Checkpoint Controls and Cancer Volume 2 Activation and Regulation Protocols 1st Edition Christopher N. Mayhew

Checkpoint Controls and Cancer Volume 2 Activation and Regulation Protocols 1st Edition Christopher N. Mayhew
Checkpoint Controls and Cancer Volume 2 Activation and Regulation Protocols 1st Edition Christopher N. Mayhew
Checkpoint Controls and Cancer Volume 2 Activation and Regulation Protocols 1st Edition Christopher N. Mayhew

1. Checkpoint Controls and Cancer Volume 2
Activation and Regulation Protocols 1st Edition
Christopher N. Mayhew download
https://ebookultra.com/download/checkpoint-controls-and-cancer-
volume-2-activation-and-regulation-protocols-1st-edition-
christopher-n-mayhew/
Explore and download more ebooks or textbooks
at ebookultra.com

2. We have selected some products that you may be interested in
Click the link to download now or visit ebookultra.com
for more options!.
Ovarian Cancer Methods and Protocols 1st Edition Evgeny N.
Imyanitov (Auth.)
https://ebookultra.com/download/ovarian-cancer-methods-and-
protocols-1st-edition-evgeny-n-imyanitov-auth/
Cell Cycle Checkpoint Control Protocols 1st Edition Howard
B. Lieberman
https://ebookultra.com/download/cell-cycle-checkpoint-control-
protocols-1st-edition-howard-b-lieberman/
Transcriptional Regulation Methods and Protocols 1st
Edition Xiao-Yong Li
https://ebookultra.com/download/transcriptional-regulation-methods-
and-protocols-1st-edition-xiao-yong-li/
Liposomes Methods and Protocols Volume 2 Biological
Membrane Models 1st Edition Alfred Fahr
https://ebookultra.com/download/liposomes-methods-and-protocols-
volume-2-biological-membrane-models-1st-edition-alfred-fahr/

3. Colorectal Cancer Methods and Protocols 1st Edition Steven
M. Powell
https://ebookultra.com/download/colorectal-cancer-methods-and-
protocols-1st-edition-steven-m-powell/
Cancer Susceptibility Methods and Protocols 1st Edition
Denise Daley (Auth.)
https://ebookultra.com/download/cancer-susceptibility-methods-and-
protocols-1st-edition-denise-daley-auth/
Pancreatic Cancer Methods and Protocols 2nd Edition Hanno
Matthaei
https://ebookultra.com/download/pancreatic-cancer-methods-and-
protocols-2nd-edition-hanno-matthaei/
Characterization of Materials 2 Volume Set 1st Edition
Elton N. Kaufmann
https://ebookultra.com/download/characterization-of-
materials-2-volume-set-1st-edition-elton-n-kaufmann/
Behavioral Activation for Depression A Clinician s Guide
1st Edition Christopher R. Martell Phd
https://ebookultra.com/download/behavioral-activation-for-depression-
a-clinician-s-guide-1st-edition-christopher-r-martell-phd/

5. Checkpoint Controls and Cancer Volume 2 Activation
and Regulation Protocols 1st Edition Christopher N.
Mayhew Digital Instant Download
Author(s): Christopher N. Mayhew, Emily E. Bosco, David A. Solomon, Erik
S. Knudsen (auth.), Axel H. Schönthal PhD (eds.)
ISBN(s): 9781592598113, 1592598110
Edition: 1
File Details: PDF, 3.85 MB
Year: 2004
Language: english

6. Edited by
Axel H. Schönthal
Checkpoint
Controls
and Cancer
Volume 2
Activation and Regulation
Protocols
Volume 281
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
TM
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
TM
Edited by
Axel H. Schönthal
Checkpoint
Controls
and Cancer
Volume 2
Activation and Regulation
Protocols

7. RB Action in DNA Damage Checkpoint Response 3
3
From:Methods in Molecular Biology, vol. 281:Checkpoint Controls and Cancer, Volume 2:
Activation and Regulation Protocols
Edited by: Axel H. Schönthal © Humana Press Inc., Totowa, NJ
1
Analysis of RB Action in DNA
Damage Checkpoint Response
Christopher N. Mayhew, Emily E. Bosco, David A. Solomon,
Erik S. Knudsen, and Steven P. Angus
Summary
Cell cycle checkpoints play a key role in maintaining genome stability by monitoring the
order and integrity of cell division events. Checkpoints induced by DNA damage function to
limit the propagation of potentially deleterious mutations. The retinoblastoma tumor suppres-
sor (RB) is a critical effector of DNA damage checkpoint function by eliciting G1-phase cell
cycle arrest following genotoxic stress. Here, we describe methodologies for evaluation of three
facets of RB action in the DNA damage checkpoint response: (1) transcriptional repression of
E2F-regulated genes (cyclin A reporter assay); (2) induction of cell cycle arrest (Brd-U incor-
poration assay); and (3) inhibition of DNA double-strand break accumulation (phosphorylated-
histone H2A.X detection). Together, this combination of techniques allows the evaluation of
RB action in the coordinated checkpoint response to DNA damage.
Key Words:Retinoblastoma tumor suppressor; checkpoint; DNA damage; cisplatin; cell
cycle arrest; phosphorylated H2A.X; murine embryo fibroblast; transcriptional repression;
bromodeoxyuridine; DNA double-strand breaks
1. Introduction
Cell growth and division requires the coordinated regulation of numerous
events. To ensure the fidelity of division, cells have evolved a number of com-
plex checkpoint mechanisms that monitor the replication process, ensuring that
events are completed correctly and in the proper order (1). Of particular impor-
tance are DNA damage checkpoints, which sense genotoxic stress and elicit a
coordinated response to eliminate the propagation of potentially deleterious
mutations(2). A critical component of the response to DNA damage is induc-
tion of cell cycle arrest (3). Delays in cell cycle progression are thought to
allow time for damaged DNA to be repaired. Different components of check-
point pathways are inactivated at high frequency in the genesis of human

8. 4 Mayhew et al.
tumors, highlighting the critical importance of these processes for maintaining
genome stability and protecting against development of cancer (4).
The retinoblastoma tumor suppressor (RB) plays an essential role in execut-
ing the DNA-damage checkpoint signal for cell cycle arrest (5,6). RB is a
potent negative regulator of cell cycle progression and its ability to control cell
cycle progression is achieved by regulated phosphorylation (7). Active,
hypophosphorylated RB inhibits cell cycle progression by binding to E2F tran-
scription factors (8). This interaction inhibits the ability of E2Fs to transactivate
key genes required for S-phase entry and DNA synthesis (8). Moreover, active
RB recruits chromatin-modifying proteins to actively repress the transcription
of E2F-regulated genes (9).
DNA damage checkpoints are thought to impinge on RB action through
both p53-dependent and -independent mechanisms. However, the best char-
acterized response is p53 dependent. Following DNA damage, the p53 pro-
tein is stabilized and activated by post-translational modifications. This
results in increased levels of the cdk2 inhibitor p21
cip1
, a key transcriptional
target of p53. Inhibition of cdk2 by p21
cip1
results in accumulation of the
active, hypophosphorylated form of RB, and cell cycle arrest (6).
Functional analysis of the role of RB in the response to DNA damage can be
done by several complementary approaches. Below, we describe three meth-
odologies that can be used to evaluate critical facets of RB action following
DNA damage. Firstly, we describe techniques used to assess the role of RB in
transcriptional repression of E2F-regulated genes (cyclin A-luciferase assay
[10]) and in the induction of cell cycle arrest following exposure to genotoxic
stress (Brd-U incorporation [5]). Finally, we describe an approach to directly
probe the critical role that functional checkpoints play in protecting cells from
the accumulation of double-strand DNA breaks following genotoxic stress
(phosphorylated-histone H2A.X [γ-H2A.X] staining [11,12]). In principle,
these approaches are applicable to the study of any agent that damages DNA.
2. Materials
2.1. Cell Culture, Transfection of Reporter Construct, and DNA Damage
1. Rb wild type (Rb+/+) and null (Rb-/-) murine embryonic fibroblasts (MEFs).
Prepare MEF cultures by standard methodologies by breeding heterozygous
(Rb+/–) mice, available from Jackson laboratories; strain name: 129S-Rb1
tm1TyJ
.
2. Dulbecco’s modification of Eagle’s medium (DMEM, Cellgro, Cat. no. 10-017-
CV) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS, Atlanta
Biologicals, Cat. no. S12450), 100 units/mL penicillin–streptomycin, and 2 mM
L-glutamine (Gibco-BRL).
3. Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS), tissue culture grade, without cal-
cium and magnesium (Cellgro, Cat. no. 21-031-CV).

9. RB Action in DNA Damage Checkpoint Response 5
4. 1X Trypsin-EDTA solution (Cellgro, Cat. no. 25-052-CI).
5. 60-mm tissue-culture dishes.
6. 6-well tissue-culture dishes.
7. 12-mm circular glass coverslips (Fisher), sterilized and ready to use.
8. Relevant plasmids: cyclin A-luciferase reporter construct (–608 CycA-Luc; see
ref.10), CMV-β-galactosidase expression vector, control vector (e.g., pcDNA3,
Invitrogen).
9. 0.25 MCaCl
2: dissolve in ddH
2O; filter (0.2 µm) sterilize and store in 50-mL
aliquots at –20°C.
10.2X BES-buffered solution (2X BBS): 50 mM N,N-bis (2-hydroxyethyl)-2-
aminoethanesulfonic acid, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na
2HPO
4, adjust pH with 10 N
NaOH to 6.95 in ddH
2O, filter (0.2 µm) sterilize and store in aliquots at –20°C.
11. Inverted fluorescence microscope (Zeiss).
12. Clinical-grade cisplatin (cis-Diaminedichloroplatinum; CDDP; Bristol Oncol-
ogy), sterile. Store at room temperature.
13. Microcentrifuge.
14. Probe sonicator (e.g., Branson Sonifier 450).
15. Galacto-Star β-galactosidase assay reagents (Tropix, Cat. no. BM100S).
16. 5X Reporter Lysis Buffer (Promega, Cat. no. E397A).
17. Luciferase Assay System (Promega, Cat. no. E1501).
18. Borosilicate culture tubes, 12 × 75 mm (Fisher, Cat. no. 14-961-26).
19. Luminometer (e.g., Femtomaster FB 12, Zylux Corp.).
2.2. Inhibition of Brd-U Incorporation by DNA Damage
1. CDDP-treated Rb+/+ and Rb-/- MEFs on coverslips in 6-well plates.
2. Cell proliferation–labeling reagent, Brd-U/FdU (Amersham Pharmacia, Cat. no.
RPN201).
3. 3.7% (v/v) formaldehyde in PBS: dilute fresh from 37% (w/w) stock solution
(Fisher).
4. 0.3% (v/v) Triton X-100 (Fisher) made fresh in PBS.
5. Jeweler’s forceps (Fisher, Cat. no. 08-95F).
6.Immunofluorescence (IF) buffer: 0.5% v/v Nonidet P-40 (Fisher), 5 mg/mL (w/v)
bovine serum albumin (Sigma) in PBS; store at 4°C.
7. 1 M MgCl
2.
8. DNase I, RNase-free (10 U/µL) (Roche, Cat. no. 776 785), store at –20°C.
9. Monoclonal rat anti-Brd-U antibody (Accurate Scientific, Cat. no. YSRTOBT-
0030), store at –80°C.
10. Donkey anti-rat IgG, Rhodamine-red X-conjugated (Jackson Immunoresearch,
Cat. no. 712-295-153).
11. 1 mg/mL (w/v) Hoechst 33258 (Sigma, Cat. no. B2883), store at 4°C.
12. Microscope slides (Fisher, Cat. no. 12-544-7).
13. Gel/Mount (Biomeda Corp., Cat. no. M01).
14. Inverted fluorescence microscope (Zeiss).

10. 6 Mayhew et al.
2.3. Detection of DNA Double-Strand Breaks by
γ-H2A.X Staining
1. CDDP-treated Rb+/+ and Rb–/– MEFs on coverslips.
2. 0.3% (v/v) Triton X-100 in PBS.
3. IF buffer (seeSubheading 2.2., item 7).
4. Mouse monoclonal anti-γ-H2A.X (ser139), clone JBW301 (Upstate, Cat. no. 05-
636), store at –20°C.
5.Rhodamine-red-X-conjugated affiniPure goat anti-mouse IgG (Jackson
Immunoresearch, Cat. no. 115-295-062), store at –80°C.
6. Hoechst 33258.
7. Microscope slides.
8. Gel/Mount.
9. Inverted fluorescence microscope.
3. Methods
3.1. Cell Culture and Transfection for Reporter Assay
3.1.1. Cell Culture
1. Seed approximately 3 × 10
5
cells per 60-mm dish in DMEM supplemented with
10% FBS and penicillin–streptomycin.
2. MEFs should attach to the tissue-culture dish within 4–6 h.
3.1.2. Cell Transfection
1. Prepare purified plasmid DNA stocks at 1-mg/mL concentration in TE buffer.
2. Add 2 µg –608 CycA-Luc reporter construct (or other luciferase reporter con-
structs of interest), 1 µg CMV-β-galactosidase expression vector, and 5.5 µg con-
trol vector to 1.5-mL Eppendorf tubes (8.5 µg total DNA per 60-mm dish; see
Note 1). Include a dish of cells transfected only with 8.5 µg of control vector to
serve as a baseline for luciferase and β-galactosidase activity.
3. Add 250 µL 0.25 M CaCl
2 to DNA and mix by pipetting.
4. Add 250 µL 2X BBS solution and mix by gentle inversion.
5. Incubate tubes at room temperature for 20 min.
6. Add DNA/CaCl
2/BBS solution to cells dropwise.
7. Inspect the cells for the presence of precipitate using an inverted microscope
(×20 magnification is sufficient; seeNote 2).
8. Return cells to tissue-culture incubator (37°C, 5% CO
2).
9. Sixteen hours after addition of precipitate, wash cells three times briefly with
PBS.
10. Inspect dishes to ensure removal of precipitate.
11. Add fresh medium to cells and return to incubator.
3.1.3. Treatment With DNA-Damaging Agent
Twenty-four to thirty-six hours post-transfection (i.e., approx 8–20 h after
removal of precipitate), add cisplatin to a final concentration of 32 µMor
vehicle control to cell culture media.

11. RB Action in DNA Damage Checkpoint Response 7
3.1.4. Preparation of Cell Lysate for Luciferase/
β-Galactosidase Assay
1. Sixteen hours after the addition of cisplatin, aspirate medium and wash cells with
PBS.
2. Add 0.75 mL of 1X trypsin-EDTA solution to dishes.
3. Incubate 3–5 min at 37°C, confirm that cells have detached using inverted micro-
scope.
4. Inactivate trypsin by adding an equal volume of medium containing 10% FBS.
5. Transfer suspended cells to 1.5-mL Eppendorf tubes.
6. Pellet cells at 16,000g for 10 s in microcentrifuge.
7. Carefully aspirate medium from cell pellet.
8. Resuspend cell pellet in 0.5 mL PBS.
9. Repeat step 6.
10. Aspirate PBS.
11. Resuspend cell pellet in 100 µL of 1X reporter lysis buffer (diluted 5X with ster-
ile water).
12. Incubate tubes on ice for 20 min.
13. Sonicate samples with three brief pulses at 30–40% output (constant duty cycle).
14. Centrifuge tubes at 16,000g in microcentrifuge at 4°C for 10 min.
15. Transfer cleared lysate to new 1.5-mL Eppendorf tube.
16. Place tubes on ice.
3.1.5.β-Galactosidase Assay
1. Add 150 µL of Galacto-Star reagent (substrate diluted 1:50 in diluent according
to the manufacturer’s instructions) to a borosilicate tube.
2. Add 1 µL of cleared lysate to Galacto-Star reagent. Swirl to mix.
3. Incubate at room temperature protected from light for 1 h (seeNote 3).
4.Following incubation, analyze and record β-galactosidase activity for each
sample in luminometer.
3.1.6. Luciferase Reporter Assay
1. Add 70 µL of luciferin (prewarmed to room temperature) to a borosilicate tube.
2. Add 15 µL of cleared lysate from the first sample and swirl to mix (seeNote 4).
3. Immediately analyze luciferase activity in luminometer.
4.Record luciferase activity and repeat steps 1–4for remaining samples (seeNote 5).
3.1.7. Quantitation and Documentation
1. To normalize for transfection efficiency between samples, determine the ratio of
luciferase to β-galactosidase activity for each sample (divide luciferase activity
byβ-galactosidase activity).
2. Set the normalized luciferase activities for untreated Rb+/+ and Rb–/– MEFs to
100%.
3. Relative luciferase activity for CDDP-treated samples is then represented as a
percent of the untreated control for both Rb–/– and Rb+/+ MEFs.
4. Plot the relative luciferase activity for each sample (seeFig. 1;seeNote 6).

12. 8 Mayhew et al.
3.2. Bromodeoxyuridine Incorporation Assay
3.2.1. Cell Culture and Drug Treatment
1. Plate Rb+/+andRb–/–MEFs (approx 1 ×10
5
cells/well;seeNote 7) on cover-
slips in 6-well plates (four coverslips per well; seeNote 8). Ensure enough dishes
of both Rb+/+ and Rb–/– MEFs are prepared for analysis of the desired number
of drug doses. Cells should be 60–70% confluent before addition of CDDP to
ensure cells are in exponential growth phase.
2. Freshly prepare working solutions of CDDP (0, 8, 16, and 32 µM) in prewarmed
tissue culture media.
3. Remove dishes from incubator and carefully and completely aspirate the medium
from each dish.
4. Replace with media containing desired CDDP doses and return cells to tissue
culture incubator (37°C, 5% CO
2).
5. Incubate Rb+/+ and Rb–/– cells with CDDP for 16 h.
6. After completion of drug treatment, aspirate media and wash cells three times for
5 min with prewarmed tissue culture medium. Return dishes to tissue culture
incubator for each wash step.
Fig. 1. Rb+/+ and Rb–/– MEFs were transfected with 608CycA-Luc reporter con-
struct and CMV-β-galactosidase expression vector and treated with 0 or 32 µMCDDP
for 16 h. Cell lysis and assay of luciferase and β-galactosidase activity were performed
as described. Shown is the mean from two experiments ± s.d.

13. RB Action in DNA Damage Checkpoint Response 9
3.2.2. Brd-U Labeling
1. Prepare working solution of cell proliferation–labeling reagent (1:1,000 dilution)
in prewarmed tissue culture medium (seeNote 9).
2. Aspirate medium carefully from each dish and replace with medium containing
cell proliferation-labeling reagent.
3. Return dishes to tissue culture incubator for 8 h.
3.2.3. Fixation
1. Following Brd-U labeling, aspirate medium from dishes.
2. Wash cells gently with PBS.
3.Fix cells at room temperature with 3.7% formaldehyde in PBS for 15 min, 2 mL/well.
4. Aspirate formaldehyde.
5. Add PBS to wells.
6. Coverslips in PBS may be stored in the dark at 4°C, wrapped in foil.
3.2.4. Brd-U Staining
1. Transfer one or two coverslips from each well to a fresh 6-well dish containing
PBS (seeNote 8).
2. Aspirate PBS.
3. Add 0.3% Triton X-100 in PBS to wells to permeabilize the cells.
4. Incubate dishes at room temperature for 15 min.
5. Aspirate 0.3% Triton X-100 and replace with PBS.
6. Prepare primary antibody solution by mixing the following in IF buffer in one
solution:
a. 1:50 1 M MgCl
2.
b. 1:500 rat anti-Brd-U antibody.
c. 1:500 DNase I (seeNote 10).
7. Using jeweler’s forceps, carefully transfer coverslips to a humidified chamber
prepared as illustrated in Fig. 2. Make sure that cells are on the surface that is
facing up.
8. Pipet 35 µL primary antibody solution directly onto each coverslip.
9. Place lid on chamber and incubate at 37°C for 45 min.
10. Carefully transfer coverslips to a clean 6-well dish containing PBS. Make sure
that cells remain face up during all wash steps.
11. Wash coverslips three times for 5 min with PBS at room temperature.
12. Prepare secondary antibody solution by mixing the following in IF buffer:
a. 1:100 donkey anti-rat, Rhodamine-red-X-conjugated.
b. 1:100 Hoechst (10 µg/mL final concentration).
13. Carefully return coverslips to the humidified chamber containing a clean sheet of
parafilm. Make sure that cells are face up.
14. Pipet 35 µL secondary antibody solution directly onto each coverslip.
15. Place lid on chamber and incubate at 37°C for 45 min.
16. Return coverslips to labeled 6-well dish containing PBS.

14. 10 Mayhew et al.
17. Wash coverslips three times for 5 min with PBS at room temperature.
18. Ensuring cell side is face down, mount coverslips on slides using Gel/Mount.
19. Store slides in the dark at room temperature until Gel/Mount is dry.
3.2.5. Quantitation and Documentation of Brd-U Incorporation
3.2.5.1. QUANTITATION
1. Examine coverslips using fluorescence microscope (×63 objective) to quantitate
Brd-U incorporation:
a. Count the number of Hoechst-stained nuclei in a random field (excitation/
emission maxima 350/460nm).
b. Without changing fields, count the number of cells that are also Brd-U-posi-
tive (i.e., Rhodamine-red-X-positive: excitation/emission 570/590nm).
c. Repeat steps a and b until 150–200 nuclei have been counted.
d. Calculate the percent Brd-U-positive cells for each coverslip ([Brd-U-posi-
tive/Hoechst positive] × 100).
e. Compare the effect of CDDP treatments vs untreated controls for both Rb+/+
andRb–/–MEFs. For each cell type the percentage of untreated control cells
Fig. 2. Diagram of immunofluorescence staining in a humidified chamber of fixed
and permeabilized cells grown on glass coverslips.

15. RB Action in DNA Damage Checkpoint Response 11
staining positive for Brd-U is set arbitrarily to 100% to normalize for any
differences in Brd-U incorporation between Rb+/+andRb–/–MEFs. The
effect of drug treatment is then represented as the percent Brd-U-positive cells
expressed relative to untreated control (seeFig. 3 and Note 11).
3.2.5.2. DOCUMENTATION
1. Take representative photomicrographs of selected fields.
2. Use blue (Hoechst) and red (Rhodamine-red-X) channels to obtain photomicro-
graphs of the same field (seeFig. 4).
3.3. Detection of DNA Double-Strand
Breaks by
γ-H2A.X (ser139) Staining
3.3.1. Cell Culture and Drug Treatment
1. Culture Rb+/+andRb–/–MEFs to 60–70% confluence (approx 1 ×10
5
cells/
well) on coverslips in 6-well plates (four coverslips per well).
2. Freshly prepare working solutions of CDDP (32 and 0 µM) in prewarmed tissue
culture medium.
3. Remove dishes from incubator and carefully and completely aspirate the medium
from each dish.
4. Replace with medium containing 32 or 0 µMCDDP and return cells to tissue
culture incubator.
Fig. 3. Rb+/+ and Rb–/– MEFs were treated with 32, 16, 8, or 0 µM CDDP for 16
h. Following extensive washing, cells were pulse labeled with Brd-U for 8 h. Fixation,
permeabilization, immunostaining, and quantitation were performed as described.

16. 12 Mayhew et al.
5. Incubate Rb+/+ and Rb–/– cells with CDDP for 8 h.
6. After completion of drug treatment, aspirate medium and wash cells three times
with PBS.
3.3.2. Cell Fixation
1. Remove one coverslip from each well and transfer to a new 6-well dish contain-
ing PBS (seeNote 8).
2. Remove PBS and add 2 mL of ice-cold methanol (prechilled at –20°C). Transfer
dishes to –20°C freezer for 10 min.
3. Completely remove methanol.
4. Add fresh PBS to wells and store in dark (wrapped in foil) at 4°C until staining.
3.3.3. Staining
1. Aspirate PBS.
2. Permeabilize cells by addition of 0.3% Triton X-100 in PBS for 20 min at room
temperature.
3. Aspirate 0.3% Triton X-100 and replace with PBS.
4. Prepare primary antibody solution by diluting the γ-H2A.X antibody 1:20 in IF
buffer.
5. Using jeweler’s forceps, carefully transfer coverslips to a humidified chamber
prepared as illustrated in Fig. 2. Make sure that cells are on the side that faces up.
Fig. 4. Rb+/+andRb–/–MEFs were treated with 32 µMCDDP for 16 h. Following
extensive washing, cells were pulse labeled with Brd-U for 8 h. Fixation,
permeabilization, and immunostaining were performed as described. Photomicrographs
were acquired at the same magnification with equal exposure times (×63 objective).

17. RB Action in DNA Damage Checkpoint Response 13
6. Pipet 35 µL primary antibody solution directly onto each coverslip.
7. Place lid on chamber and incubate at 37°C for 45 min.
8. After incubation, carefully transfer coverslips to a clean 6-well dish containing
PBS. Make sure that cells remain face up during all wash steps.
9. Wash coverslips three times for 5 min with PBS at room temperature.
10. Prepare secondary antibody solution by mixing the following in IF buffer:
a. 1:100 goat anti-mouse Rhodamine-red X.
b. 1:100 Hoechst (10 µg/mL final concentration).
11. Carefully return coverslips to the humidified chamber containing a clean sheet of
parafilm. Make sure that cells are face up.
12. Pipet 35 µL secondary antibody solution directly onto each coverslip.
13. Place lid on chamber and incubate at 37°C for 45 min.
14. Return coverslips to labeled 6-well dish containing PBS.
15. Wash coverslips three times for 5 min with PBS at room temperature.
16. Making sure that cell side is face down, mount coverslips on slides using Gel/
Mount.
17. Store slides in the dark at room temperature until Gel/Mount is dry.
3.3.4. Quantitation and Documentation of DNA Double Strand Breaks
3.3.4.1. QUANTITATION
Examine coverslips using fluorescence microscope (20-63X objective) to
quantitateγ-H2A.X staining:
1. Count the number of cells in a random field stained with Hoechst (indicated by
blue staining).
2. Without changing fields, count the number of phospho-H2A.X positive nuclei
(entire nucleus should exhibit red focal staining; seeFig. 5).
3. Repeat steps 1 and 2 until 150–200 total cells have been counted.
4. Calculate the percent γ-H2AX positive cells for each coverslip ([γ-H2AX posi-
tive/Hoechst positive] × 100).
5. The percentage of untreated Rb+/+andRb–/–cells staining positive for γ-H2A.X
is set arbitrarily to 1.0. Compare the percent of CDDP-treated Rb+/+andRb–/–
MEFs staining positive for γ-H2A.X to the pertinent untreated control and repre-
sent on a graph as n-fold increase in positive staining (seeFig. 6, and Notes 12
and13).
3.3.4.2. DOCUMENTATION
1. Take representative photomicrographs of selected fields.
2. Use blue (Hoechst) and red (Rhodamine-red-X) channels to obtain photomicro-
graphs of the same field (seeFig. 5).
4. Notes
1. 8.5 µg total DNA is the optimum quantity for transfection of a 60-mm dish using
the calcium phosphate method. For a control vector (i.e., to bring the quantity of

18. 14 Mayhew et al.
Fig. 6. Rb+/+andRb–/–MEFs were treated for 8 h with CDDP (0 or 32 µM).
Fixation, permeabilization, and immunostaining for γ-H2A.X were performed as
described. Effect of CDDP treatment on γ-H2A.X levels in Rb+/+andRb–/–MEFs is
represented as n-fold increase vs respective untreated cells (not shown).
Fig. 5. Rb–/– MEFs were treated for 8 h with CDDP (0 or 32 µM). Fixation, perme-
abilization, immunostaining for γ-H2A.X, and documentation of representative fields
were performed as described. Images were acquired using equal exposure times and
the×63 objective.

19. RB Action in DNA Damage Checkpoint Response 15
DNA to 8.5 µg) we typically use an empty vector that is identical to a vector used
in the transfection but that does not contain the insert (e.g., pcDNA3).
2. The formation/presence of black, granular precipitate ensures the quality of the
transfection reagents (i.e., 0.25 MCaCl
2and 2X BBS). Poor precipitate forma-
tion is often owing to incorrect pH of the 2X BBS solution.
3. We routinely perform β-galactosidase assays initially and carry out luciferase
assays during the 1 h incubation period.
4. This is a time-sensitive assay. Process all samples on an equal time scale.
5. Low β-galactosidase readings (those comparable to untransfected cells or cells
transfected without β-galactosidase plasmid) indicate poor transfection effi-
ciency, while low luciferase readings (those comparable to lysis buffer alone or
cells transfected without a reporter plasmid) indicate weak promoter activation.
Make sure that plasmids were quantitated accurately and that the cells were trans-
fected according to protocol while in exponential growth phase. Consistently high
readings of luciferase or β-galactosidase activity could indicate an excess of plas-
mid in the transfection. In this case, less plasmid can be transfected.
6. We routinely analyze luciferase activity with at least two independent experi-
ments, with each condition analyzed in triplicate.
7. It is imperative that cultures used for evaluation of Brd-U incorporation be in
exponential growth phase.
8. We typically process only one or two of the fixed coverslips from each well in
case of errors during staining. Thus, the other coverslips serve as backups in the
event of mistakes during processing.
9. Brd-U is light sensitive. Add to tissue culture media in a dark tissue-culture hood,
and limit light exposure (as with any fluorophore) during staining.
10. We recommend using DNase I only from Roche. DNase I purchased from other
companies has produced poor results, likely owing to excess enzyme activity.
11. The percent of untreated Rb–/–cells staining Brd-U positive is typically slightly
higher than Rb+/+cells. We arbitrarily set the percent of both untreated Rb+/+
andRb–/–MEFs staining positive for Brd-U to 100% to normalize for differ-
ences in Brd-U incorporation between these cultures. The effect of each drug
dose in both Rb+/+andRb–/–cells is then determined relative to the pertinent
untreated control.
12. When scoring γ-H2A.X staining, score only nuclei that exhibit completely focal
red staining as positive. Untreated cells typically have low levels of γ-H2A.X
staining, and we consider this weak staining as negative (seeFig. 5for examples).
13.Under the experimental conditions described (i.e., Rb+/+andRb–/–MEFs
treated with 32 µMCDDP for 8 h) we routinely observe approx 40–50% γ-H2A.X
positive staining in Rb–/– cells and 20–25% in the Rb+/+ cells.
References
1. Elledge, S. J. (1996) Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Sci-
ence274, 1664–1672.
2. Bartek, J. and Lukas, J. (2001) Mammalian G1- and S-phase checkpoints in
response to DNA damage. Curr. Opin. Cell Biol.13, 738–747.

20. 16 Mayhew et al.
3. Zhou, B. B. and Elledge, S. J. (2000) The DNA damage response: putting check-
points in perspective. Nature408, 433–439.
4. Nyberg, K. A., Michelson, R. J., Putnam, C. W., and Weinert, T. A. (2002) Toward
maintaining the genome: DNA damage and replication checkpoints. Annu. Rev.
Genet.36, 617–656.
5. Harrington, E. A., Bruce, J. L., Harlow, E., and Dyson, N. (1998) pRB plays an
essential role in cell cycle arrest induced by DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA95, 11,945–11,950.
6. Brugarolas, J., Moberg, K., Boyd, S. D., Taya, Y., Jacks, T., and Lees, J. A. (1999)
Inhibition of cyclin-dependent kinase 2 by p21 is necessary for retinoblastoma
protein-mediated G1 arrest after gamma-irradiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
96, 1002–1007.
7. Mittnacht, S. (1998) Control of pRB phosphorylation. Curr. Opin. Genet. Dev.8,
21–27.
8. Dyson, N. (1998) The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev.12,
2245–2262.
9. Harbour, J. W. and Dean, D. C. (2000) Chromatin remodeling and Rb activity.
Curr. Opin. Cell Biol.12, 685–689.
10. Nakamura, T., Okuyama, S., Okamoto, S., Nakajima, T., Sekiya, S., and Oda, K.
(1995) Down-regulation of the cyclin A promoter in differentiating human
embryonal carcinoma cells is mediated by depletion of ATF-1 and ATF-2 in the
complex at the ATF/CRE site. Exp. Cell Res.216, 422–430.
11. Paull, T. T., Rogakou, E. P., Yamazaki, V., Kirchgessner, C. U., Gellert, M., and
Bonner, W. M. (2000) A critical role for histone H2AX in recruitment of repair
factors to nuclear foci after DNA damage. Curr. Biol.10, 886–895.
12. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., and Bonner, W. M. (1998)
DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine
139.J. Biol. Chem.273, 5858–5868.

21. Random documents with unrelated
content Scribd suggests to you:

22. Octsattasoo
Josephus! zijdy 't zelf, of is uw schim verrezen,
Die gij[231] voorlang bij ons begraven waart voor dezen?
Josephus, zijdy daar? wat komdy nu zoo spa
Den brand uitlesschen van 't woest Hierosolyma[233]?
De daken neêrgezakt gekeerd zijn lang tot asschen:
Het krijgsvolk heeft in 't bloed zijn handen lang gewasschen,
En 't heilig goud verklaard voor keizerlijken buit:
't Is hier schoon uitgeveegd, gemoord, geroofd, geruit:
De felheid van zoo veel Hierosolymitanen
Dit mager hoopken liet het aangezicht vol tranen.
JOSEPHUS.
Onzalig Sion, die uw zinnen overlaadt,
En mijmert om uw ramp en omgevallen staat!
Gij derft Josephus niet uws herten grond uitputten[234],
Die alsins heeft gepoogd uw dorpels te beschutten:
Die onlangs, daar men 't al de keel afstak en sneed,
Daar hem de vlamme schoer de noppen van zijn kleed,
Daar 't bloed zijn lijfrok smette, en 't brein hem sprong om d' ooren,
U uit die slachting redde, en liet u niet verloren.
DE DOCHTER SION.
Vergevet mij! genade! het is, het is mijn schuld;
Verbijsterd staat mij 't hoofd van enkel ongeduld.
Ik ben mij zelven noch gelijk, noch ook niet machtig.
Een bladeken, dat ruischt, mijn ziele maakt vreesachtig.
Maar zegt ons, wat 's er gaans in 't heer van de onbesneên?
Wat juichen gaat er om? waar wil men met ons heen?
Wat zwerven langer wij op dees geslagen toppen
En rotsen, die, nu 's nachts nu 's daags, met heesche kroppen,
Ons klachten volgen, als wij zien van verre opgaan
Den smook, daar onlangs nog plag d' heilge stad te staan?
JOSEPHUS.

23. Het heerkracht, naauwlijks zat van woên op d' uitverkoornen,
Verschoond hadde alleen, drie Herodiaansche toornen[235]:
Opdat nog eeuwig de nakomeling onthield,
Wat muurwerk Rome eertijds heeft tot den grond vernield,
Als d' overwinner laat een gaalderije oprechten,
Van waar hij zelf aldus toeredent[236] zijn landsknechten[237]:
"Krijgshelden, die dusverre uw rechterhand alom
En ijver hebt besteed tot nut van 't keizerdom
Die 's vijands hoogmoed deedt op dees steenrotsen krimpen,
Van waar halsstarrig hij ons legers dorst beschimpen:
't Is recht, dat 's maarschalks gunst uw deugd loop' te gemoet,
En 't zweet uws arbeids met belooningen verzoet!"
Zoo sprekende, met een glad voorhoofd[238] hij der scharen
Verdiensten vrolijk gaat met giften evenaren,
En haar deelachtig maakt den buit en rijken roof,
Die 't Heidensch volk aanveerdt, na[239] haar soldaats geloof[240].
De vroomste[241], van wiens huid de sabelen afschampten,
Hij met halsbanden troost, kleinoodje, en hooger ampten[242]:
Dies 't gansche leger juicht, en in zijn handen klapt,
En elk het bloed vergeet, dat hem is afgetapt.
DE DOCHTER SION.
Die feest was voormaals ons, was Sions, en geen ander,
Als David, Jesses zoon, die rechte Salamander,
Die midden in de brand van 't oorloog 't leven vond,
't Hovaardig Rabba brak, daar Ammons hert op stond;
Als Assur week, verstrooid in velden en woestijnen,
Dien, die niet zoeters vond als 't bloed der Filistijnen,
En (overlaân met roof) met rei, en met tamboer,
Op 't maagdelijk muziek ter poorten inne voer.
JOSEPHUS.
Den overwinner, om zich dankbaar te bewijzen,
En d' hongrige afgoôn ook met offervuur te spijzen,
Tenheuvelspoeddedaarhetwoedenzoogoedkoop

24. Ten heuvel spoedde, daar het woeden zoo goed koop
Wierp 't heilge metselwerk der kerken overhoop:
Omcingeld met een stoet schildknapen en hartsieren[243],
En krijgsliê, vrolijk om dees zegefeest te vieren.
De beesten afgekeurd[244] ter slachting, klommen stout,
En zonder aarslen voor zijn aanzicht: doende 't goud
(Dat onlangs was geschrabt, met messen en met bijlen,
Van 's tempels balken en van d' halfverbrande stijlen,
En om haar hoornen nu gegoten) blinken, als
Zij t' elken[245] staken op vrijpostig haren hals.
De kransen, versch van kruid gevlochten, men van verre
Zag lieflijk groenen en omschaduwen haar sterre,[246]
En 't zoute[247] veldgewas verzwolgen van de krans.
Twee priestren glad gehelmd, met koper schoon van glans,
Geborstweerd met een plaat, die 't overkleed bedekte,
Dat bont gespikkeld zich ten halven lijve strekte,
Vanwaar de lijfrok zond zijn vouwen naar beneên,
Omgord met eenen riem vol schilden rond en kleen,
Nabootsende een schalmei, met huppelen en springen,
En tromlende op haar borst, voor uit als leidsliê gingen.
't Opsteig'ren kostte zweet; de weg lag ongebaand,
En 't steil gesteente woest, wanschapen van gedaant'.
Het gladde horenvee vermoeid van bangheid rookte,
Om strijd met 't molm verduft[248], dat half gestikt nog smookte,
En mijdde[249] in 't klimmen nog 't gebeent', dat moedernaakt
Des Heeren berg tot een ellendig kerkhof[250] maakt.
De kraayen vloôn 't gebulk, en de arenden verschrikten,
Die hier ter feest gebeên de doôn[251] 't gezicht uitpikten.
DE DOCHTER SION.
Zwijgt, zwijgt, Josephus! zwijgt van arenden, en kraayen:
Onze ooren zijn te teêr, ons hoofd bestaat[252] te draayen:
Dat schouwspel luidt te vremd: hij zielbraakt die 't aanhoort
(Wij zwijgen, die 't beschouwt); maar neen, vertelt ons voort:
Daar is geen grouwzaamheid ter wereld zoo bezeten,
Of wij zijn 't nu gewoon, en lang al doorgebeten.

25. Ojjtugeoo,eagadoogebete
JOSEPHUS.
Genakende daar 't nu van lijken stonk benaauwd,
Daar de arke voormaals school met Cherubs overschaauwd,
Van waar men deerlijk de Jeruzalemsche wallen,
En ons stadpoorten zag geraâibraakt en vervallen,
En de uitgetrokken doôn naakt, zonder onderscheid,
Den luipaarden tot roof, de myrre en 't graf ontzeid;—
Nadat de wichlers de verwoeste kerk aanschouwen,
Zij van 't verstrooid gesteente een hoog outaar doen bouwen:
De stijlen half gevonkt, de balken zwert berookt,
Tot brandhout staplen[253] op het plat, dat daadlijk smookt,
En willig 't vuur ontvangt: terwijl haar de ossen lieten
De bastert[254] eerst gekoord[255] recht tusschen d' hoornen gieten:
Den krans ontrukken, en die gaâr[256]-gebonden blaân
Den vlammen heilgen, en 't gezouten korengraan:
Den rug opvlijmen en de altaarknechts hun genaken,
Die met 't gewijde mes haar voort den strot afstaken.
Het bloed de leegte koos, en zwalpende over al,
Bootste een verbolgen meer, en rooden waterval.
De buiken opgeschrobt[257] ontslaan haar d' ingewanden,
Die, naauw doorsnuffeld, 't vuur ontving om te verbranden.
De priestren stelden haar voor 't altaar ongeknield,
Dat Titus statig met de slinker vingren hield:
Den rechter hij ontzeî den zwaren veldheers hamer,
Om Hemelwaarts zijn hand te heffen veel bekwamer:
"Teruggeziende God[258]! Godin! die, nooit geschaakt[259],
Om Rome, riepen zij, en onzen Tiber waakt!
O Janus, grijs van haar! en Vesta! die te gader
Ons gunst draagt, met Juppijn, die grootste en beste Vader:
O, vader Mars! en al gij Goôn gezamentlijk,
Die ons genadig zijt, en, om het keizerrijk,
Met zoo veel zegens en triumfen, te bevesten,
't Huis van Vespasiaan hebt uitgekipt ten lesten,
En Titus wakkren erm met zulken punt verzaagt,

26. 't Welk aarsling oversmijt al wat er schepters draagt:
Die gij hem gunstig holpt vermeestren dit tyrannig,
Dit boos verwaten volk, zijn vorsten wederspannig:
O, Goôn! wij danken u: wij loven u, o Goôn!
Knikt onzen offer toe, en opent uwen troon!"
DE DOCHTER SION.
Straft gij geen Heidnen meer, God Abrahams! en laat ze
Afgodisch rooken op uw heilge stede en plaatse?
Waar was uw solferstraal, die nooit dien smaak verdroeg?
Die Ptolomeus plat jeloers ter aarden sloeg?
Was God van God ontkleed? is hij zoo traag in 't wreken?
Wat dood, wat straf, wat wraak, wat volgde voor een teeken
Dien grouwel?
JOSEPHUS.
Onder des was 't altaar aangegaan;
Met weeken oogen wij dien grouwel zagen aan:
De rots, driemaal verschud, van onder spleet tot boven,
En d' afgrond 't licht verzwolg door 't gapen van de kloven.
Den Hemel wierd bekleed met een verbolgen zee,
En dreigde met tempeest 't afgodisch vuur alreê:
Maar de onverlichte[260], die van droomen haar geneerden,
Dit op[261] een morgengroet, en heilzaam spook[262] waardeerden:
De omstaande krijgsliê zulks ten halve naauw verstaan;
"Iô, Titus! Iô, Iô, Vespasiaan!"
Al schaterende zij de klippen weêr doen galmen,
En kransen 's keizers kruin met schaduwende palmen:
De veldheer weder hun een dankbre ziel toekeert,
En met 't geslagen vee den ruiterdisch stoffeert.
DE DOCHTER SION.
Nu treurt, Staatdochters! treurt, en krenkt vrij al uw zinnen:
Want met haar vleuglen nu de goude Cherubinnen

27. De grouwlen dekken, die de jongling ons toeriep,
Die veilig in de gracht[263] en 't hol der leeuwen sliep:
Waar toe is Aäron en Levi nu gekomen?
Wee tempel, stad, en volk! gij, paradijs der vromen[264]!
Gij, wellust Israëls! hoe ligdy nu vertreên!
REI VAN STAATJONFFREN.
Helaas! mevrouwe, helaas! geen godlooze onbesneên
De driemaal heilige aarde ontwijdde, noch schoffeerde.
DE DOCHTER SION.
Wie dan?
REI VAN JOODSCHE VROUWEN.
Maar[265], 't boevenschuim dat onzen staat verheerde,
Lang eer de gramschap nog des keizers, veel getergd
Zijn hengsten briesschen dede, en draven in 't gebergt:
Lang eer nog Titus kwam aanbrallen op ons vesten,
En ons paleizen den uitheemschen gaf ten besten:
Den volkren, die de maan zien dobbren op d' Eufraat,
Wanneer z' haar toortse ontsteekt, en ons den dag ontgaat
Die Tigris golven zien uit Taurus lenden dringen:
Die over Caucasus al hooger Noordwaart springen:
Die op Pactolus' strand het goud in d' oogen raait[266]:
Die in d' Ægeesche zee zijn hier en daar gezaaid:
Van 't West, daar Tagus laaft den half gebraden Iber:
Daar 't oever wederzijds gelekt wordt van de Tiber:
D' Ægypter, die den Nijl ziet vloeyen over 't droog:
D' Araber, toegerust met pijlen, tros[267], en boog:
Meer andren, die verhit op 't moorden en op 't plondren,
Met 't weêrlicht kwamen van haar beukelaars opdondren.
DE DOCHTER SION.
MaarzegtJosephus!hoe'tonsmanschapisvergaan

28. Maar zegt, Josephus! hoe t ons manschap is vergaan,
Die d' overwinner hield zoo strengelijk gevaân
In 't leger, als er niets verschoond bleef onbedorven.
JOSEPHUS.
Der boozen rot heeft meest verschulde straf verworven.
DE DOCHTER SION.
Dat was 't, daar ik na haakte! o, Scheidsman! die recht scheidt,
En in de weegschaal hangt van uw rechtveerdigheid
Der menschen zaken, die omwentlen hier beneden:
Nu zien wij, dat bij u geen boosheid wordt geleden,
Die luid van de aarde naar den Hemel roept om wraak.
JOSEPHUS.
Nu luistert, dat ik u ontvouw de gansche zaak:
DE DOCHTER SION.
Gij Reyen, geeft gehoor!
JOSEPHUS.
Zoo fluks de krijgsliê hoorden
't Geblazen koper hun ontzeggen 't vorder moorden:
(Behalven dat het was geoorloofd te verslaan
Al, wat d' onstuitbre nood in 't harnas te weêrstaan
Droomde, uit mismoedigheid) zij haren veldheer boden
Nog een ontelbre schaar van afgematte Joden:
Die 's keizers omzicht liet door zijner Drossaarts een
Uitzondren, en de vrome en schuldige onderscheên:
Maar d' onderzoeker heeft[268] 't verborgen goed[268] te visschen,
In 's moorders voorhoofd leestm'[269] het knagende gewissen:
Dus strekt hij zoo terstond gedoemd, met ziel en lijf,
Den woedenden soldaat een zeldzaam tijdverdrijf.

29. Hier moet er een goed deel, met handen en met voeten
Genageld aan het kruis, bebloed haar bloedschuld boeten:
Daar stuurt mender een hoop van Moria te fel
Naar Kedrons afgrond toe, als naar de donker Hel,
En dekt ze in 't vallen met muurstukken en met steenen,
Dies vinden zij haar einde en uitvaart al met eenen:
Hier jagen ze, om van 't vuur den heeten gloed t' ontgaan,
Haar zelf aan palen dood, geschroeid en half gebraân:
Daar sterven nog, uit nijd en afgunst van de wachters,
Veel honderden van dees godlooze Godverachters:
Hier breektmenze de leên met knodsen zwaar van wicht:
Daar kwetst men andren 't hert, de darmen, en 't gezicht:
En duizenderlei slag van nieuw gevonden straffen
Haar boosheid achterhaalt.
DE DOCHTER SION.
Dat leert, dat leert ze blaffen,
Die honden! tegen God, die, oprecht Rechter, niet
Verschoont in zijnen toorne, of door de vingren ziet
Oogluikende eenig kwaad.
REI VAN STAATJONFFREN.
Hoe zijn ze voort gevaren,
Die aan Jeruzalems verderf onschuldig waren?
REI VAN JOODSCHE VROUWEN.
Hoe anders, als bewaard tot een veel strenger lot,
Als die booswichten zelve, en menschen zonder God.
JOSEPHUS.
Van jongelingen, sterk van lijf, zijn zeven honderd
Tot d' aanstaande triumf des keizers uitgezonderd;
En die bereikten nog geen zeven jaar en tien,
Alsbeestenomgeveild;menheeftverwisslenzien

30. Als beesten omgeveild; men heeft verwisslen zien
Voor éénen penning tien en tweemaal zoo veel zielen,
't Welk zalig loofden, die door 't zweerd in 't oorloog vielen:
Als zij met 't ijzer van haar ketens overlaân,
Den bolpees schroomden van een strengen gardiaan[270].
Voorts, om in schouwplaats 't oog te dienen der tyrannen,
Zijn tot der dieren aas geschikt veel strijdbre mannen,
Of om te schermen lijf om lijf, en hand voor hand:
Waar 's princen wellust dan haar omvoert achterland[271],
Het[272] most eenen steenen hert geborsten zich erbarmen,
Die hier voor 't lest de zoon den vader zag omermen,
De vaders vallen weêr haar zonen om den hals,
Den stok[273] haars ouderdoms, den troost haars ongevals:
Als elk zijns weegs bedrukt most volgen die hem leiden,
En, ziende tienmaal om, in 't al te bitter scheiden
Gaf teekenen genoeg, hoe streng natuur verbindt,
Door onderlinge trouw, den vader aan het kind,
Het kind aan 's vaders ziel, de broeders aan haar broeders:
Die eertijds, hangende aan de borst eens zelfde moeders,
Versloegen d' eerste dorst met d' ongevalschte melk
Die uit één ader vloeide: o, welken bittren kelk
Most hier gedronken zijn! en zoude ik ons vermanen[274]
De klachten, het gebaar, 't verzuchten, en de tranen,
Ik most bezwijken, en uw luider[275] droeve staat,
Beschreide vrouwen! dit nu geensins toe en laat.
Daar is 't verhaal in 't kort.
REI VAN JOODSCHE VROUWEN.
Nu wreekt uw leed met schreeuwen[276]
En huilen overluid, gij onbestorven weeuwen!
Roept luider als gij pleegt eertijds in barens nood,
Doen d' eerstgeboren haakte in uw benaauwde schoot
Naar 't wenschelijke licht des levens, dat ons langer
Verdrietelijker valt, en gaat met plagen zwanger.
Onze echte mannen ach! gaan, zonder den adieu,
Het afgeworpen jok opnemen op een nieuw!

31. etageopejoopeeopeeeu
Onze oudstgeboorn' helaas! gejukt, voor een godloozer
Herboren Faro, vliên en Nabuchodonoser.
Ach, jonffren! met ons treurt!
REI VAN STAATJONFFREN.
Helaas! waar blijven wij?
De geilheid des soldaats (och! moeders blijft ons bij!)
Brandt na ons reinigheid met trommelen en pijpen.
Zij naderen, om uit uwe ermen ons te grijpen.
Ons kuischheid lijdt gevaar, die, o wat leider[277] smet!
Jeloers de dorpels hield van 's vaders huis bezet:
Die heerlijk aan den rei der maagden plag te brommen,
En was geheiligd voor zoo schoonen bruidegommen,
Die 's vijands wreedheid gaat verstrooyen West en Oost.
Helaas! helaas! helaas!
REI VAN JOODSCHE VROUWEN.
Nu dochters, zijt getroost!
REI VAN STAATJONFFREN.
Och, Moeders! blijft ons bij.
DE DOCHTER SION.
Nu zet[278] u wat te vreden.
REI VAN JOODSCHE VROUWEN.
God Jacobs! ziet ons aan, en red ze in zwarigheden,
En zalft ze, die gij sloegt!
JOSEPHUS.
Deze ijdle tranen spaart,
Gij Joodsche vrouwen! die uw droefheid maar verzwaart.

32. GjJoodsceouedeudoeedaaeaat
Gij maagden! schept wat moeds; wie weet nog, van wat enden
onverwachten troost kan Jozefs trooster zenden.
DE DOCHTER SION.
Matthias' zoon, die de eer zijt van uw oud geslacht[279],
Die de overwinners vaak vermorwd hebt en verzacht,
En met uw lippen kneedd' haar hert van diamanten,
Van dat z' haar grof geschut[280] eerst op dees hoogten plantten;
Josephus! of hem nog de maarschalk zoo beried,
Dat hij, door u beweegd, een maat stelde ons verdriet,
Zoudt gij tot Jacobs heil en troost gebruiken laten
Uw redenrijke tong gedoopt in honigraten?
JOSEPHUS.
Wel duizendmaal zoo veel, mevrouwe!—Voor gewis
Houd, dat Josephus' gunst tot uwen besten is.
's Wets heilge bladen ik ge-eigend heb door 't bidden,
Mijn bloedverwanten ook behouden, in het midden
Der slachting, daar verbaasd elk zag naar 't vluchten om;
Des keizers mildheid mij den vrijen edeldom
Vereerde, en heb gestuit veel razende soldaten,
In 't moorden, branden, als de wereld scheen gelaten
Te wezen zonder Gods bestiering: dies ik veil[281]
Mijn jonste willig nog tot uw en ieders heil:
Dan[282], overmids ik nu, met Titus meer te vergen,
Zijn goedheid schijnen mocht te sarren en te tergen:
Verzoekt veel liever zelf nog, met gebogen kniên,
Verzachting van uw kwaal! wie droomt, wie weet misschien
Wat gij verbidden mocht van hem ter goeder uren!
Der vrouwen tranen doch zoodanig van naturen
En aard zijn, dat ze vaak beroeren nog die geen,
Die onverbiddelijk in ieders oogen scheen.
Gaat, vrouwen, maagden! gaat dan d' overwinner smeken,
Die morgen of in 't kort zijn leger op zal breken.
Vaartwelmevrouwe!ikgaHijwendeuwongeluk

33. Vaart wel, mevrouwe! ik ga. Hij wende uw ongeluk
Die al uw onheil weet!
REI VAN STAATJONFFREN.
Laat gij ons dus in druk?
REI VAN JOODSCHE VROUWEN.
Josephus! mag ons meer voor ditmaal niet gebeuren?
DE DOCHTER SION.
Staatjonffren! volgt mij na, en houdt wat op van treuren.
Tza, gaan we, laat ons gaan! gij vrouwen, volgt mij na!
Wij moeten dwalen op der vijanden gena.
REI VAN JODINNEN.
Laat ons beschreyen 't algemeen
Verderf, en 't licht, dat jongst bescheen
Die Hemelhoog getoornde klippen[283]
Van Davids veel bestormde stad,
Als God haar val gezworen had
Met onbedriegelijke lippen.
Of 's tempels grondvest, nacht en dag,
Naar 't sterren welfsel open lag,
Geverwd van 't bloed der welgeboornen,
En of men 's keizers adler mocht
Zien, met zijn pennen, slaan de locht,
En schittren af van stompe toornen:
Nog even trotsch en onbezorgd,
Op de opperstad en Davids borcht
De muiters haar borstweeren manden[284]:
En wie zijn doodverw had gezet
Uit vreeze, 't vluchten wierd belet

34. Van boeven, die hier t' zamen spanden.
Maar als zijn opzet en besluit
God tegen ons woû voeren uit,
Is schielijk 't leeuwen hert ontvallen
Ons manschap, die beangst uit nood
Den vijand, zonder slag of stoot,
Beklimmen liet de trotsche wallen.
De vijand, die zijn vaan alreê
Van ons rondeelen zwieren deê,
En blies triumf van vreugde dronken;
Doen kwam die dag en uur, dat God
Ons had bescheerd[285] dat strenge lot
Zijn gramschaps, die bestond t' ontvonken.
't Roomsch krijgsvolk, als 't geen wederstand
Noch tegenweer van mannen vand[286],
Drong 't met geslepene rapieren
In d' enge straten bol en dik[287]:
Daar 't waadde, in eenen oogenblik,
Ten enklen toe in bloedrivieren.
De een, om te ontvliên de bleeke dood,
In onderaardsche kelders vlood,
Wiens toegang wierd gestopt met blinden:
En d' ander, door mistroostigheid
En wanhoop, in zijn ziel verleid,
Gewapend ging zijn kerkhof vinden.
Hoe menig held, die, trotsch van moed,
Woû 't vaderland zijn heldisch bloed
Opoffren in 't gevaar der straten,
Van vrouwe en kindren om den hals
Gevallen wierd, met veel geschals:
"Wat wildy, vader! ons verlaten?"

35. 't Kind, dat nog eerst aan banken[288] ging,
Aan 's moeders achterslippen hing;
De voêster 't zuigeling liet weenen,
En kwam haar vrouw te hulp, zoo ras
De meester greep naar 't cortelas[289];
't Riep deerlijk al: "waar wildy henen?"
Als d' huisweerd ziet, dat uit noch in
Hem laat 't bestorven huisgezin:
"Laat los, laat los!" roept hij ten lesten,
"Dat ik alleen, van 't hooge dak,
Mijn poorte[290] vrij van ongemak,
En ons ontsla dees Helsche pesten."
't Is naauw gezeid, men vliegt er knap
Na boven, langs den wenteltrap,
Met steenen toegerust en blokken;
Daar ziet hij, hoe een blaauwe wolk[291]
En rot van 't fel Latijnsche volk
Komt op zijn dorpels aangetrokken.
Maar als zij dreigen klop op klop
Te drijven, met heerhamers, op
De poort[292], bewaakt van slot en grendel:
Wreekt hij dien euvel heel goedkoop,
En kneust de voorste van den hoop,
En hagelt onder 't moorders vendel.
De ruiters 't bloed, verbitterd heel,
Krimpt van de zool in 't bekkeneel,
Zoo[293] man en ros de beenen breken;
Dies zenden ze, met stijve boog,
Wraakgierig haar geschut[294] om hoog,
En branden om dien smaad te wreken.
Wat groeit hier een nieuw stads rumoer!
De deur gescheurd vliegt op de vloer,

36. Van toorn zij op haar tanden knersten;
De voêster, die betaalt 't gelag,
De moeder sneuvelt in[295] een dagg',
En 't zuigling treên ze 't hert te bersten.
Terwijl 't beneên, al uitgeleefd,
Den lesten schreeuw en doodsnak geeft,
D' huisvader, om haar voor 't verderven
Te hoên, van boven rolt verbaasd,
Dien de ongebonden moorders haast,
Uit toorne en wraak, aan hutspot scherven[296].
De maagden, naauwlijks houwbaar nog,
Zij, na veel dreigementen, och!
Van hare jongvrouwschap onthulden;
Die, na veel zwijmens, riepen luid:
"Is 't Godlijk recht in Isrel uit,
Dat God dien overmoed kan dulden?"
Wie kan afmalen al d' ellend,
Die, waar me[297] 't aanzicht keert of wendt,
Gebeurt? wat blijft er onbedorven
Van 't roofgier spook, op snood gewin
Verhit, dat menig huisgezin
Aan honger leêg vond uitgestorven.
De zon al vroeger, dan zij plag,
Den draaiboom toesloot van den dag,
En week dees grouwlen in de baren.
De menschenslachters, moordens zat
Maar woedens niet, doen[298] nog de stad
Met vuur ten Hemel deden varen.
Gelijk den dag was doorgebracht
Met moorden, zij den duistren nacht
Met blakren sleten en met branden.
God! waarom ledy[299], dat uw Kerk

37. Godaaoedy[99],datue
En stad, der Eng'len timmerwerk[300],
Geschend wierd van zoo snooden handen!

38. DE DERDE HANDEL.

39. fineaë, priester.
Melchisedech! o, die ooit[301], de eerste priester Gods,
Het priesterschap bekleedde op Salems hooge rots,
Wiens hoofdscheêl van God zelf met balsem wierd bedropen,
Gezalfd en toegekend den myter, boven open:
Doen 's Heeren heuvel gij wat hooger trokt, tot dat
Hij 't aanzien en den naam van een ontworpen stad
Bereikte in Canaän;—Aäron uitverkoren!
Die 't reukwerk aanstaakt met uw zonen welgeboren;—
Ziet op, gij helden Gods! Aartspriestren, ziet eens om,
Hoe 't van den Hemel hooggeadeld priesterdom,
Ontkleed van zijnen glans, treurt zonder glimp of luister,
Gelijk, bij zonnezwijm[302], al schemerende in 't duister
De wereld sprietoogt[303], zoo, wanneer de maan jeloers
Den sterflijken te spijt dekt 't aangezicht haars broêrs:
Treurt, als 't gerantsoend lijk eens konings, die verslagen
Wordt, op een rosbaar, versch gebalsemd thuis gedragen.
Waar is, Jeruzalem! nu uwen konings-staf,
En 't priesterlijk cieraad, dat u Jehova gaf?
Waar is uw blank ivoor? uw marmer, klaar van schimmer?
Uw purper, fijn van draad? uw kerkelijk getimmer[304]?
Uw koninklijk paleis? waar zijn uw cedren? waar
Uw pijlers, bogen, en gewelven allegaâr?
Waar 't zilver? waar het goud? waar zijn de Cherubijnen?
Waar 't altaar, 't wyrook, en dees blinkende gordijnen?
Waar de Arke des Verbonds? waar Gods geheimenis?
Helaas! 't is verr' gezocht, dat niet te vinden is.
Wie had gedocht[305], dat God, te streng op ons gebeten,
Zijn erfdeel zoo geheel vertreên zoude en vergeten?
Schoon of de muur omringd van zulken heerkracht was,
Dat[306] in 't gebergte alom vertrad het kruid en 't gras;
Schoon of de stad verzonk in 't uiterste benouwen,
Ons hoop steunde op de Kerk, en d' heilige gebouwen;
Wij riepen: "zijt getroost, laat God begaan al stil,
Jhblijft'bht ijt lil!"

40. Jehova blijft onz' borcht, om zijnes tempels wil!"
Maar ach, rampzalige! als[307] 't den Hemel woû gedogen,
Wij wierden in ons hoop te jammerlijk bedrogen,
In die vervloekte nacht, als, eer het licht opkwam,
Ons kerk aan kolen ging, en stond in lichte vlam:
Als[308] met de vlamme opsteeg ons krijten en ons kermen,
Dat God noch Engel mocht bewegen tot erbarmen;
Doen[308] al den berg, gesteld in vuur en enkel bloed,
Sloeg d' overwinner met meêdoogen in 't gemoed;
Doen riep me spâ: "vertrouwt noch kerken noch outaren,
Haar heiligheid geen stad kan voor 't verderf bewaren!"
Ik zelf ontvlood den moord, en riep luidskeels in 't vliên:
"Vlied met mij! 't is vergeefs den vijand weer te biên;
Hij heeft de stad voorlang, en houdt haar sterke wallen;
De tempel is vergaan: onz' hope is nu gevallen."
Zoo bergde ik naauwlijks 't lijf, en rukte, met dees hand,
Veel heilge schatten ongeschonden uit den brand.
Maar waarom vlood ik? ach! wat hield ik dier mijn leven?
Hadde ik mijn ziele in 't vuur des tempels opgegeven,
Als Meirus wel beraân, en als Daleus' zoon,
Of waar ik in 't hoog koor geteld bij d' ander doôn;
Zoo zoud' nooit zijn gebeurd, dat ik, gevaân, most laten
Den Heidenschen monarch de goude' en zilvren vaten,
't Scharlaken, 't reukwerk, en 't hoogpriesterlijk gewaad,
En andre ciersels: daar een booswicht, een soldaat
Zijn vingeren aan schendt: zoo waren voort mijn beenen
Begraven met den val van d' afgekeurde[309] steenen!
Nu houde ik de uitvaart van 't onzalige geslacht,
Om welkers ondergang het volk van Rome lacht,
En op de diensten smaalt, die Mozes heeft geboden,
En prijst voor onzen God een hoop verdichte Goden,
Die Abraham verzaakte: en of mij schoon genâ
Geschied is, zoo dat ik op vrije voeten sta,
Wat batet? want, waarheen dat ik mij keere of wende,
Ik zie mijn hertenleed aan Israëls ellende!
Indien ik zie rondom, ik zie hem, die ons dringt,
Eidijd htdHid id

41. En vind mij van de macht der Heidenen omringd.
Sla ik 't gezicht om leege, ik zie, hoe met den zweerde
't Huis Jacobs ligt verdelgd, de stad geslecht met d' eerde:
Ik zie van d' afgrond op nog smooken 't heerlijk slot,
Daar David vaak uit heeft den Filistijn bespot.
Heffe ik mijn lichten op, den Hemel is gesloten,
Noch draagt niet langer gunst zijn ouden bondgenooten.
de dochteê ëion, êei îan ëtaatjonffêen , êei îan joodëche îêouwen , tituë.
DE DOCHTER SION.
Gij spoken[310], die wel eer verhoogd pronkte' in de traliën
Van 't goude Blijenburg, behangen met medaliën,
Waarmeê de Godheid hadde onsterflijkt uwen rei,
Als gij zijn eersleep volgde, en droegt zijn leverei,
Als gij Gods Majesteit omschanste met uw stoeten,
En zaagt 't gesternt', de zon, en maan beneên uw voeten
Verschieten flaauwer[311], als de klaarste diamant[312]
Ons van d' uitbreidsels zendt zijn stralen overkant[313];
Die gij, getuimeld, moogt op 't aldernaauwst' vertellen,
Hoe veel van 's Hemels top schilt 't middelpunt der Hellen:
Ten waar 't lang vallen u gewiegd hadd' heel in zwijm,
Eer gij ten lesten plofte in 's afgronds vuilen slijm
En diepen zwavelpoel, die fluks is aangevlogen,
Doen vonken stoven neêr uit Gods vuurvlammende oogen;
Gij spoken! zegge ik, breekt uit uw gevangenis,
Aanschouwt, wie 't vallen nog met u deelachtig is;
Ziet, hoe die bliksem Gods mijn hemelhooge cedren,
En marbren gepolijst, ter Hellen ging vernedren,
Als ik te trotsch van nek in mijnen plicht ontbrak,
En opgeblazen naar zijn kroon en glorie stak:
Ziet, hoe die lusthof is verkeerd in een woestijne,
En herberg van 't gediert', waarin ik eenzaam kwijne!
O, strekten de oogen mij een sprongrijk[314] Siloa,
Nu ik mijn handen wringe en voor mijn borsten sla,
Enscheurmijntreurgewaad!och,ofzetranenlieten,

42. sceujteugeaadoc,oetaeete,
Wat zou mij daar een pak, een pak van 't hert afschieten!
Nu houdt de rouw, zoo 't schijnt, de dorpels toegestopt,
Een rouw, die ik al meer en meer hebbe ingekropt,
Daar ik aan stikken zal, daar ik aan moet verstikken,
Hoe flaauw bezwijkt mijn hert schier allen oogenblikken!
O wee! o wi! o wach!—hebt gij, bedrukte maagd!
Uw hert nog niet van rouw geleêgd, en uitgeklaagd,
En moogdy niet een traan tot uwen troost verwerven,
Zoo treurt u voorts in 't graf, en zoekt uw heil in 't sterven.
REI VAN STAATJONFFREN.
Wat krijgsliê komen hier, die meer zijn als gemeen?
Waar vliên wij? och! wie is 't? zijn 't hopliê?
REI VAN JOODSCHE VROUWEN.
En met een
De veldheer Titus zelf; ik zie, hij staat in 't midden.
DE DOCHTER SION.
Staatjonffren! volgt mij na, en helpt ons straf verbidden.
Aanveerdt een droef gelaat, en jammerlijk gebaar.
Slaat voor uw borst, verscheurt uw kleedren, en uw haar,
Als ik mijn stem verhef; bevochtigt met uw tranen
't Hert des verwinners: of gij zoo een weg mocht banen
Tot mededoogen; schaamt, rampzaalge rei! u niet,
Nu aan te gaan al 'tgeen de bittre nood gebiedt.
Vergeet uw oud geslacht van priesteren en vorsten
En koningen, die 't al ten strijde ontzeggen dorsten.
Ootmoedigheid u voegt; ik ga u allen voor.
God! om[315] wiens aanschijn juicht de rei van 's Hemels koor,
Mij aangenaamheid jont, druipt honig op mijn lippen,
Dat ik bewegen mag zoo zielelooze klippen,
Als zijn der vijanden onbuiglijke gemoên!

43. TITUS.
Wie knielt hier neder om t' erlangen haren zoen?
DE DOCHTER SION.
Grootmogende monarch! wilt met geduldige ooren
Ons klacht, ter zielen[316] uitgeborsten, doch aanhooren:
Wij, 't overschot des volks, die vallen u te voet,
Wij eischen geen genâ, maar dat gij met ons doet
Al 'tgeen wat u behaagt: laat vrij uw dienaars stooten
Haar degens door ons borst, die wij voor u ontblooten:
Of dat ze ons werpen van dees rotsen, scherp en steil,
En plettren ons gebeent', want 't sterven is ons heil,
De dood ons toevlucht, en haar komst, daar andre menschen
Voor schrikken, is den troost en 't zoetst', daar wij om wenschen,
Om te geraken door d' eindlooze zwarigheên,
En eens ons leed t' ontgaan; of zijdy door gebeên,
Ontzichelijke vorst! nog tot genâ te neigen,
Verzacht de penen[317] doch, die d' overwonnen dreigen.
't Van ouds beroemd geslacht, dat van de vadren daalt,
Bijna is uitgeroeid; dien lof hebdy behaald:
Een handvol blijft er, uitgeput van ongenuchten[318],
Die 't leven valt te bang, die niet doen dan verzuchten:
Erbarmt u haarder, en verschoont ze, o vorst! althans[319],
Die 't lot spaarde om te zien den val haars vaderlands!
TITUS.
Hadt gij dit voorbedacht, vermaledijde Joden!
En van uw poorten mij de sleutlen aangeboden,
Als uws stads grondvest nog haar hooge muren droeg,
Als ik om Sions kreits nog eerst mijn leger sloeg:
Gij stondt nog daar gij stondt, en van uw sterke wallen
En waar de cingel[320] nooit ter aarden neêrgevallen.
Hoe vaken[321] hebdy, met een ingeboren haat,
Mijn keizerlijke gunst en goedigheid versmaad,

44. jeejegustegoedgedesaad,
Als ik u hulde[322] aanbood, en, uit een mild ontfarmen,
U zwoer gezamentlijk voor onheil te beschermen:
Hoe menigwerven blies ik d' aftocht, alzoo ras
Gij nood leedt, als de strijd en storm op 't heetste was:
Hoe dikmaal breidelde ik mijn ongetemde benden,
Van vreeze, dat ze uw kerk en Godsdienst zouden schenden!
Nu komdy smeeken; op, staat op!
DE DOCHTER SION.
Ertsmaarschalk[323], ach!
Dat wij u kwetsten ooit is, laas! al ons beklag.
TITUS.
Nu 't glas verloopen is, nu roept men om genade.
DE DOCHTER SION.
Erbarmt des armen volks, al komet[324] vrij wat spade.
TITUS.
Zoo spade, dat er niets voor u te hopen staat.
DE DOCHTER SION.
Een welgeboren vorst zich nog erbarmen laat.
TITUS.
Een welgeboren vorst zoekt 't voordeel van den lande.
DE DOCHTER SION.
't Ontfermen voordeel brengt, gestrengheid schade en schande.
TITUS.

45. 't Ontfermen brengt ook ramp, gestrengheid voordeel toe;
Zoo houdt men 't volk in tucht.
DE DOCHTER SION.
Elk een verwenscht de roê.
TITUS.
De booswicht haat zijn straf.
DE DOCHTER SION.
Ons heeft geen straf ontbroken.
De veldheer heeft zijn leed ten uiterste gewroken.
TITUS.
Waar mijnen doortocht valt, daar eischen[325] nog te staan
Dees muiters, tot een les en spiegel voor de kwaân.
DE DOCHTER SION.
Die 't spieglen lust, beschouw dit graf vol doode beenen,
Dees omgekeerde stad, en die verstrooide steenen!
TITUS.
Licht slaat men in de wind 'tgeen zelf men niet en ziet.
DE DOCHTER SION.
Al ziet men 't niet, de faam meldt wat er is geschied.
TITUS.
De Joden voor 't gerucht nooit eenen voet verzetten.
DEDOCHTERSION

46. Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
ebookultra.com