän pisti
kätensä johonkin koloon, purivat häntä sormiin.
Tämä ikivanha ullakko oli kuitenkin erittäin ihana paikka jokaiselle
tutkimuskunnalle, siinä kun oli ristin rastin asetettuja palkkeja ja
orsia, joitten päälle sopi kiivetä; kapeita ruode-aitauksia, joitten
taakse vaan vatsallansa saattoi ryömiä; rappeutuneita palomuureja,
joitten ontelot olivat ikäänkuin varta vasten tehdyt piilopaikoiksi
salaliittolaisille ja tornihaukan-munille; vanhoja huonekalujen
jäännöksiä, joita koppiaiset olivat puhki nakertaneet. Jokaisen katto-
akkunan eteen oli rakennettu pieni oltava, joka oli erikseen
nuuskittava. Eräästä ilmaluukusta pääsi katolle, josta sopi kurkistaa
sisään korsteineihin, eikö etsittyä esinettä sieltä löydettäisi. Jopa
herra Mikucsek kiitosta ansaitsevassa virka-innossaan, kun hän
eräässä paikassa huomasi kaminin savupiipun, sidotti köyden
uumillensa ja antoi laskea itsensä alas siihen. Sieltä hän tuli takaisin
kasvot täynnä hämähäkinverkkoja, niinkuin toinen Niklas Klimius
maan-alaiselta matkaltaan, Kampós herran äärettömäksi
huvitukseksi.

Mitään positivista resultatia ei ullakosta kuitenkaan lähtenyt.
Sieltä mentiin takaisin huoneisin. Täällä veti huomiota puoleensa
eräs maalattu pakkalaatikko, joka oli parras-tasan täytetty vanhoilla
papereilla. Olipa niitä siinä vähintäänkin kolme sentneriä.
— "Mitä papereita nämät ovat?" kysäisi kauhistuneena takaisin
kavahtaen Bräuhäusel Kampós'ilta.
Kampós herrassa oli niin paljon häijyyttä, että hän vaan kohautti
olkapäitään ja vastasi: "Sitä en tosiaankaan tiedä; tehkää hyvin ja
katsastakaa."
Vietävän työ! Mutta jospa juuri tässä olisi, mitä etsitään?
Muikistellen ryhtyivät tutkijat työhön ja alkoivat avata kellastuneita
paperikimppuja sekä tarkastaa kirjoituksia, yhtä toisensa perästä,
eikö tämä olisi se, joka oli löydettävä. Mutta sitä ei löydetty. Kaikki
tiesivät kertoa parin kolmen sadan vuotisista asioista ja olivat
semmoisten ihmisten allekirjoittamia, jotka jo aikoja sitten olivat
tomuksi muuttuneet, ja semmoisella läkillä, joka jo oli aivan
punoittunut.
Tämä oli hirmuisen ikävää työtä.
Soitettiin juuri päivälliselle, kun viides osa tuosta riivatusta
aarteesta oli katsastettu.
Herra Bräuhäusel oli jo valmistaunut suomaan sen armon, että jos
Kampós herra pyytäisi päästä ruoalle, hän kovin vastenmielisesti
sallisi sitä, sillä ehdolla, että vartiat seuraavat häntä kotia; siksi aikaa
lukittaisiin ovet ja he itsekin menisivät kastelliin aterioimaan. Mutta
tuo käytöllinen Kampós teki tämän aikomuksen tykkänään tyhjäksi

sen kautta, että hän, kuultuansa päivälliskellon soivan, istui
akkunanlaudalle ja otti takkinsa taskusta rasvaisen paperimytyn,
josta hän veti esiin ison kappaleen leipää ja sianlihaa, siten osottaen,
että hän arvattavasti oli aikonut lähteä tanyoille,[48] jossa
tarkoituksessa hän oli varustanut itseään muonalla; tämän söi hän
nyt aivan levollisesti nälkäisen ja janoisen tutkimuskunnan nähden,
saapasvarresta esiin vedetyn saranaveitsen avulla.
Viimeisen palasen nieltyänsä, pisti Kampós herra aivan tyvenesti
veitsen takaisin saapasvarteen ja otti sitte toisesta taskusta pienen
olkipaitaisen pullon, josta joi aika kulauksen. Puhdistettuaan itsensä
leivänmuruista, pisti hän sievästi kädet taskuun ja rupesi taas
katselemaan, kuinka he tutkivat yhtä dokumentia toisensa perästä,
nuot suuresti kunnioitetut herrat.
Tämä häijy levollisuus rupesi herra Bräuhäusel'in harmiksi
pistämään. Se olikin aivan luonnollista. Kun keskellä nälkäistä,
häärivää, hikoilevaa ihmisjoukkoa näkee tuommoisen, joka vaan
katselemistaan katselee ja lisäksi syö, kysymättä edes, minkätähden
näin puuhataan ja mitä oikeastaan tahdotaan löytää, taikka
sanomatta: "eikö teille pidä pieni naukku tätä luumuviinaa?"
— "Täytyy kääntää ylös alaisin koko laatikko, siten löydämme sen
helpommin!" ärjyi kiukusta tulipunaisena herra Bräuhäusel, hyvin
käsittäen, että jos näin lehti lehdeltä papereita tutkitaan, vasta
myöhään päähän päästään. Muutamat miehet tarttuivatkin heti
kistuun kiinni, koko tuota vanhaa arkistoa lattialle tyhjentääksensä.
Kampós herra, tämän vaarallisen aikomuksen havaittuansa, tiesi
heti, mikä siitä olisi suorana seurauksena, ja nosti äkisti ylös
akkunanlaudalle jalkansa, jotka siihen asti olivat roikkuneet alaspäin.

Ettei tämä varokeino ollut tarpeeton, todisti kohta seuraava
silmänräpäys.
Samalla hetkellä näet, kun tuon suuren laatikon sisällys paiskattiin
tiililattialle, karkasi legio nuorempia ja vanhempia rotanperheitä,
jotka jo vuosia sitten olivat tämän paikan haltuunsa ottaneet ja
siihen täydellisesti majoittuneet, kotirauhansa väkivaltaisesta
häiritsemisestä pelästyneinä, hirveällä kirkunalla esiin lattialle,
sikiökin hyökäten sekä elottomien että elollisten esineitten päälle,
huolimatta siitä, rynnättiinkö pöydänjalkaa vaiko ihmisjalkaa,
huonekaluja vaiko housuja vastaan. Syntyipä siinä nyt kammottava
tappelu ja rähinä; saappaankorkot, tuolinjalat, pyssyntukit tömisivät,
paukkuivat, ryskivät, rotat kiljuivat, ihmiset kiroilivat. Ulkona seisovat
vartiat luulivat, että joku ryövärijoukko oli sisällä-olijain niskoissa, ja
riensivät heidän avuksensa. Avatusta ovesta pakeni nyt voitettu
rottajoukko ulos, jättäen taistelukentälle kaatuneet ja haavoitetut
sekä pelastaen itsensä kaikenlaisiin koloihin ulkona.
Meidän puolella ei tapahtunut muuta vahinkoa, kuin että herra
Mikucsek'in vasempi silmä sai jostakin pystytukista semmoisen
kolahuksen takaa päin, että hänen kasvonsa kohta ajettuivat. Täytyi
heti nenäliinalla sitoa silmä, ja nyt saattoi hän vaan yhdellä silmällä
katsastusta jatkaa.
Kampós herraa tämä huvitus niin suuresti miellytti tuolla kun hän
sitä katseli turvallisesta logistaan, että hän nyt jo ilmoitti
kunnioitetuille herroille, jotta täällä vielä löytyy kauhea sälyhuone,
jota hän itsekin vaan rohkeina hetkinä uskalsi lähestyä; siellä vasta
jotakin olisi!
Herra Bräuhäusel katsoi epäilevällä silmäyksellä ehdoituksen-
tekijään. Hän ei saattanut ymmärtää, että vaarassa olevaa miestä

näin totisissa oloissa haluttaisi mitään leikkiä laskea. Päin vastoin
käsitti hän ehdoituksen niin, että se oli yritys saada tutkimuskunnan
huomiota toisaalle käännetyksi; sitä jo sentähden ei saa hyväksyä.
Varmaankin olemme nyt lähellä piilopaikkaa, ja hän tahtoo sen
vuoksi viedä meitä harhateille; täytyy siis olla varoillansa, kovasti
varoillansa.
Lattialle kaadetuista papereista saattoi kuitenkin nähdä, ettei
niissä ollut mitään epäilyttävää.
— "Soh! Nyt tiedän", huusi äkisti herra Bräuhäusel, lyöden
ystäväänsä Mikucsek'ia olalle, niinkuin se, jonka aivoihin valaiseva
ajatus yht'äkkiä on iskenyt. "Menkäämme takaisin ensimmäiseen
huoneesen; pehtoria saattakoon kaksi miestä. Lähtään
ensimmäiseen huoneesen!"
Pitäen vasenta kättään takkinsa liepeen alla ja oikealla keppiä
heiluttaen, hyökkäsi nyt herra Bräuhäusel muitten etupäässä
uudestaan siihen huoneesen, josta lattianparret olivat irti kiskotut.
Siinä seisoi keskellä huonetta vanha kirjoituspöytä, jolla oli
semmoinen kummallinen edes takaisin vedettävä kansi, kuin
kiinalainen akkunan-varjostin. Se oli tehty pienistä säleistä, jotka
kokoon vedettäissä katosivat jostakin rei'ästä pöydän sisään.
Herra Bräuhäusel kokosi ympärilleen miehensä, riemulla
seisahtuen pöydän viereen, josta jo kaikki laatikot olivat pois otetut.
— "Näettekö tätä pöytää?" sanoi hän, herra Mikucsek'iin päin
kääntyen.

— "Näen kyllä", vastasi tämä, toista silmää räpyttäen. Toisella hän
ei voinut nähdä, sillä se oli sidottu.
— "Olemmehan sen jo katsastaneet?"
— "Emmekä siitä mitään löytäneet."
— "Eikö mitään?"
— "Ei mitään."
— "Ei edes mitään aihetta epäluuloon?"
— "Ei sitäkään."
— "Mikucsek, Mikucsek! Te olette kokenut mies, mutta saattepa
nähdä, että vanha kettu näkee vieläkin kauemmaksi. Katsokaa
tänne!"
Herra Mikucsek osotti kuuliaisuutta siinä määrässä, että hän otti
nenäliinan pois silmältä, paremmin nähdäksensä.
— "Näettekö tätä sälekantta? Nyt se on pöydän päällä."
— "Niin on."
— "Nyt se taas on kokoon vedettynä."
— "Onpa niin."
— "Mihin joutui siis kansi?"
Herra Mikucsek tarkasti pöytää ulkoa ja sisältä päin, kyykistyipä
vielä sen allekin, mutta ei edes siellä mitään nähnyt.

— "Se katosi johonkin lautojen väliin."
— "Aivan oikein, se katosi johonkin lautojen väliin. Tässä pöydässä
on siis kätköpaikka, johon kansi voipi kadota. Mihin kansi voi kadota,
sinne muutakin voi kadota."
— "Se on toden totta!" huudahti herra Mikucsek kunnioittavalla
kummastuksella päällikkönsä kekseliäisyydestä.
— "Meidän täytyy tästä pöydästä irroittaa takalauta", sanoi herra
Bräuhäusel, kutakin sanaa lausuessaan nyrkkiänsä pöytään lyöden,
ikäänkuin tahdissa.
Kun Kampós herra näki, että nyt heti yritettiin rikkomaan tuota
kunnioitettavaa vanhaa huonekalua, ei hän enää voinut hillitä
itseänsä kysymästä:
— "Ettekö, kunnioitetut herrat, voisi sanoa, mitä te oikeastaan
tahdotte löytää täältä?"
Havaitessaan, ettei uhri enää voinut päästä hänen kynsistään,
vaan oli pakoitettu antaumaan, tarttui herra Bräuhäusel Kampós
herran takkiin ja tiuskasi hänelle:
— "Tuota ebenholzi-lipasta, johon teidän on tapa kirjeitä kätkeä."
— "No, hyvät herrat, seisoohan se tässä silmienne edessä, vaikkei
se osaa puhua."
Etsitty lipas oli todellakin kirjoituspöytään kiinnitetyllä hyllyllä,
kahden vanhan, koiran-nahkaan sidotun "corpus juris"-nidoksen
väliin pistettynä; siitä ei kukaan ollut sitä etsinyt.

Herra Bräuhäusel'in nenä piteni silmin-nähtävästi tästä löydöstä.
He olivat kello kolmesta aamulla kello kolmeen jälkeen puolenpäivän
taivaasta ja maan päältä etsiskelleet jotakin, joka julkisesti oli
asetettu esiin pöydälle.
Inhimillistä erhetystään peittääksensä, ärjäsi hän äkkiä
Kampós'ille:
— "Mitä tässä laatikossa on?"
— "Tehkää hyvin ja katsokaa! Tässä on avain."
— "Minkätähden on tämä lipas sinetillä kiinni pantu?" kysyi
ankaralla silmän-mulkauksella herra Bräuhäusel.
— "Sentähden, ettei kukaan siihen panisi mitään, jota en itse
sinne ole pannut."
— "Mitä lipas sisältää?"
— "Senpätähden se on herran kädessä; katsokaa itse!"
— "Kenen omistama on se? Miksi on se tänne kätketty? Mikä
salaisuus siinä piilee?"
— "Suokaa anteeksi, kunnioitettu herra! Nämät ovat semmoisia
kysymyksiä, joihin minä, jos niiksi tulee, vastaan oikeuden edessä;
mutta nyt ja tässä minä en mene sitä näin monen töllistelevän
ihmisen nenään sitomaan."
— "Vai niin? Te ette tahdo sanoa sitä. Vahdinpäällikkö! Tämä
ihminen on tästä hetkestä alkaen vankina."

Kampós herra ei siitä tippaakaan pelästynyt. Kun ala-upseeri astui
hänen viereensä, veti Kampós herra, niinkuin se, joka paraiten
tuntee säännöt, esiin ainoan aseensa, saapasvarteen pistetyn
Fehérvár'in[49] saranaveitsensä ja antoi sen järkähtämättömällä
levollisuudella ja rohkeudella sille, joka oli hänet vankeuteen vievä,
lausuen:
— "Ottakaa pois!"
Sen kautta, että hän vapaa-ehtoisesti antoi pois sarana-veitsensä,
osotti hän aivan luotettavasti, ettei hänen ollut aikomus itseänsä
puolustaa.
— "Te viette tämän miehen kaupunkiin ja panette hänet siellä
vartioittavaksi."
— "Minulla on aikaa; te laskette minut kyllä taas irti", sanoi
lempeällä ynseydellä Kampós herra, "Lähdemmekö jalkaisin vai
käsketäänkö valjastaa?"
Herra Bräuhäusel'in kielellä pyöri jo tuo kostonhimoinen määräys,
että niskoittelija olisi jalkaisin vietävä; mutta samassa juohtui hänen
mieleensä, että viejät häntä siitä huvituksesta eivät kiittäisi.
Sentähden antoi hän Kampós herralle luvan lähettää käskyn
palkollisten tupaan, että kuski hevosilla ja kalesilla tulkoon paikalle.
Muistutettuansa sen jälkeen vahdinpäällikköä, että hän koko
omaisuudellansa on edesvastauksessa tästä miehestä, otti hän
lippaan kainaloonsa ja olisi mennyt pois, jos ei Kampós herra siivolla
vastaväitteellä vielä kerran olisi häntä seisahtumaan saattanut.
— "Te olette siis niin armollinen, että vangitsette minut sen
tähden, mitä tuossa lippaassa on?"

— "No, entäs sitte?"
— "Vaan jos tuossa lippaassa ei olisi mitään?"
— "Ei mitään?"
— "Sentähden annoin teille avaimen, jotta sen avaisitte; ja jos
herra nyt vie tämän lippaan avaamatta kotia, minä viedään
oikeuteen, lipas siellä avataan ja havaitaan tykkänään tyhjäksi,
saavat herrat vielä nähdä, minkä suuren melun minä siellä nostan!"
— "No, mitä ajattelette?"
— "Sitä ajattelen, että herrat ensin katsastakoot, onko laatikossa
mitään, jota suurella voitonriemulla saattaisitte viedä pois, vaiko ei;
sillä tuommoisia laatikoita voipi sorvarilta Pest'issä saada paljon,
enkä minä luule, että te vaan paljaan puun tähden olette itsenne
tänne vaivanneet."
Tämä on varmaankin totta.
Sinetti murrettiin siis rikki, lukko avattiin ja laatikon kansi nostettiin
auki, kaikki viran puolesta.
Silloin nähtiin siinä nuoren husarin muotokuva, laatikon kanteen
kiinnitettynä, ja itse laatikosta löydettiin noin parikymmentä kirjettä.
— "Kenen kuva tämä on?" kysyi herra Bräuhäusel.
— "Se on Aladár Garanvölgyin, Adam Garanvölgyin ottopojan ja
sukulaisen."
— "Ja mitä kirjeitä nämät ovat?"

— "Ne ovat nuoren Aladár herran kirjeitä, joita hän kunakin
vuosineljänneksenä kirjoittaa Adam herralle Kufstein'ista, jossa hän
on valtiovankina. Kirjeitten kuverteista saatatte nähdä, että ne
kaikenlaisten tarkastusten lävitse ovat tänne saapuneet. Ensiksi luki
ne Kufstein'in linnanpäällikkö; sitte lähetettiin ne Wien'iin yli-
polisivirastolle; siellä niitä kritillisesti ja kemiallisesti tutkittiin, eikö
niissä löytyisi mitään salaisia viittauksia, mitään salaista merkki-
kirjoitusta taikka näkymättömällä läkillä piirrettyjä rivejä. Jos ei
mitään sellaisia löydetty, lähetettiin kirjeet taas takaisin Kufstein'iin;
sieltä pantiin ne menemään Unkarin polisi-ylijohtokunnalle, joka
vihdoin toimitti ne herra Adamille. Kaiken tämän saattaa nähdä
kirjeisin pannuista sineteistä ja todistuksista."
Herra Bräuhäusel ja tutkimuskunnan jäsenet eivät todellakaan
voineet kirjeistä löytää ainoatakaan kirjainta, joka olisi antanut
vähintäkään syytä epäluuloon.
— "Minkätähden siis tämä salaisuus? Miksi olette kätkeneet nämät
kirjeet tänne?"
Kampós herra kohautti olkapäitään, hymyillen.
— "Suvaitkaa katsoa, että nämät kirjeet ovat jollakin vieraalla
kielellä kirjoitetut; muulla tavoin ei ole käynyt laatuun. Mutta herrani
sanoi, ettei hän tuonmuotoisten puustavien kanssa makaa yhdessä
huoneessa: polttaa niitä hän ei kuitenkaan tahtonut, koska ne olivat
hänen sisarensa pojan kirjoittamia; sentähden käski hän minun viedä
ne jonnekin ulkopuolelle taloa. Joka kerta siis, kun olin selittänyt
hänelle jonkun tulleen kirjeen sisällyksen, sillä hän ei ottanut niitä
käteensä, toin sen heti tänne ja laskin laatikkoon. Minä ajattelin,
ettei se täällä kellekään haitaksi olisi."

Herra Bräuhäusel joutui tästä selityksestä aivan vimmattuun
raivoon.
Joka vaan kaukaakin on jotain kuullut tuon vankan kuruczin
uppiniskaisista oikuista, katsoo tätä selitystä suurimmassa määrässä
luonnolliseksi.
— "Kuulkaa, herra!" kiljaisi Bräuhäusel, nyt jo Kampós herraan
ankarasti kiukustuneena. "Jos herrat ovat narreja, älkää sentähden
pitäkö viranomaisiakin narreina! Minkätähden herrat tekevät
mysterejä tuommoisista joutavista asioista ja vaivaavat meitä tänne
ja antavat meidän pitää katsastusta aamusta iltaan, ilman ruoatta ja
juomatta? Tämä ei ole mikään leikin-asia. Tuommoiset hullutukset
eivät ole kaukana niistä pyrinnöistä, jotka tarkoittavat viranomaisten
ylenkatsomista ja heidän arvonsa alentamista. Sentähden varoitan
minä tämän kautta viran puolesta teitä yksivakaisesti, ettette
vastedes puutu mihinkään semmoiseen toimitukseen, joka voisi
häiritä hallinnon sääntöjä ja estää korkeinta valtion peri-aatetta,
kaikkien kansalaisten yhteistä myötävaikutusta järjestyksen ja
levollisuuden vahvistamiseksi, vastaan-seisomattomasti edistymästä;
ja jos tämän perästä te ja varsinkin te itse, ilman mitään tosi-
asiallisia ja käytöllisiä seurauksia, pyritte tyhjäksi tekemään teihin
ylhäältä päin kääntyvää ankaruutta, tehdään loppu teidän
itsetyisestä elämästänne; katsokaa tätä vallan ulosvuotamisen
kaksipuoliseksi tarkoitukseksi, joka toiselta puolen ilmestyy
pahanteon rankaisemisessa, toiselta katumuksen ja parannuksen
suhteen hyviä hedelmiä kantavassa armon-antamisessakin."
Tästä koreasta puheesta ymmärsi Kampós herra sen verran, että
hän kysyi:
— "Enkö siis enään ole vanki?"

Herra Bräuhäusel viittasi äänettömällä, armollisella liikunnolla, että
hän nyt on vapaa.
— "Olen siis vapaa kaikesta kanteesta?"
Herra Mikucsek pisti kovin suuttuneena protokollan kainaloonsa.
Maksoi mar tämänkin tähden vaivan saada kumauksen silmäänsä!
Kun herrat jo olivat menossa, huusi Kampós herra heidän
jälestänsä:
— "Minä pyydän, hyvät herrat, vielä yksi sana!"
— "No, mitä tahdotte?"
— "Te näette, että minä jo olen vaarasta päässyt; lipas on
kädessäni; en ole minkään kanteen alaisena; minun ei tarvitse
mistään huolia. No, tietäkää siis nyt, että tässä lippaassa on jotakin,
jota ette vielä ole nähneet."
Samassa painoi hän erästä nastaa laatikon kannessa, josta kuvan
poslini-levy äkkiä aukesi, ja sen takana nähtiin muutamia ohuita,
tiheään kirjoitettuja paperinlehtiä.
Herra Mikucsek otti taas suurella ilolla esiin protokollan. "Mitä
nämät ovat?"
— "Mitä? Ymmärtääkö kukaan täällä unkarin kieltä? Eikö? Sitä
parempi. Nyt minua siis kuitenkin täytyy saattaa kaupunkiin, sillä
täällä minä en sano, minä näissä kirjeissä on. Minä tahdon, että
kaikkein ylhäisimmät herrat saavat siitä tiedon. Missä vältvääpeli on?
Ystäväni, tässä ovat vaunut, onko teillä käsirautoja? Sitokaa minut
pian, sitte lähtekäämme!"

Kampós herran annettiin tietää, ettei häntä nyt juuri rautoihin
panna, mutta hän älköön myöskään karatko. Hän taas pyysi
armollisia herroja asettamaan kaakelit paikalleen uuniin, sitte hyvästi
kaikki lukitsemaan ja avaimet avaimen-vartialle antamaan; jonka
jälkeen hän otti saattajansa viereensä vaunuihin ja lähti pois monilla
onnentoivotuksilla jälelle jääville.
— "Pirullinen veitikka!" murisi herra Bräuhäusel. "Pirullinen
veitikka!" — Vielä pirullisempaa olisi ollut, jos hän olisi voinut
ymmärtää, minkätähden tuo veitikka antoi ilmi nämät jo pelastetut
salaiset paperit, ja mitä näissä oli kirjoitettu. Mutta herra Bräuhäusel
ei ollut siihen syypää, että maailman menoa johtava viisaus oli
katsonut hyväksi määrätä, jotta Babelin tornin-rakennuksessa kiven-
kiillottajat eivät ymmärtäisi kiven-hakkaajain kieltä.
— "Pirullinen veitikka tuo!"
Mutta nyt olisi todellakin aika, että joku ajattelisi syömistä, sillä
tuossa paikassa tulee ilta.
No, siitä onkin jo huolta pidetty.
Ankerschmidt itse tosin ei ole kotona, mutta miss Natalie tietää,
mitä talo tämmöisessä tilaisuudessa on tuommoisille juhlavieraille
velkaa, niinkuin myöskin, mimmoinen lusikka, hovi-sääntöjen
mukaan, kunkin eteen on pantava. Sentähden sai pikku Gyuszi, sillä
ritari oli ottanut jahtimiehen mukaansa, jo kello yksitoista (valtojen
vieraissa-käynti-tunti) seuraavan käskyn: "mene vanhaan kastelliin,
jossa herrat ovat; sen herran, jolla on kolme tähteä, kutsut tänne
ylös kastelliin päivällisille; molemmille muille herroille, joilla on yksi
tähti, annat sen tiedon, että heitä varten on herra pehtorin luona

pöytä katettu; myöskin santarmeille sanot, että he saavat ruokaa
voudin tuvassa."
Gyuszi tuli tällä sanalla ainakin kymmenen kertaa katsastuksen-
alaiselle kastellille, mutta ovella seisoi vihainen asemies, jolle oli
annettu se käsky, ettei hän saisi laskea ulos eikä sisään ainoatakaan
sielua. Pitäen Gyusziakin sieluna, ärjäsi hän tälle joka kerta
"Tsurukk!"[50] ja hankki, jos tämä lähenisi, pistämään häntä siihen
kärkevään rautaan, joka oli hänen pyssynsä päässä, jonkatähden
Gyuszi ensikerralla karkasi pakoon, juoksi kotia ja kertoi, että häntä
tahdottiin pistää vartaasen.
Miss Natalie lähetti hänet takaisin sillä käskyllä, että hänen vartian
luokse tullessaan pitää asettua tanaan, nostaa käsi lakin reunaan ja
sanoa, minkätähden on tullut; sitte hän kyllä lasketaan sisään.
Maailmaa hallitsevat voimat olivat kuitenkin säätäneet niin, että
vartiana seisova santarmi ei ymmärtänyt sitä kieltä, jota Gyuszi
puhui, tämä kun oli kunniallinen tschekkiläis-ihminen; hän piti tätä
nyt jo vakojana ja ajoi hänet aika kierua pois, huutaen: "pyri tiehesi,
senkin vietävän urkkija!"
Kolmannella kertaa, jo kaukaa nähdessään Gyuszin heristi hän
hänelle nyrkkiä: "tuleppas lähemmäksi vaan!"
Neljännellä kertaa kun Gyuszi lähestyi, tömisytti hän hänelle jalkaa
ja karkotti hänet siten.
Viidennellä yrityksellä keksi hän kavalan kujeen: hän vetäysi oven
suojaan ja kun Gyuszi tuli ruokakäskyllä, iski hän yht'äkkiä kiinni
hänen niskaansa, hieroi häntä hirveästi tukasta ja sivalteli hänelle
muutamia kunnon korvapuusteja.

Siitä huolimatta täytyi Gyuszin vielä noin neljä kertaa yrittää
pääsemään katsastavain herrain luokse. Kerta pääsi hän jo huoneen
takaseinälle, huutaaksensa heille sisään akkunasta, mutta sieltäkin
karkotti hänet vartia. Sitte tuumaili hän kiivetäksensä ylös
johonkuhun kastanjapuuhun ja sieltä sanoa, minkätähden hän oli
lähetetty. Mutta sieltä hän siepattiin kiinni ja nyt tuli hänen mittansa
täyteen. Vihastunut soturi tempasi hänet alas puusta ja vei hänet,
kauluksesta kiinni pitäen, armollisten herrain eteen, ilmoittaen, että
hän täällä oli vanginnut vaarallisen vakojan, joka jo kymmenettä
kertaa tahtoo tunkea saartolaitoksen lävitse. Gyuszi ponnisteli
vastaan sekä käsin että jaloin.
— "No, sinä lurjus, mitä tahdoit?" tiuskasivat hänelle yhtä haavaa
kaikki kolme herraa. Hyvä, ettei pikku Gyuszi raukalle mitään
tapahtunut, joutuessaan kolmen tuommoisen muljottelevan
silmäparin ristituleen, jossa joka taholta häntä uhattiin elävältä
syödä. Onneksi juohtui hänen mieleensä, minkätähden oli tullut.
— "Minun tulee kutsua herrat päivälliselle."
Voi, kuinka yht'äkkiä kaikkien kolmen äkäiset kasvot lauhkenivat!
Kuinka kaikki taputtelivat pikku veitikkaa poskille: "kelpo pikku poika!
onhan se herra ritarin palkollisia kastellista."
Sen jälkeen rupesivat kaikki kolme yhtä haavaa ahdistamaan
syytöntä santarmia, joka vielä piti poikaa kauluksesta kiinni, ja hän
sai kuulla jos jotakin "taitamattomuudestaan, järjettömyydestään"
j.n.e.; hyvä, ettei tämä siitä mitään ymmärtänyt. Se raukka ehkä
vielä tänäpänäkin vaivaa päätään tämän arvoituksen selittämisellä.
— "Pelästyitkö, poikaseni?" kysyi herra Bräuhäusel, taas Gyusziin
päin kääntyen, jonka kasvoille itku oli piirtänyt uurteita, ikäänkuin

rankkasade multapeltoon. "Pelästyitkö kovin?"
— "Pelästyin."
— "Armollinen herrako sinut lähetti?"
— "Ei hän lähettänyt, sillä hän ei ole kotona, vaan missi lähetti,
että ettekö tahtoisi syödä päivällistä?"
— "Oi, kyllä. Me suutelemme hänen kättänsä, poikaseni; sano,
että kohta tulemme."
— "Kyllä. Mutta kenellä on kolme tähteä?"
Tutkija-herrat olivat näet vaikean työnsä perästä käärineet
huivinsa kaulaansa, jotteivät saisi kurkkutautia, ja tällä tavoin
peitetyistä kauluksista Gyuszi ei voinut tietää, mikä oli mihinkin
paikkaan käskettävä.
Herra Bräuhäusel käsitti kysymyksen.
Oi, herra Bräuhäusel on sangen hienotunteinen mies. Ja astuen
esiin kunnioitusta herättävällä ylhäisyydellä, vastasi hän:
— "Minä olen päällikkö, poikani, minä se olen."
— "Nuot muut kaksi ovat siis yksitähtisiä, eikö niin? Ja nämät
tässä, pyssy kädessä, ovat santarmit. No niin; missi lähettää nöyrät
tervehdyksensä herroille santarmeille ja käskee sanoa, että
päivällinen on heille valmistettu kastellissa; yksitähtiset herrat
otetaan mieluisasti vastaan atrialle pehtorin luona ja sen, jolla on
kolme tähteä, sopii, jos hänen on nälkä, mennä voudin tykó
syömään."

Welcome to our website – the perfect destination for book lovers and
knowledge seekers. We believe that every book holds a new world,
offering opportunities for learning, discovery, and personal growth.
That’s why we are dedicated to bringing you a diverse collection of
books, ranging from classic literature and specialized publications to
self-development guides and children's books.
More than just a book-buying platform, we strive to be a bridge
connecting you with timeless cultural and intellectual values. With an
elegant, user-friendly interface and a smart search system, you can
quickly find the books that best suit your interests. Additionally,
our special promotions and home delivery services help you save time
and fully enjoy the joy of reading.
Join us on a journey of knowledge exploration, passion nurturing, and
personal growth every day!
ebookbell.com

Cell Journal November 12 2010 Volume 143 Number 4 Cell Press

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Cell Journal November 12 2010 Volume 143 Number 4 Cell Press

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 6

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

TLE-9-Prepare-Salad-and-Dressing.pptxkkk

LESSON 1 ABOUT MEDIA AND INFORMATION.pptx

GRADE-8-AQUACULTURE-WEEKQ1.pdfdfawgwyrsewru

Feelings PP Game FOR CHILDREN IN ELEMENTARY SCHOOL.pptx

Jeopardy_Figures_of_Speech_Template.pptx [Autosaved].pptx

Jeopardy_Figures_of_Speech.pptxvdsvdsvsdvsd