Cilia Methods and Protocols 1st ed. 2024 Edition Edition Vito Mennella

Visit https://ebookultra.com to download the full version and
explore more ebooks
Cilia Methods and Protocols 1st ed. 2024 Edition
Edition Vito Mennella
_____ Click the link below to download _____
https://ebookultra.com/download/cilia-methods-and-
protocols-1st-ed-2024-edition-edition-vito-mennella/
Explore and download more ebooks at ebookultra.com

Here are some suggested products you might be interested in.
Click the link to download
Proteases and Cancer Methods and Protocols 1st ed. 2024
Edition Edition Salvatore Santamaria
https://ebookultra.com/download/proteases-and-cancer-methods-and-
protocols-1st-ed-2024-edition-edition-salvatore-santamaria/
AMPK Methods and Protocols 1st ed. 2018 Edition Dietbert
Neumann
https://ebookultra.com/download/ampk-methods-and-protocols-1st-
ed-2018-edition-dietbert-neumann/
Strigolactones Methods and Protocols 1st ed. 2021 Edition
Cristina Prandi (Editor)
https://ebookultra.com/download/strigolactones-methods-and-
protocols-1st-ed-2021-edition-cristina-prandi-editor/
BIB Protein Supersecondary Structure Methods and Protocols
2nd ed. Edition Kister
https://ebookultra.com/download/bib-protein-supersecondary-structure-
methods-and-protocols-2nd-ed-edition-kister/

Cell Penetrating Peptides Methods and Protocols 2nd ed.
2015 Edition Ülo Langel
https://ebookultra.com/download/cell-penetrating-peptides-methods-and-
protocols-2nd-ed-2015-edition-ulo-langel/
Auditory and Vestibular Research Methods and Protocols 2nd
ed. 2016 Edition Bernd Sokolowski
https://ebookultra.com/download/auditory-and-vestibular-research-
methods-and-protocols-2nd-ed-2016-edition-bernd-sokolowski/
High Throughput Screening Methods and Protocols 3rd ed.
2016 Edition William P. Janzen
https://ebookultra.com/download/high-throughput-screening-methods-and-
protocols-3rd-ed-2016-edition-william-p-janzen/
Polyadenylation Methods and Protocols 1st Edition Joanna
Rorbach
https://ebookultra.com/download/polyadenylation-methods-and-
protocols-1st-edition-joanna-rorbach/
Microsatellites Methods and Protocols 1st Edition
Panagiotis Madesis
https://ebookultra.com/download/microsatellites-methods-and-
protocols-1st-edition-panagiotis-madesis/

Cilia Methods and Protocols 1st ed. 2024 Edition Edition
Vito Mennella Digital Instant Download
Author(s): Vito Mennella
ISBN(s): 9781071635063, 1071635077
Edition: 1st ed. 2024 Edition
File Details: PDF, 11.92 MB
Year: 2023
Language: english

Cilia
Vito Mennella Editor
Methods in
Molecular Biology 2725
Methods and Protocols

METHODS IN MOLECULAR BIO LO GY
Series Editor
John M.

School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes:
http://www.springer.com/series/7651

For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimed
the ﬁrst to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of the
series
indexed in PubMed.

Cilia
Methods and Protocols
Edited by
Vito Mennella
Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences, University of Cambridge,
Cambridge, UK

Editor
Vito Mennella
Medical Research Council Toxicology
Unit, School of Biological Sciences
University of Cambridge
Cambridge, UK
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic) Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-3506-3 ISBN 978-1-0716-3507-0 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3507-0
©
of Springer Nature 2024
This work is subject to copyright. All rights are solely and exclusively licensed by the Publisher, whether the whole or part
of the material is concerned, speciﬁcally the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation,
broadcasting, reproduction on microﬁlms or in any other physical way, and transmission or information storage and
retrieval, electronic adaptation, computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter
developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a speciﬁc statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been
made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional afﬁliations.
This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.
Paper in this product is recyclable.

Preface
In this new volume of the Methods in Molecular Biology book series, we present step-by-
step protocols applied to cilia biology. Since the ﬁrst cilia-focused Gordon Research Confer-
ence was held 20 years ago, the research area of cilia biology has witnessed an exponential
increase in activity. Cilia are organelles displayed on most human cells playing fundamental
roles in cellular function, tissue homeostasis, and development. As primary immotile cilia,
they sense and communicate with the environment through ciliary-localized membrane
receptors, and as motile cilia, they generate ﬂow in specialized tissues
example, where they drive mucociliary clearance and in the brain ventricles where they drive
cerebral spinal ﬂuid movement. Recent studies suggest that this dichotomic distinction is
rather simplistic, with a variety of cilia types and functions identiﬁed in different tissues. This
book features several protocols for genomic, proteomics, imaging, and functional analysis
valuable for their wide applicability in different ciliated tissues to untangle this ciliary
complexity. This book focuses in particular on methods to study multiciliated cells, key
players in immune defense against pathogens, and in viral entry as evidenced by many recent
studies of SARS-CoV-2 infection in the airways. Altogether, we hope our book will provide
the reader with a valuable reference resource for both established and cutting-edge methods
to study cilia biology.
Cambridge, UK Vi to Mennella
v

Contents
Preface . .
Contributors
1 Combination of CRISPR-Cas9-RNP and Single-Cell RNAseq to Identify
Cell State-Speciﬁc FOXJ1 Functions in the Human Airway Epithelium. . . . . . . .1
Laure-Emmanuelle Zaragosi, Alize´ Gouleau, Margot Delin,
Kevin Lebrigand, Marie-Jeanne Arguel, Cedric Girard-Riboulleau,
Geraldine Rios, Elisa Redman, Magali Plaisant, Rainer Waldmann,
Virginie Magnone, Brice Marcet, Pascal Barbry, and Gilles Ponzio
2 SARS-CoV-2 Infection of Human Primary Nasal Multiciliated Epithelial
Cells Grown on Air-Liquid Interface Cultures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Maria Victoria Humbert, Christopher J. McCormick,
and Cosma Mirella Spalluto
3 A Chemically Inducible Organelle Rerouting Assay to Probe Primary Cilium
Assembly, Maintenance, and Disassembly in Cultured Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
F. Basak Turan, M. Erdem Ercan, and Elif Nur Firat-Karalar
4 Expansion Microscopy of Ciliary Proteins. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
Sohyeon Park and Xiaoyu Shi
5 Immunolabel-First-Expand-Later Expansion Microscopy Approach
Using Stable STED Dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
Dong Kong, Delgermaa Luvsanjav, and Jadranka Loncarek
6 Structural Analysis of Sperm Centrioles Using N-STORM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Abigail Royfman, Sushil Khanal, and Tomer Avidor-Reiss
7 A Novel Sandwich Method for Serial Block Face SEM Imaging of Airway
Multiciliated Epithelium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
Nobuhiro Morone, Maria Guerra Martin, Patricia Goggin,
Kirk J. Czymmek, Vito Mennella, and Jaime Llodra Gonzalez
8 Airway Cells 3D Reconstruction via Manual and Machine-Learning
Aided Segmentation of Volume EM Datasets. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
Aaran Vijayakumaran, Analle Abuammar, Odara Medagedara,
Kedar Narayan, and Vito Mennella
9 Endogenous Tagging of Ciliary Genes in Human RPE1 Cells
for Live-Cell Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Stefanie Kuhns, Alice Dupont Juhl, Zeinab Anvarian,
Daniel Wu¨stner, Lotte B. Pedersen, and Jens S. Andersen
10 Live-Imaging Centriole Ampliﬁcation in Mouse Brain Multiciliated Cells. . . . . . 167
Ame´lie-Rose Boudjema, Adel Al Jord, Anne-Iris Lemaıˆtre,
Marion Faucourt, Nathalie Delgehyr, Nathalie Spassky,
and Alice Meunier
11 Proximity Mapping of Ciliary Proteins by BioID. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Melissa Iazzi, Jonathan St-Germain, Saujanya Acharya,
Brian Raught, and Gagan D. Gupta
vii

viii Contents
12 Afﬁnity Puriﬁcation of Intraﬂagellar Transport (IFT) Proteins in Mice
Using Endogenous Streptavidin/FLAG Tags . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
Tina Beyer, Tiago Martins, Jeshmi Jeyabalan Srikaran,
Marian Seda, Emma Peskett, Franziska Klose, Katrin Junger,
Philip L. Beales, Marius Uefﬁng, Karsten Boldt,
and Dagan Jenkins
13 Primary Human Nasal Epithelial Cell Culture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
Mystica Terrance, Tarini Gunawardena, Hong Ouyang,
Julie Avolio, Wenming Duan, Sowmya Thanikachalam, and Theo J. Moraes
14 BMI1 Transduction of Human Airway Epithelial Cells for Expansion
of Proliferation and Differentiation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Ruhina Maeshima, Amy I. Jacobs, Melis T. Dalbay,
and Stephen L. Hart
15 High-Speed Video Microscopy of Ependymal Cilia in Brain
Organotypic and Cell Culture Models. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
William J. Dawes, Oriane Grant, Sam C. Reitemeier,
Sarah Tetlow, Dani Lee, Robert A. Hirst,
and Christopher O’Callaghan
16 Measuring Biophysical Properties of Cilia Motility from Mammalian
Tissues via Quantitative Video Analysis Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
Erika Causa, Ricardo Fradique, and Pietro Cicuta
17 Mucociliary Transport Device Construction and Application
to Study Mucociliary Clearance. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Patrick R. Sears and Lawrence E. Ostrowski
Index . . .

Contributors
ANALLE ABUAMMAR • Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences,
University of Cambridge, Cambridge, UK
SAUJANYA ACHARYA • Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan
University, Toronto, ON, Canada
ADEL AL JORD • Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Colle`ge de France,
CNRS 7241 INSERM U1050, PSL Research University, Paris, France
JENS S. ANDERSEN • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of
Southern Denmark, Odense M, Denmark
ZEINAB ANVARIAN • Department of Biology, University of Copenhagen, Copenhagen Ø,
Denmark
MARIE-JEANNE ARGUEL • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
TOMER AVIDOR-REISS • Department of Biological Sciences, University of Toledo, Toledo, OH,
USA; Department of Urology, College of Medicine and Life Sciences, University of Toledo,
Toledo, OH, USA
JULIE AVOLIO • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick Children, Peter
Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
PASCAL BARBRY • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
PHILIP L. BEALES • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College
London, London, UK
TINA BEYER • Institute for Ophthalmic Research, Center for Ophthalmology, University of
Tu
KARSTEN BOLDT • Institute for Ophthalmic Research, Center for Ophthalmology, University
of Tu¨bingen, Tu¨bingen, Germany
AME
´
LIE-ROSE BOUDJEMA • Institut de Biologie de l’E
´
cole Normale Supe´rieure (IBENS),
CNRS, UMR 8197, INSERM, U1024, Paris Sciences et Lettres (PSL), Research
University, Paris, France
ERIKA CAUSA • Cavendish Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK
PIETRO CICUTA • Cavendish Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK
KIRK J. CZYMMEK • Donald Danforth Plant Science Center, Department of Biology, Saint
Louis University, Saint Louis, MO, USA
MELIS T. DALBAY • Cilia Disorder Section, Genetic and Genomic Medicine Department,
UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, London, UK
WILLIAM J. DAWES • Alder Hey Children’s Hospital, University of Liverpool and UCL Great
Ormond Street Hospital, London, UK
NATHALIE DELGEHYR • Institut de Biologie de l’E
´
cole Normale Supe´rieure (IBENS), CNRS,
UMR 8197, INSERM, U1024, Paris Sciences et Lettres (PSL), Research University, Paris,
France
MARGOT DELIN • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
WENMING DUAN • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick Children, Peter
Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
M. ERDEM ERCAN • Department of Molecular Biology and Genetics, Koc¸ University,
Istanbul, Turkey
ix

´
x Contributors
MARION FAUCOURT • Institut de Biologie de l’Ecole Normale Supe´rieure (IBENS), CNRS,
UMR 8197, INSERM, U1024, Paris Sciences et Lettres (PSL), Research University, Paris,
France
ELIF NUR FIRAT-KARALAR • Department of Molecular Biology and Genetics, Koc¸ University,
Istanbul, Turkey; Koc University School of Medicine, Istanbul, Turkey
RICARDO FRADIQUE • Cavendish Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK
CEDRIC GIRARD-RIBOULLEAU • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis,
France
PATRICIA GOGGIN • Biomedical Imaging Facility, Laboratory and Pathology Block,
Southampton General Hospital, Southampton, UK
JAIME LLODRA GONZALEZ • Electron Microscopy and Ultrastructural Pathology Facility,
Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences, University of
Cambridge, Cambridge, UK
ALIZE
´ GOULEAU • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
ORIANE GRANT • UCL Institute of Child Health, London, UK
TARINI GUNAWARDENA • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick Children,
Peter Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
GAGAN D. GUPTA • Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University,
Toronto, ON, Canada
STEPHEN L. HART • Cilia Disorder Section, Genetic and Genomic Medicine Department,
UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, London, UK
ROBERT A. HIRST • Centre for PCD Diagnosis and Research, Department of Respiratory
Sciences, University of Leicester, Leicester, UK
MARIA VICTORIA HUMBERT • Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological
Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK
MELISSA IAZZI • Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University,
Toronto, ON, Canada
AMY I. JACOBS • Cilia Disorder Section, Genetic and Genomic Medicine Department, UCL
Great Ormond Street Institute of Child Health, London, UK
DAGAN JENKINS • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College
London, London, UK
ALICE DUPONT JUHL • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of
Southern Denmark, Odense M, Denmark
KATRIN JUNGER • Institute for Ophthalmic Research, Center for Ophthalmology, University of
Tu
SUSHIL KHANAL • Department of Biological Sciences, University of Toledo, Toledo, OH, USA
FRANZISKA KLOSE • Institute for Ophthalmic Research, Center for Ophthalmology, University
of Tu¨bingen, Tu¨bingen, Germany
DONG KONG • Cancer Innovation Laboratory, NIH/NCI/CCR, Frederick, MD, USA
STEFANIE KUHNS • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of
Southern Denmark, Odense M, Denmark
KEVIN LEBRIGAND • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
DANI LEE • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health & GOSH UCL BRC,
London, UK
ANNE-IRIS LEMAI
ˆ
TRE • Heart Failure Unit, Cardiology Department, Centre Hospitalier
Universitaire (CHU) Haut-Le´ve`que, Bordeaux, France
JADRANKA LONCAREK • Cancer Innovation Laboratory, NIH/NCI/CCR, Frederick, MD,
USA

Contributors xi
DELGERMAA LUVSANJAV • Cancer Innovation Laboratory, NIH/NCI/CCR, Frederick, MD,
USA
VIRGINIE MAGNONE • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
RUHINA MAESHIMA • Cilia Disorder Section, Genetic and Genomic Medicine Department,
UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, London, UK
BRICE MARCET • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
MARIA GUERRA MARTIN • Electron Microscopy and Ultrastructural Pathology Facility,
Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences, University of
Cambridge, Cambridge, UK
TIAGO MARTINS • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College
London, London, UK
CHRISTOPHER J. MCCORMICK • Faculty of Medicine, School of Clinical and Experimental
Sciences, University of Southampton, Southampton, UK; Southampton NIHR Biomedical
Research Centre, University of Southampton and University Hospital Southampton NHS
Foundation Trust, Southampton, UK
ODARA MEDAGEDARA • Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological
Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK
VITO MENNELLA • Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences,
University of Cambridge, Cambridge, UK
ALICE MEUNIER • Institut de Biologie de l’E
´
cole Normale Supe´rieure (IBENS), CNRS, UMR
8197, INSERM, U1024, Paris Sciences et Lettres (PSL), Research University, Paris, France
THEO J. MORAES • The Hospital for Sick Children, Peter Gilgan Centre for Research and
Learning, Toronto, ON, Canada
NOBUHIRO MORONE • Electron Microscopy and Ultrastructural Pathology Facility, Medical
Research Council Toxicology Unit, School of Biological Sciences, University of Cambridge,
Cambridge, UK
KEDAR NARAYAN • Center for Molecular Microscopy, Center for Cancer Research, National
Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD, USA; Cancer Research Technology Program,
Frederick National Laboratory for Cancer Research, Frederick, MD, USA
CHRISTOPHER O’CALLAGHAN • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health &
GOSH UCL BRC, London, UK
LAWRENCE E. OSTROWSKI • Marsico Lung Institute, University of North Carolina, Chapel
Hill, NC, USA; Department of Pediatrics, University of North Carolina, Chapel Hill,
NC, USA
HONG OUYANG • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick Children, Peter
Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
SOHYEON PARK • Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine,
Irvine, CA, USA
LOTTE B. PEDERSEN • Department of Biology, University of Copenhagen, Copenhagen Ø,
Denmark
EMMA PESKETT • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College
London, London, UK
MAGALI PLAISANT • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
GILLES PONZIO • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
BRIAN RAUGHT • Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network and
Department of Medical Biophysics, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
ELISA REDMAN • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
SAM C. REITEMEIER • UCL Institute of Child Health, London, UK

xii Contributors
GERALDINE RIOS • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
ABIGAIL ROYFMAN • Department of Biological Sciences, University of Toledo, Toledo, OH,
USA
PATRICK R. SEARS • Marsico Lung Institute, University of North Carolina, Chapel Hill, NC,
USA
MARIAN SEDA • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College
London, London, UK
XIAOYU SHI • Center for Complex Biological Systems, University of California Irvine, Irvine,
CA, USA; Department of Developmental and Cell Biology, University of California
Irvine, Irvine, CA, USA; Department of Chemistry and Department of Biomedical
Engineering, University of California Irvine, Irvine, CA, USA
COSMA MIRELLA SPALLUTO • Faculty of Medicine, School of Clinical and Experimental
Sciences, University of Southampton, Southampton, UK; Southampton NIHR Biomedical
Research Centre, University of Southampton and University Hospital Southampton NHS
Foundation Trust, Southampton, UK
NATHALIE SPASSKY • Institut de Biologie de l’E
´
cole Normale Supe´rieure (IBENS), CNRS,
UMR 8197, INSERM, U1024, Paris Sciences et Lettres (PSL), Research University, Paris,
France
JESHMI JEYABALAN SRIKARAN • UCL Great Ormond Street Institute of Child Health,
University College London, London, UK
JONATHAN ST-GERMAIN • Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network and
Department of Medical Biophysics, University of Toronto, Toronto, ON, Canada
MYSTICA TERRANCE • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick Children,
Peter Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
SARAH TETLOW • Alder Hey Children’s Hospital, University of Liverpool, Liverpool, UK
SOWMYA THANIKACHALAM • Program of Translational Medicine, The Hospital for Sick
Children, Peter Gilgan Centre for Research and Learning, Toronto, ON, Canada
F. BASAK TURAN • Department of Molecular Biology and Genetics, Koc¸ University, Istanbul,
Turkey
MARIUS UEFFING • Institute for Ophthalmic Research, Center for Ophthalmology, University
of Tu¨bingen, Tu¨bingen, Germany
AARAN VIJAYAKUMARAN • Medical Research Council Toxicology Unit, School of Biological
Sciences, University of Cambridge, Cambridge, UK
LAURE-EMMANUELLE ZARAGOSI • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis,
France
RAINER WALDMANN • Universite ˆte d’Azur, CNRS, IPMC, Sophia-Antipolis, France
DANIEL WU¨ STNER • Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of
Southern Denmark, Odense M, Denmark

Chapter 1
Combination of CRISPR-Cas9-RNP and Single-Cell RNAseq
to Identify Cell State-Speciﬁc FOXJ1 Functions in the Human
Airway Epithelium
Laure-Emmanuelle Zaragosi, Alize´ Gouleau, Margot Delin,
Kevin Lebrigand, Marie-Jeanne Arguel, Cedric Girard-Riboulleau,
Geraldine Rios, Elisa Redman, Magali Plaisant, Rainer Waldmann,
Virginie Magnone, Brice Marcet, Pascal Barbry, and Gilles Ponzio
Abstract
The study of the airway epithelium in vitro is routinely performed using air-liquid culture (ALI) models
from nasal or bronchial basal cells. These 3D experimental models allow to follow the regeneration steps of
fully differentiated mucociliary epithelium and to study gene function by performing gene invalidation.
Recent progress made with CRISPR-based techniques has overcome the experimental difﬁculty of this
approach, by a direct transfection of ribonucleoprotein complexes combining a mix of synthetic small guide
RNAs (sgRNAs) and recombinant Cas9. The approach shows more than 95% efﬁciency and does not
require any selection step. A limitation of this approach is that it generates cell populations that contain
heterogeneous deletions, which makes the evaluation of invalidation efﬁciency difﬁcult. We have success-
fully used Flongle sequencing (Nanopore) to quantify the number of distinct deletions. We describe the use
of CRISPR-Cas9 RNP in combination with single-cell RNA sequencing to functionally characterize the
impact of gene invalidation in ALI cultures. The complex ecosystem of the airway epithelium, composed of
many cell types, makes single-cell approaches particularly relevant to study cell type, or cell state-speciﬁc
events. This protocol describes the invalidation of
(1) Establishment of basal cell cultures from nasal turbinates, (2) CRISPR-Cas9 RNP invalidation of
FOXJ1, (3) Quantiﬁcation of
ALI cultures and single-cell RNAseq, (5) Analysis of single-cell RNAseq data from
We conﬁrm here that
provides a framework to explore other gene functions.
Key words
Nanopore sequencing, FOXJ1, Air-Liquid Interface cell culture, Single-cell RNA sequencing
Vito Mennella (ed.),
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3507-0_1,
©
1

However, gene invalidation in this model is difﬁcult and
lentivirus-delivered CRISPR-Cas9 has long been the only efﬁcient
method. Everman and colleagues have optimized the technique to
allow the robust generation of a bulk-edited airway basal cell popu-
lation from transduced cells [
]. This method is effective but
requires vector design, lentivirus production, transduction, and selection. These steps decrease the versatility of the method and
are not ﬁtted to invalidate numerous genes. A lentivirus-free tech- nique has been developed, using ribonucleoprotein complexes composed of synthetic small guide RNAs (sgRNAs) and recombi-
nant Cas9, transfected with electroporation [
]. This technique has
shown more than 95% efﬁciency and does not include a selection step. It is thus well suited for fast screening of candidate genes. We
have achieved high invalidation efﬁciency for several genes, includ- ing , which is a major transcription factor regulating motile cilium generation. We have used a mix of 3 sgRNAs targeting
FOXJ1 same cell culture. This heterogeneity makes the quantiﬁcation of invalidation efﬁciency difﬁcult. Indeed, when using a single sgRNA,
invalidation is evaluated by Sanger sequencing of PCR amplicons of the modiﬁed region. If the Sanger technique is well adapted to the sequencing of a single DNA species, it is much less efﬁcient when
the sequence of interest is a mixture of different sequences as it is
9
8
2 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
1 Introduction
The airway epithelium, which constitutes a ﬁrst line of defense of
the airways against a wide range of inhaled substances, consists of a
complex tissue composed of: multiciliated cells, projecting
hundreds of motile cilia on their apical surface, goblet cells, secret-
ing mucins on the luminal surface, club cells, secreting antimicro- bial and anti-inﬂammatory peptides, and basal cells, playing a role
in the adhesion and stability of the epithelium. Basal cells are able to
differentiate into all cell types of the epithelium both at homeostasis and during regeneration [
1, 2]. The altered balance between mul-
ticellular and mucus-producing cells is a characteristic of several chronic respiratory diseases, including chronic obstructive pulmo- nary disease, asthma, or cystic ﬁbrosis.
Airway epithelium is routinely investigated in vitro using
air-liquid culture (ALI) models from nasal or bronchial basal cells.
These 3D experimental models allow to follow the regeneration
steps of fully differentiated mucociliary epithelium [3, 4] and to
study gene function in this context. The similar cellular composi-
tion of a differentiated respiratory epithelium in the ALI model and
of nasal and bronchial biopsies establishes this model as a good
surrogate to study complex molecular and cellular mechanisms
[5]. For instance, they have been widely used recently to study
the infection by SARS-CoV-2 virus [6, 7].

the case here. We describe a quantiﬁcation tool that takes into
account the diversity of sequences produced by the CRISPR-Cas9
RNP technique. This method is based on a full-size high-through-
put sequencing on a Flongle Flow Cell (Oxford Nanopore). Nano-
pore sequencing is a unique scalable technology that enables real-
time analysis of long DNA or RNA fragments. After PCR ampliﬁ-
cation and puriﬁcation of DNA fragments located around the
targeted sites, DNA samples are bound to a motor protein and an
adapter sequence. This motor protein allows nucleic acids strands
to go through a nanopore which modiﬁes an electrical current. A
base calling step translates current measurement into base
sequences. Real-time data streaming allows a fast generation of
the full analysis. Different formats of ﬂowcells are provided by this
company. The Flongle corresponds to its smallest scale. It allows
the production of 1,000,000 raw reads in 24 h for less than
70 euros.
CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 3
After conﬁrmation of
ter the assessment of cell type-speciﬁc effects by single-cell RNAseq
(scRNAseq). This technique is very well suited to evaluate the
functional effects of gene invalidation in the airway epithelium as
it is a complex ecosystem. It allows to quantify changes in cell type
distribution as well as changes in gene expression proﬁles for a given
cell type and identiﬁes invalidation-speciﬁc cell states. We conﬁrm
here that
multiciliated cells and provides a framework to explore other gene
functions.
The protocol detailed in this chapter describes the invalidation
of
lishment of basal cell cultures from nasal turbinates, (2) CRISPR-
Cas9 RNP invalidation of , (3) Quantiﬁcation of
invalidation efﬁciency by Nanopore sequencing, (4) Dissociation
of ALI cultures and single-cell RNAseq, (5) Analysis of single-cell
RNAseq data from -invalidated cells.
2 Materials
2.1 Cell Culture of
Airway Cells from
Nasal Turbinates
1. Complete HBSS: To 500 mL, Hanks’ Balanced Salt Solution
(HBSS) (with red phenol, without calcium/magnesium), add
Hepes (liquid solution for culture cell only, 25 mM ﬁnal),
penicillin (200 U/mL), streptomycin (200 g/mL), gentami-
cin (50 g/mL), and amphotericin B (2.5 g/mL).
2. Pronase solution (prepare fresh): weight approximately 20 mg
of protease XIV (Merck Catalog #P5147) with a clean spatula
on a precision scales and place in an Eppendorf tube (tare the
tube, then add the protease powder, and weight the powder
directly within the tube). Add 1 mL of complete HBSS, pipet

4 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
up and down and transfer into a 50 mL tube. Adjust the ﬁnal
volume with cold complete HBSS to achieve 1 mg/mL ﬁnal
concentration, rinse the initial Eppendorf tube with HBSS,
never vortex, mix by pipetting or inverting the tube. Filter
the solution through a 0.22 m ﬁlter.
3. Inactivation medium: to 450 mL of DMEM high glucose, add
heat-inactivated fetal bovine serum (10% ﬁnal), add penicillin
(100 U/mL), streptomycin (100g/mL), gentamicin (50g/
mL), and amphotericin B (2.5 g/mL).
4. Collagen type I-coated culture ﬂasks. Dilute rat tail collagen
(Merck Catalog #C3867) to 50 g/mL in sterile water. Put
7 mL per 75 cm
2
ﬂask and let sit overnight at room tempera-
ture or 4 h at 37
Phosphate Buffered Saline, completely aspirate any residual
liquid. Flasks can be stored at 4
5. Proliferation medium I: PneumaCult
Technologies Catalog #5008): Prepare cell proliferation
medium by adding the kit supplement to the basal medium.
Add penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 g/mL), gen-
tamicin (50 g/mL), and amphotericin B (2.5 g/mL). Store
at 4
and add Rock-Inhibitor Y27632 (10 M) just before use.
6. Trypsin-EDTA (0.05%) (Gibco) (
7. 75 cm
2
Tissue culture ﬂasks.
8. 100 mm culture dishes.
9. Disposable sterile plastic forceps.
10. 50 mL sterile conic tubes.
11. 21G needles with 10 mL sterile syringes.
12. Humidiﬁed tissue culture incubator at 37 2.
13. 37
14. Swing rotor centrifuge.
2.2 Invalidation with
CRISPR-Cas9
RiboNucleoParticles
(RNP)
1. Recombinant Cas9 2NLS nuclease at 20 M (Synthego Cata-
log #Cas9 2NLS nuclease).
2. Small guide RNA (sgRNA) mix for : Gene Knockout Kit
v2 (Synthego) (
tive Control Human TRAC, mod-sgRNA, 1.5 nmol, Multi-
guide, Synthego). Reconstitute sgRNA mixes by adding 15 L
TE buffer in each lyophilized sgRNA mix to reach a ﬁnal
concentration of 100 M. Negative controls: Synthego Nega-
tive Control, Scrambled sgRNA#1, and Scrambled sgRNA#2,
1 nmol per tube. Reconstitute each negative control sgRNA
with 10L and pool them. Reconstituted sgRNA can be stored
at20

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 5
3. TE Buffer.
4. Amaxa P3 primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S (Lonza Cata-
log #V4XP-3032).
5. 6-well tissue culture plates, coated with type I collagen (1 mL
per well of 50 g/mL solution as prepared above).
6. Proliferation medium II: PneumaCult
(Stemcell Technologies Catalog #5040): Prepare cell prolifera-
tion medium by adding the kit supplement to the basal medium. Add penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 g/
mL), gentamicin (50 g/mL) and amphotericin B (2.5 g/ mL). Store at 4
37
7. Trypsin-EDTA (0.05%) (Gibco) (
8. Collagen type IV-coated inserts: To 10 mg (one vial) of colla- gen IV (Merck catalog #C7521), add 4 mL of acetic acid 0.25%
(0.04 M) and let sit overnight at 4
to a ﬁnal solution at 1 mg/mL (ﬁnal volume 10 mL). Add
15 mL of sterile water then 25 mL EtOH 60% (prepared with
sterile water). Final solution should be at 0.2 mg/mL. Prepare 1 mL aliquots and store at20 L of collagen
ﬁnal solution on each 6.5-mm
2
Transwell
®
(0.4 m pore poly-
ester membrane, Corning catalog #3470) and let stand for 2 h
at room temperature, without laminar ﬂow to avoid evapora-
tion. After incubation, return to sterile environment and aspi-
rate collagen solution and keep under laminar ﬂow until completely dry.
9. Differentiation medium: PneumaCult cell Technologies Catalog #): Prepare cell differentiation
medium by adding the kit supplement to the basal medium.
Add penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 g/mL), gen-
tamicin (50 g/mL), and amphotericin B (2.5 g/mL). Store at 4
before use.
10. QuickExtract
11. RIPA buffer (Thermo Scientiﬁc catalogue #89900) and prote-
ase inhibitors (Thermo Scientiﬁc catalogue #A32963).
12. 4D-Nucleofector System with X Unit (Lonza Catalog #AAF-
1002X).
2.3 Sequence
Analysis of Deletions
by Nanopore
Sequencing
1. FOXJ1
region: Fd 5
TGTAGATGGCCGACAGGG-3
2. Nuclease-free water.
3. Primestar GXL DNA Polymerase (Takara).

6 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
4. SPRIselect beads (Beckman Coulter).
5. Freshly prepared 80% ethanol.
6. Qubit dsDNA BR Assay Kit (Thermo Fischer Scientiﬁc).
7. High sensitivity DNA Assay (Agilent #5067-4626).
8. NEBNext
®
Ultra
England Biolabs Catalog #E7546).
9. NEBNext Quick Ligation Module (New England Biolabs Cat-
alog #E6056).
10. Native Barcoding Expansion 1
Technologies Catalog #EXP-NBD104 and EXP-NBD114).
11. Ligation Sequencing Kit (Nanopore Technologies Catalog
#SQK-LSK110).
12. Flongle Sequencing Expansion (Nanopore Technologies Cat-
alog #EXP-FSE001).
13. Flongle Flow Cell (Nanopore Technologies Advanced Pack
FLGMiniSP).
14. 0.2 mL PCR-grade tube strips.
15. Thermal cycler such as Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo
Fisher Scientiﬁc Catalog #4375786).
16. Magnetic separator, suitable for 0.2 and 1.5 mL
Eppendorf tube.
17. Qubit ﬂuorometer (Thermo Fisher Scientiﬁc).
18. Bioanalyzer 2100 (Agilent).
2.4 Dissociation of
Air-Liquid-Interface
Cell Cultures for
Single-Cell RNAseq
Analysis
1. Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Pronase solution (prepare fresh): weight approximately 20 mg
of protease XIV (Merck Catalog #P5147) with a clean spatula
on a precision scales and place in an Eppendorf tube (tare the
tube, then add the protease powder, and weight the powder
directly within the tube). Add 1 mL of complete HBSS, pipet
up and down and transfer into a 50 mL tube. Adjust the ﬁnal
volume with cold complete HBSS to achieve 1.5 mg/mL ﬁnal
concentration, rinse the initial Eppendorf tube with HBSS,
never vortex, mix by pipetting or inverting the tube. Filter
the solution through a 0.22 m ﬁlter (
3. Inactivation buffer: prepare a solution of 2% Bovine Serum
Albumin (BSA) in HBSS, ideally from a RNAse-free 10% BSA
solution.
4. Wash buffer: dilute the 2% BSA solution to 1% BSA in HBSS.

This method details isolation of basal cells from whole nasal turbi-
nates that have been resected during nasopharyngeal surgeries
(turbinectomies, septoplasties, reconstruction after trauma) of
healthy patients (
TM
-
Ex medium for seeding and proliferation, supplemented with
CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 7
2.5 Multiplexed Cell
Suspension
Preparation and
Single-Cell RNAseq
1. Wash-resuspension buffer: dilute the 2% BSA solution to 0.04%
BSA in PBS.
2. Cell Multiplexing Oligos (CMOs) (10
Kit Set A, Catalog #1000261), at room temperature before
use. Vortex 5 s at maximum speed and centrifuge brieﬂy for 5 s
(
3. NucGreen™
catalog # R37109).
4. Quick-Read 10 Chamber Slide (Globe Scientiﬁc Catalog
#3805).
5. Cell strainers: €Uberstrainer 15 m (PluriSelect Catalog #43-
70015-03).
6. Chromium Next GEM Single Cell 3
Index) with Feature Barcode technology for Cell Multiplexing
(10x Genomics, Catalog #CG000388).
7. Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit (10x Genomics, Catalog #1000127).
8. 3
9. Dual Index Kit TT Set A (10x Genomics, Catalog #1000215).
10. Dual Index Kit NN Set A (10x Genomics, Catalog #1000243).
11. High sensitivity DNA Assay (Agilent #5067-4626).
12. Countess II FL automated cell counter (Thermo Fisher Scien- tiﬁc Catalog #AMQAF1000) with Countess slides.
13. Bioanalyzer 2100 (Agilent).
14. Swing rotor centrifuge.
15. Thermal cycler such as Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo
Fisher Scientiﬁc Catalog #4375786).
16. Illumina High-throughput Sequencer such as NextSeq 2000.
2.6 Standard
Analysis of scRNAseq
with Cell Ranger and
Seurat Pipelines
1. Cell Ranger (version 6.0.2 was used here): https://support.10
xgenomics.com/single-cell-
downloads/6.0
2. Seurat R package (version 4.0.3 was used here): https://
satijalab.org/seurat/articles/install.html
3 Methods
3.1 Cell Culture of
Airway Cells from
Nasal Turbinates

Y27632 but can be replaced by PneumaCult
TM
-Ex Plus medium.
PneumaCult
TM
-Ex medium allows better evaluation of cell con-
ﬂuency because cells remain cuboidal and homogenously
distributed in tissue culture ﬂasks, as opposed to cells maintained
in PneumaCult
TM
-Ex Plus medium, which generate clone-like
morphology of the cell culture, making conﬂuence evaluation
difﬁcult.
8 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
1. At the hospital, place freshly resected turbinates in a 50 mL
tube containing 20 mL of complete HBSS and keep at 4
until dissociation (turbinates can be stored up to 48 h).
2. Under a cell culture cabinet, with adequate waste management,
discard the complete HBSS and rinse the turbinate with 20 mL
cold complete HBSS 3 times.
3. Place the turbinate in a new 50 mL tube containing approxi- mately 20 mL of freshly prepared and cold dissociation
medium.
4. Incubate overnight at 4
5. Carefully discard the dissociating medium and gently transfer
the turbinate into a 100 mm diameter culture dish.
6. Add 10 mL of inactivation buffer and shake the turbinate to
remove the epithelial layer with the use of disposable plastic forceps. Cells should come out of the turbinates in thin layers.
Pipet the medium and place in a new 50 mL tube. Repeat twice, for a total of 30 mL inactivation medium.
7. Centrifuge at 150 g for 5 min at room temperature.
8. Dissociate the pellet containing the cells by pipetting up and
down with 10 mL inactivation medium.
9. Centrifuge at 150 g for 5 min at room temperature.
10. Resuspend the pellet containing the cells in 10 mL of prolifer-
ation medium I and dissociate the cell aggregates by gently
passing the cell suspension through a needle (21G) with the
help of a 10 mL syringe. Perform 3 passages within the needle.
11. Seed the cells on collagen-type I-coated-75 cm
2
ﬂasks in pro-
liferation medium. The number of ﬂasks per turbinate depends
on the quantity of cells released by each tissue. Generally, cells
from one turbinate are distributed into 2
seeding, cells should be easily identiﬁable, and should reach
70
12. Incubate in a humidiﬁed tissue culture incubator at 37
5% CO
2.
13. Change medium 24 h after seeding, then every other day until
cells reach 70

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 9
+
+
Nucleofection
Cell seeding and proliferation
(2-3 days)
Nasal turbinate dissociation
Cell seeding and proliferation
(3-5 days)
Cell dissociation
Combinaison with Cas9
and sgRNAs
Cell dissociation DNA extraction of excess cells
+
+
Nucleofection
Cell seeding and proliferation on inserts (2-3 days)
Combinaison with Cas9 and sgRNAs
Differentiation (21-28 days) DNA extraction
Air-liquid Interface
Fig. 1
3.2 Invalidation with
CRISPR-Cas9
RiboNucleoParticles
(RNP)
To obtain a maximum invalidation effect, 2 rounds of transfection
are performed.
Use cells as prepared in Subheading 3.1, with a maximum of
80% conﬂuency. High conﬂuency can reduce invalidation efﬁciency
(
6.5 mm
2
inserts per target gene and should be upscaled accordingly
for more inserts. One condition containing neither sgRNA nor
Cas9 is recommended. A negative control (pool of Scrambled
sgRNAs) and a positive control (TRAC sgRNA mix) are also
recommended. The workﬂow is described in Fig.
1.
1. The day before CRISPR-Cas9 RNP invalidation, refresh the culture medium of cells (Proliferation medium I).
2. One hour before starting the ﬁrst round of invalidation pro-
cess, put 2 mL of proliferation medium II in every well of a
collagen I-coated 6-well plate that is needed. Place the plate in a humidiﬁed tissue culture incubator at 37
2.
Use one well per targeted gene.

10 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
Table 1
Reagent mixes for a first round of CRISPR/Cas9 RNP nucleofection
Blank conditionTarget condition
SgRNA (100 0 2.5
Recombinant Cas9 (20 0 7
Nucleofector solution P3 10 0.5
Total volume 10 10
3. Thirty minutes before starting the invalidation process, place
PBS, inactivation medium and proliferation medium II in a
37
4. Prepare sgRNA-Cas9 mixes at a 2:1 ratio. In a 1.5 mL tube,
prepare the mixes indicated in Table 1. Incubate for at least
10 min at room temperature.
5. Cell preparation: to detach the cells, rinse the cell layer with 10 mL of PBS, add 5 mL of trypsin, place in the incubator for
5 min. Collect the cells that have detached, place them in a 50 mL tube and neutralize the trypsin with 20 mL of inactiva-
tion buffer. Some cells may remain attached to the ﬂask, thus
proceed to a second round of trypsinization (usually 1 min). It
is better to perform 2 short trypsinization rounds rather than a
long one. Spin the cells at 150 g for 5 min. Aspirate the
supernatant and resuspend cells in 5 mL of PBS. Count the
cells. Select the volume of cells needed for total experiment
(150,000 cells per targeted sgRNA, 150,000 cells for the blank
condition). Spin at 150 g for 5 min. Aspirate supernatant.
Resuspend the cells in nucleofector P3 buffer, with the appro-
priate volume for the total number of conditions (20 LofP3
buffer per condition).
6. First round of nucleofection: For each target gene, mix 20 L
of cells in P3 buffer (from point 5) with 10 L of sgRNA/Cas9 mix (from point 4). Carefully pipet 30 L of the mix into one
Nucleofector cuvette, avoiding bubbles. Place the cuvettes in the 4D-Nucleofector and run program DC-100.
7. Cell recovery and culture: Add 100 L of 37
proliferation medium II in each Nucleofector cuvette contain-
ing the cells, and recover the total volume (130 L) of each cuvette by pipetting twice carefully. Cells are fragile at this point; it is important not to pipet too much. Place the
130 L of cells into a well of the equilibrated 6-well plate
containing 2 mL proliferation medium II. Leave the cells in
culture at 37
CRISPR, cells should proliferate until 60

f
f
CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 11
Table 2
Reagent mixes for a second round of CRISPR/Cas9 RNP nucleofection
Blank conditionTarget condition
SgRNA (100 0 7.5
Recombinant Cas 9 (20 0 21
Nucleofector solution P3 30 1.5
Total volume 30 30
8. One hour before starting the second round of Nucleofection,
equilibrate collagen IV-coated cell culture inserts by placing
respectively 650 L of proliferation medium II into
the basal part and the apical part of each insert. For each
targeted gene, 6 inserts (seeding of 50
should be prepared. In a 1.5 mL Eppendorf, place 600 L
proliferation medium II, and place in a humidiﬁed tissue cul-
ture incubator at 37
2.
9. Thirty minutes before starting the invalidation process, place
PBS, inactivation medium and proliferation medium II in a
37
10. Prepare sgRNA-Cas9 mixes at a 2:1 ratio. In a 1.5 mL tube,
prepare the mixes indicated in Table 2. Incubate at room
temperature for at least 10 min.
11. Prepare cells like in point 5, from cells prepared at point
7, taking care of keeping each cell suspension from each tar-
geted gene separated, and adjusting trypsin volumes for 6-well
plates. Count cells and select the volume of cells needed for the
total experiment (150,000 cells per Nucleofector cuvette). Ideally, 450,000 cells are used per targeted gene (3 cuvettes).
This number of cells should be easily recoverable from each
well 3 days after the ﬁrst round. After centrifugation as in point
5, aspirate the supernatant and resuspend cells with the total
volume of P3 solution needed per targeted gene (60 Li
450,000 cells, aiming at 3 Nucleofector cuvettes).
12. Second round of Nucleofection: for each target gene, mix
60 L of cells in P3 buffer (from point 11) with 30 Lo
sgRNA/Cas9 mix (from point 10) (total 90 L). Carefully
pipet 30 L of the mix into each of the 3 Nucleofector cuvettes
per targeted gene, avoiding making bubbles. Place the cuvettes
in the 4D-Nucleofector and run program DC-100.
13. Cell recovery and culture: pipet 100 L of proliferation
medium II from the 1.5 mL Eppendorf tube containing the 600 L of 37
place in each Nucleofector cuvette containing the cells.

12 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
Recover the total volume (130L) of each cuvette by pipetting
twice carefully and place the 130 L of cells into the 1.5 mL
tube. Cells are fragile at this point; it is important to not pipet
too much. Proceed identically for all 3 cuvettes used for each
targeted gene, placing the cell suspension into the same
1.5 mL-tube. The ﬁnal volume for each targeted gene should
be 690 L. Pipet 110 L of this suspension onto the apical side
of each of the equilibrated cell culture insert, making a total of
160 L at the apical side.
14. If more than 450,000 cells were recovered per well, pellet them
and lyse in Quick Extract buffer for DNA extraction.
15. Cell differentiation at the air-liquid interface: replace prolifera-
tion medium II every other day until reaching 100% con-
ﬂuency, which is usually achieved within 4
the basal side medium by differentiation medium and aspirate
the apical side medium to set up the air-liquid interface.
Change medium every other day until cell differentiation is
complete, which is usually achieved in 3 weeks. Differentiation
can be assessed by cilia and mucus labeling by
immunocytochemistry.
16. DNA extraction: once full differentiation is achieved, lyse cell
layers from 2 inserts with 80 L Quick Extract buffer for each.
Place the tubes in a block heater at 68
15 s, then return to the block heater at 97
can be stored at20
17. Protein extraction: once full differentiation is achieved, lyse cell
layers from 2 inserts with 150 L RIPA buffer (supplemented
with protease inhibitors) (
3.3 Evaluation of
Invalidation with
Nanopore Sequencing
The use of sgRNA mixes containing 3 distinct guide sequences
induces several deletions in the DNA sequence of the targeted
gene. To characterize and quantify these deletions, genomic DNA
is ﬁrst PCR-ampliﬁed with primers that are designed upstream and
downstream of the sequence encompassing the sgRNAs. Usually,
the targeted region is less than 500-nt long, so PCR amplicons are
usually between 500 and 700 nt long. The PCR product is ﬁrst
evaluated by regular agarose or capillary electrophoresis (Bioanaly-
zer or Tapestation). Then, amplicons are sequenced using a Nano-
pore Technologies Flongle device.
1. PCR amplify target regions: In 0.2 mL PCR-grade tubes,
assemble the primary PCR reaction for each DNA sample as
indicated in Table 3. Incubate tubes in a thermal cycler using
the following cycling conditions: 10 s at 98 98
at 68

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 13
Table 3
Reagent mixes for PCR amplification of target regions
Reagent Volume (
Genomic DNA in Quick Extract buffer 4
PrimeSTAR GXL premix 25
Forward primer (5 1
Reverse primer (5 1
Nuclease free water 19
Total volume 50
2. Puriﬁcation of PCR amplicons: 50 L of homogenized SPRI-
select beads are added to each PCR reaction and mixed by
pipetting. Incubate for 5 min at room temperature. Place on
a magnet until eluate is clear and colorless. Keep the tube on
the magnet and pipette off the supernatant. Keeping the tube
on the magnet, wash the beads with 200 L of freshly prepared
80% ethanol without disturbing the pellet. Remove the ethanol
using a pipette and discard. Repeat the previous wash. Spin
down quickly and place the tube back on the magnet. Pipette
off any residual ethanol. Allow to dry for about 10 s, with no
over drying to avoid pellet cracking. Remove the tube from the
magnetic rack and resuspend the pellet in 15 L of nuclease-
free water. Incubate for 5 min at room temperature. Place the
tube on a magnet until the eluate is clear and colorless for at
least 1 min. Pipet the eluate and place into a clean 0.2 mL
PCR tube.
3. Quantiﬁcation and characterization of the PCR amplicons:
quantify 1 L of eluted sample with a ﬂuorescent assay such
as Qubit. To conﬁrm the size of the PCR amplicon, perform a
High Sensitivity DNA Assay with 1 L of each PCR product (diluted to 500 pg/L), using the Bioanalyzer device.
4. Sequencing library preparation: 300 ng DNA were end
repaired with the NEBNext
®
Ultra
Tailing Module (New England Biolabs) and processed for
barcoding with the Native barcoding kit (barcodes 1 to
24 depending on the number of samples). Sequencing-adapter
ligation was performed with the Quick Ligation Kit (New
England Biolabs) and the Ligation Sequencing Kit (Nanopore
Technologies) as detailed in the instructions for the Ligation
Sequencing Kit (Nanopore Technologies). 25 ng of ligated
library were loaded onto each Flongle ﬂow cell following the
manufacturer’s instructions (Nanopore Technologies manual
NBE_9065_v109_revAK_14Aug2019).

14 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
Basecalling is performed by MinKNOW
runs all of Oxford Nanopore’s sequencing devices. Open
source basecallers can also be used (https://github.com/
nanoporetech). Reads with Q score lower than 6 were
discarded.
5. Mapping of reads and quantiﬁcation of invalidation: sequenc-
ing reads are mapped to the current Reference Human
Genome (Human GRCh38/hg38) with minimap2. Resulting
.bam ﬁles are then explored in the genomic region
corresponding to the targeted region for each gene. This
region ranges from100 bp relative to the most downstream
sgRNA to +100 bp to the most upstream sgRNA. Within this
region, make the sum of all sequencing reads that have dele-
tions of at least 8 bp compared to the reference genome. This
8 bp threshold was chosen because it is the minimal size dele-
tion which is not detected in control (scrambled) condition,
due to sequencing errors. To obtain invalidation efﬁciency for
each targeted gene, make the ratio between the sum of deleted
reads and the sum of the total reads (Fig.
2). This quantiﬁcation
can be achieved with the script detailed here: https://github.
com/ucagenomix/CrispRstats (
Figure 2a shows the efﬁciency of the
genomic and protein level.
3.4 Dissociation of
Air-Liquid-Interface
Cell Cultures for
Single-Cell RNAseq
Analysis Cell dissociation is performed on fully differentiated ALI cultures.
The number of inserts to dissociate for each condition depends on
the insert format and the culture medium. Typically, on 6.5 mm
inserts, and PneumaCult
TM
-ALI medium, up to 1 million cells can
be recovered per insert (
includes sample multiplexing, which reduces single-cell costs and
batch effect. This method requires a minimum of 500,000 cells per
condition or replicate. Also, before performing single-cell RNAseq,
it is best to monitor known effects of target gene invalidation. In
the context of , gene invalidation is checked at the genomic
DNA and protein level and
thelium is evaluated with motile cilium staining with an anti-
acetylated alpha-tubulin antibody. This method is not detailed
here as it is outside of the scope of this chapter, and has been
extensively described by many studies on ALI cultures of the airway
epithelium. Figure
2d shows that
tures as described above impairs the formation of motile cilia.
1. Wash each insert with HBSS (200 L on the apical side and
500 L on the basal side).
2. Apply dissociation buffer (200 L apical, 500 L basal) and
incubate for 6 to 16 hours at 4
24-well plate. From this step, cells should be kept at 4
ice, unless speciﬁcally mentioned.

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 15
sgScrambled
sgFOXJ1
sgFOXJ1
reads
Gene
sgFOXJ1 (1)
sgFOXJ1 (2)
sgFOXJ1 (3)
A
BC
Number of reads
Size of deletion
Scrambled sgRNA
FOXJ1 sgRNA
sgScrambled sgFOXJ1
FOXJ1
GAPDH
sgScrambled sgFOXJ1
D
Acetylated
Tubulin
0
5000
10000
15000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
1140
0
20000
25000
Fig. 2 a) View of the targeted region of
in Integrated Genome Viewer. Top panel shows coverage for control (Scrambled sgRNA) and
tion (sg
position of sgRNAs. (b
blot showing FOXJ1 invalidation. (d
subjected to scrambled sgRNAs or
3. Carefully pipet up and down the detached cell layer with a
1000 L micropipette set on 180 L, then with a 200 L
micropipette, to mechanically dissociate the cell layer.
4. Transfer cell in a cell culture well from the same plate, not
containing any insert. Pipet 200 L of dissociation medium
from the basal part of the insert, and use this volume to wash
the apical part, trying to pipet as many remaining cells as
possible. Repeat once.
5. Put the plate under an inverted microscope to check dissocia-
tion (Fig. 3a). Most cells should be visible as singlets; few
doublets or clumps might remain. If most cells are not singlets, pipet up and down 5 times and return at 4
minutes. After this incubation time, pipet up and down 5 more

16 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
Fig. 3 a
end of enzymatic incubation and mechanical dissociation. (b
cell doublets. (c
with Hoechst 33342 and dead cells are stained with NucGreen 488. (d
with dead cell identiﬁcation (GFP ﬁlter). Scale bars: 30
times and check under the microscope. Cell dissociation is best
appreciated if a 10 L aliquot of cell suspension is observed in a
slide, such as a Quick-Read 10 Chamber Slide (Globe Scientiﬁc
Catalog #3805).
6. Once the cells are sufﬁciently dissociated, pipet up and down,
transfer the cell suspension (600 L per insert) in a 1.5 mL
microtube and add 400 L inactivation buffer.
7. Spin 5 min at 200 g at 4
8. Resuspend in 1 mL wash buffer.
9. Spin 5 min at 200 g at 4
3.5 Multiplexed Cell
Suspension
Preparation for Single-
Cell RNAseq Analysis
1. Resuspend in 1 mL Wash-resuspension buffer and count cells
using an automated cell counter. If starting from less than
1 million cells, resuspend ﬁrst in 500 L, count cells, then
adjust volume to 1 mL Wash-resuspension buffer.
2. Spin 5 min at 300 g at 4

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 17
3. Resuspend each cell suspension in 100L CMO, taking care to
note which CMO is applied to which cell suspension. Incubate
for 5 min at room temperature.
4. Add 1.4 mL of Wash-resuspension buffer.
5. Spin 5 min at 400 g at 4
6. Remove supernatant completely and resuspend the pellet in
1.5 mL of Wash-resuspension buffer.
7. Repeat
8. After last spin, resuspend cells in Wash-resuspension buffer in a volume to be determined according to the starting number of
cells. A ﬁnal cell concentration of 1500 cells per L should be
aimed at. For instance, if starting from 1 million cells, consid-
ering 20 to 50% cell loss, the pellet should be resuspended in
approximately 350 L.
9. Measure cell concentration of individual samples and pool cell
suspensions aiming at identical cell numbers for each condition
(
50,000 cells from the control condition and the volume
corresponding to 50,000 cells from the -invalidated
condition (
10. Filter cell suspension through a 15 m cell strainer (€Uberstrainer).
11. Measure cell concentration with an automated counter allow- ing measurement of cell viability. For instance, use Countess II
FL cell counter with ethidium homodimer-1 (EthD-1, red
ﬂuorescence of dead cells) or NucGreen™
robes
turer’s instructions (Fig.
3b, d). Viability should be above
90%. Optimal cell concentration depends on the targeted num-
ber of cells. Generally, aiming at 800 to 1200 cells per microli-
ter ﬁt most targeted cell numbers. Calculate the cell suspension
volume to be included according to the targeted ﬁnal cell
numbers, according to the Chromium Next GEM Single Cell
3
12. Load a 10x chromium chip G carefully following instructions
of the Chromium Next GEM Single Cell 3
recover Gel Bead-in-Emulsion (GEMs).
13. Prepare and sequence libraries carefully following instructions
of the Chromium Next GEM Single Cell 3
(Dual Index) with Feature Barcode technology for Cell Multi-
plexing #CG000388 (CG000388_ChromiumNextGEMSin-
gleCell3).
Aim at 25,000 to 50,000 reads per cell for sufﬁcient sequenc-
ing saturation. For airway cells, 50,000 reads per cell are highly
recommended. For the cell multiplexing Library, aim at a
minimum of 5000 read pairs per. For sequencing, use the

Use the following format for the .csv ﬁle:
[Header]
18 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
following cycles: 28 cycles for Read 1, 10 cycles for i7 Index,
10 cycles for i5 Index, and 90 cycles for read 2 (
and
3.6 Standard
Analysis of scRNAseq
with Cell Ranger and
Seurat Pipelines
We describe here a typical scRNAseq analysis from 10X genomics
data using pipelines that could be substituted with equivalent tools
(). Cell Ranger is the commercial software provided by
10X Genomics. If using sample multiplexing with CMOs, “Cell
Ranger multi” should be used as this software will automatically
detect CMO sequencing and separate multiplexed samples. Cell
clustering analysis and plotting can be performed under R with
the Seurat pipeline (https:/ )
[10, 11].
1. Perform run demultiplexing by using the following command line on a Linux server:
cellranger-6.0.2/cellranger mkfastq --run
RUN_NAME/ -- csv
DATE.csv --output-dir
MENT_REF --localcores
IEMFileVersion,4
Investigator Name,Research Team
Experiment Name,10x
Date,XX/XX/XX
Workﬂow,GenerateFASTQ
Application,NextSEQ FASTQ Only
Assay,TruSeq HT
Description,sample sheet
Chemistry,Default
[Reads]
28
55
[Settings]
[Data]
Sample_ID,Sample_Name,Sample_Plate,Sample_Well,
I7_Index_ID,index,Sample_Project,Description

Use the following format for the .csv ﬁle:
[gene-expression]
If no CMO are used,Cell Ranger count should be run with the
following command line:
cells
CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 19
sample_1,sample_1,,,SI-GA-D12,SI-GA-D12,,
multiplex_1,multiplex_1,,,SI-GA-E4,SI-GA-E4,,
2. Perform mapping with Cell Ranger multi by using the follow-
ing command line:
cellranger-6.0.0/cellranger multi --id
csv
reference,cellranger_references/reference/
[libraries]
fastq_id,fastqs,feature_types
sample_1,DATE_10x_ EXPERIMENT _REF/,Gene Expression
multiplex_1,DATE_10x_ EXPERIMENT _REF/,Multiplexing
Capture
[samples]
sample_id,cmo_ids
sample1,CMO301|CMO301
sample2,CMO303|CMO302
cellranger-6.0.2/cellranger count --fastqs
EXPERIMENT_REF/ --sample
--transcriptome
3. Cell Ranger output description: after read mapping and gene annotation, Cell Ranger estimates the number of cells that are present in each sample by considering as “empty”, droplets
having less than 5 UMIs and also uses the RNA proﬁle of
each remaining barcode to determine if it is an “empty” or a
cell-containing droplet [
12]. Figure 4a shows a barcode rank
plot, which represents the UMI counts as a function of barcode
numbers. UMI are “Unique Molecular Identiﬁers” that repre-
sent RNA counts numbers without ampliﬁcation bias [13]. Bar-
code numbers represent unique droplet barcode identiﬁers,
which can be cell-associated or not (background). Cell Ranger
also performs a secondary gene analysis, providing clustering

C
20 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
suprabasal
deuterosomal
multiciliated
basal
cycling basal
secretory
goblet
rare cells
basal−club
intermed
sgScrambled
sgFOXJ1
A
B
Fig. 4 a
websummary displaying cell number estimation, barcode rank plot, and quality
metrics. (
composed of ALI cultures subjected to scrambled sgRNAs or
(c
ALI cultures subjected to scrambled sgRNAs or
decrease of multiciliated cell numbers in the
analysis and dimensionality reduction plots. The Cell Ranger
pipeline generates several outputs among which: (1) an indexed
BAM ﬁle containing position-sorted reads aligned to the
genome and transcriptome, as well as unaligned reads, (2) fea-
ture-barcode matrices that will be used in tertiary analysis.
4. Cell ﬁltering based on quality metrics: using the Seurat pipe-
line, ﬁlter cells of low quality. In scRNAseq analysis on ALI
cultures, the usual ﬁltering parameters are: fraction of mito-
chondrial genes 0.25 and fraction of dropout genes 0.97.
Dropouts are gene with a “0” value. Thus, every cell with more than 25% mitochondrial genes or more than 97% dropout
genes will be ﬁltered out.

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 21
5. Data integration: in order to compare several conditions from
the same experiment, for instance, the control and -
invalidated condition, data integration is necessary. Here is
shown the result of standard integration from the Seurat pack-
age (Fig. 4a, b). The main functions are: SelectIntegrationFea-
tures() (generally selecting 3000 features),
FindIntegrationAnchors(), IntegrateData() [11].
6. Cell clustering: Using the Seurat pipeline, count data are nor- malized, and the standard PCA and UMAP steps are run. Cell
clustering is performed with the FindNeighbors() and
FindClusters() functions, using a resolution between 0.3 and 0.6 (Fig.
4a, b).
7. Cell type marker identiﬁcation and annotation: markers for
each cell cluster can be determined with the FindAllMarkers()
function of the Seurat package. From these markers, cell cluster
identity can be inferred (Fig. 4a, b).
8. Other tertiary analyses: a multitude of analyses can be per-
formed from this point such as differential gene expression or
differential cell population frequencies between conditions.
4 Notes
1. At the cell dissociation stem from proliferative cultures,
Trypsin-EDTA 0.05% and inactivation medium can be replaced
by fetal serum-free solutions, such as the Animal Component-
Free Cell Dissociation Kit (Stemcell Technologies) or Detach-
Kit (Promocell).
2. Here, genes have been invalidated using commercial mixes of
sgRNAs which produce deletion with size up to the distance between the most 2 distant sgRNAs. This method has shown
high efﬁciency (95%) for most targeted genes. Custom sgRNA mixes can be designed using tools such as CRISPick (
https://
portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Single
sgRNA may also be used instead of sgRNA mixes. In this case
much smaller indels will be detected and the quantiﬁcation
described here may not be suitable. Sanger sequencing might
work in this case. However, if an efﬁcient antibody is available for the targeted gene, invalidation efﬁciency can be quantiﬁed
by western blot.
3. ALI cultures are dissociated with protease XIV, but can alter-
natively be dissociated with protease from
(Sigma, P5380) at a concentration of 10 mg/mL in either
PBS or HBSS, at 4
4. Cell multiplexing described here has been achieved with the
10X Genomics commercial solution (Cell Multiplexing

22 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
Oligos). It can be achieved by using hashtag antibodies (Total-
Seq antibodies provided by BioLegend), according to the prin-
ciple described by Stoeckius et al. [14].
5. All steps should be performed in a safety environment adapted
according to the institution regulations. Liquid and solid waste
from turbinates and cells must be discarded according to insti-
tution regulation with respect to biohazards.
6. Cell ﬁtness is very important for success of the invalidation.
Cells should be nucleofected at 70 to 80% conﬂuency which
corresponds to a state of active proliferation. Cells should not
be over-trypsinized and handled with care. Successful invalida- tion has been achieved with fresh cells plated directly after
turbinate dissociation or with cells that have been frozen after
a single passage in culture. Invalidation on primary cells that have been through more than 2 passages after isolation or
thawing has not been tested.
7. Gene invalidation efﬁciency at the protein level has not been
described here, since the aim was to focus on veriﬁcation by
Nanopore sequencing. Protein extracts obtained at
Subheading 3.2 can be processed by Western blot with conven-
tional protocols. Here, invalidation of use of eBioscience (14-9965-80) antibody.
8. The CrispRstats script can be subjected to updates. The
method is as follows: sequencing reads are mapped to the
current Reference Human Genome (Human GRCh38/
hg38) with minimap2. Resulting .bam ﬁles are then explored
in the genomic region corresponding to the targeted region for
each gene. This region can be customized and usually ranges
from
+100 bp to the most upstream sgRNA. Within this region,
CrispRstats makes the sum of all sequencing reads that have
deletions of at least 5 bp compared to the reference genome.
This 5 bp threshold was chosen because it is the minimal size
deletion which is not detected in control (scrambled) condi-
tion, due to sequencing errors. This threshold can be custo-
mized. For each targeted gene, the ratio between the sum of
deleted reads and the sum of total reads is performed to obtain
invalidation efﬁciency. Note that this script does not take into
account the position of the 5 bp deletions. Due to Nanopore
sequencing errors, these deletions can also be observed in the
control conditions. In invalidated condition, these deletions
are mostly consecutive, which is a parameter that is not taken
into account. Thus, the current version of the script under-
estimates the invalidation efﬁciency.
9. The single-cell RNAseq multiplexed method described here
requires a minimum of 500,000 cells per condition or replicate. With differentiation media that generate thinner epithelia

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States in Airway ALI Cultures 23
compared to Pneumacult-ALI, it may be necessary to pool 2 or
3 6.5 mm inserts to obtain sufﬁcient cell numbers for multi-
plexing. This is important to take into consideration when
planning the number of starting cells and Nucleofector cuv-
ettes to be used for the ﬁrst and second round of CRISPR-
Cas9 RNP.
10. Cell counting and handling: carefully count all cells to ensure
accurate quantitation, make note of cell viability which should
remain above 90%, keep cell suspensions on ice (unless other-
wise stated) at all times. In this protocol, cell viability is
measured at the very last cell counting step, on the pooled
cell suspension. If one of the culture conditions is expected to
alter cell viability, it is best to evaluate cell viability at the ﬁrst
counting step, before CMO labeling. No cell straining step has
been included before CMO labeling, considering successful
dissociation and low proportion of cell multiplet. If dissocia-
tion was not optimal, it is possible to perform a cell straining
step on a 15 m strainer before the last wash step. In this case,
consider higher cell loss when estimating cell suspension
concentration.
11. Manufacturer’s recommendations regarding multiplexing with CMOs: up to 12 CMO-labeled samples can be pooled
per well on a 10x Genomics chip. Ensure that a different CMO
tag is used for each sample in the pool. For optimal multiplet
detection and optimal signal-to-noise ratios, pool samples at 1:
1 ratio after CMO labeling and use no more than ~2500 cells
per CMO tag. Do not pool CMO-labeled samples with unla-
beled samples. Pooled samples shall be loaded on a 10x Geno-
mics chip and loaded on the Chromium as fast as possible
(maximum 30 min). Otherwise, CMO background signals will be too high to allow demultiplexing. It Is recommended
to prepare the 10x chip and reverse transcription mix, then
pool CMO-labeled samples afterward.
12. To avoid DNA contamination during library construction, it is
crucial to work in separate laboratories for pre-ampliﬁcation
and post-ampliﬁcation steps. Use PCR laminar ﬂow cabinets as
much as possible.
13. For library construction, use thermal cyclers that are validated
by 10X Genomics. Thermal cyclers must support uniform
heating of 100 L volumes and have a temperature-
controlled lid.
14. For sequencing, each sample index in the Dual Index Kit TT
Set A Dual Index Kit NN Set A is a mix of one unique i7 and one unique i5 sample index. Samples utilizing the same sample
index should not be pooled together or run on the same ﬂow
cell lane, as this would not enable correct sample demultiplexing.

24 Laure-Emmanuelle Zaragosi et al.
15. Data analysis is here brieﬂy described with Cell Ranger and the
Seurat pipeline. scRNAseq is a fast-moving ﬁeld, involving
regular updating of these tools and publication of new tools.
It is thus important to verify which is the most appropriate and
up-to-date taken before performing analysis.
Acknowledgments
The authors thank the UCAGenomiX platform for fruitful discus-
sions and technical help on single-cell RNA sequencing. Supported
by grants from Fondation pour la Recherche Me ´dicale
(DEQ20180339158), 020, INSERM (Human Developmental
Cell Atlas program), the association Vaincre la Mucoviscidose
(RF20180502280), the Chan Zuckerberg Initiative (Silicon Valley
Foundation, 2017-175159-5022), ANR SAHARRA (ANR-19-
CE14
(grant agreement 874656). The UCAGenomiX platform, a partner
of the National Infrastructure France Ge´nomique, is supported by
Commissariat aux Grands Investissements (ANR-10-INBS-09-03,
ANR-10-INBS-09-02), Conseil De´partemental des Alpes Mari-
times (2016-294DGADSH-CV).
References
1. Kotton DN, Morrisey EE (2014) Lung regen-
eration: mechanisms, applications and
emerging stem cell populations. Nat Med 20:
822 https://doi.org/10.1038/nm.
3642
2. Deprez M, Zaragosi L-E, Truchi M et al
(2020) A single-cell atlas of the human healthy
airways. Am J Respir Crit Care Med 202:1636
1645. https://doi.org/10.1164/rccm.
201911-2199OC
3. Pezzulo AA, Starner TDT, Scheetz TET et al
(2011) The air-liquid interface and use of pri-
mary cell cultures are important to recapitulate
the transcriptional proﬁle of in vivo airway epithelia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol
300:L25–
https://doi.org/10.1152/
ajplung.00256.2010
4. Gras D, Bourdin A, Vachier I et al (2012) An
ex vivo model of severe asthma using reconsti-
tuted human bronchial epithelium. J allergy
Clin Immunol 129:1259-1266.e1. https://
doi.org/10.1016/j.jaci.2012.01.073
5. Ruiz Garcia S, Deprez M, Lebrigand K et al
(2019) Novel dynamics of human mucociliary
differentiation revealed by single-cell RNA
sequencing of nasal epithelial cultures
Development:177428. https://doi.org/10.
1242/dev.177428
6. Recordon-pinson P, Esteves P, Faure M (2022)
Bronchial epithelia from adults and children :
SARS-CoV-2 spread via syncytia formation and
type III interferon infectivity restriction. 112.
https:// do i.o r g/10 .107 3/pn as .
2202370119/-/DCSupplemental.Published
7. Mulay A, Konda B, Garcia G et al (2021)
SARS-CoV-2 infection of primary human
lung epithelium for COVID-19 modeling and
drug discovery. Cell Rep 35:109055. https://
doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109055
8. Everman JL, Rios C, Seibold MA (2018) Pri-
mary airway epithelial cell gene editing using
CRISPR-Cas9. Methods Mol Biol 1706:267
292. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-
7471-9_15
9. Koh KD, Siddiqui S, Cheng D et al (2020)
Efﬁcient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced
mucostasis. Am J Respir Cell Mol Biol 62:373–
381.
https://doi.org/
0266OC
10. Satija R, Farrell JA, Gennert D et al (2015)
Spatial reconstruction of single-cell gene

CRISPR KO and scRNAseq to Identify Cell States inAirway ALI Cultures 25
expression data. Nat Biotechnol 33:495502.
https://doi.org/10.1038/nbt.3192
11. Butler A, Hoffman P, Smibert P et al (2018)
Integrating single-cell transcriptomic data
across different conditions, technologies, and
species. Nat Biotechnol 36:411–420. https://
doi.org/10.1038/nbt.4096
12. Lun ATL, Riesenfeld S, Andrews T et al (2019)
EmptyDrops: distinguishing cells from empty
droplets in droplet-based single-cell RNA
sequencing data. Genome Biol 20:19.
https://doi.org/10.1186/s13059-019-
1662-y
13. Islam S, Zeisel A, Joost S et al (2014) Quanti- tative single-cell RNA-seq with unique molec-
ular identiﬁers. Nat Methods 11:163166.
https://doi.org/10.1038/nmeth.2772
14. Stoeckius M, Zheng S, Houck-Loomis B et al
(2018) Cell hashing with barcoded antibodies
enables multiplexing and doublet detection for
single cell genomics. Genome Biol 19:224.
https://doi.org/10.1186/s13059-018-
1603-1

Chapter 2
SARS-CoV-2 Infection of Human Primary Nasal Multiciliated
Epithelial Cells Grown on Air-Liquid Interface Cultures
Maria Victoria Humbert, Christopher J. McCormick,
and Cosma Mirella Spalluto
Abstract
Respiratory epithelial cells fail to exhibit natural phenotypic and morphological characteristics when grown
in standard cell culture conditions. To better understanding respiratory pathogen host-cell interactions in
the airways, one approach is to instead grow and differentiate these cells at an air-liquid interface (ALI). This
chapter provides the working protocols used in our lab for producing ALI cultures, infecting them with
SARS-CoV-2 and monitoring viral replication.
Key words Air-liquid interface culture, Cilia, ACE-2, SARS-CoV-2
1 Introduction
Coronaviruses are enveloped positive-strand RNA viruses belong-
ing to the family Coronaviridae, known to infect mammals and
birds [1]. At present, seven Coronaviruses have been reported to
be pathogenic to humans [2]. The most recently identiﬁed of these
is SARS-CoV-2, the etiological agent of COVID-19, cases of which
were ﬁrst reported in China in December 2019 [3–5]. On January
2020, the World Health Organization (WHO) declared SARS-
CoV-2 a Public Health Emergency of International Concern
(http://covid19.who.int/) and at the time of writing, the virus
still poses a threat to global public health with severe social, political
and economic implications (https://www.who.int/emergencies/
diseases/novel-coronavirus-2019/events-as-they-happen).
Nasal ciliated epithelial cells are the primary targets for SARS-
CoV-2 replication in the early stage of infection. Angiotensin-
converting enzyme 2 (ACE2) protein, the canonical receptor for
SARS-CoV-2 entry to the host cell, localizes to the membrane of
motile cilia of the respiratory tract epithelia [6, 7]. Infections with
SARS-CoV-2 can develop into a severe acute respiratory syndrome,
Vito Mennella (ed.),
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3507-0_2,
© The Author(s), under exclusive license to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2024
27

often presenting with symptoms of dry cough, dyspnea, fever, and
tiredness, although other less common symptoms not strictly
related to respiratory tract infections have also been reported [8, 9].
28 Maria Victoria Humbert et al.
Unlike conventional 2D culture methods, 3D insert-based
air-liquid interface (ALI) epithelial culture systems represent a
physiologically relevant model to understand cellular and molecular
features of airway homeostasis and disease pathogenesis. These are
capable of producing a pseudostratiﬁed epithelium with basal cells,
ciliated epithelial cells, and mucus-producing goblet cells. The ALI
culture system can be produced either with cell lines or primary cells of airway origin. Methods for cultures of upper and lower airway cells are similar, and both can be exploited to investigate
disease states [
10].
Human immortalized cell lines permit the development of
well-characterized, homogeneous cell populations which results in
high empirical reproducibility [11, 12]. However, the fact that
these cells are not genetically, physiologically, morphologically,
and functionally identical to their corresponding original primary
cell types is a major limitation when extrapolating the results to
what actually occurs in vivo. Ex vivo nasal or bronchial samples
obtained by brushing or curette biopsy provide primary human
airway epithelial cells for in vitro culture models, and patient-
derived cells are generally considered the best resource to recapitu-
late disease processes.
This chapter describes the methods for culturing and inducing
differentiation (with special consideration of methods for assessing cilia formation) of human primary nasal epithelial cells at ALI [
13],
and the application of this system to study SARS-CoV-2 infection
in vitro. Methods for testing the antiviral effect of compounds on SARS-CoV-2 are also discussed, with exemplar protocols for pro-
phylaxis and/or treatment methods provided. Assessment of viral titers/load/shedding by plaque assay is described as an example.
2 Materials
2.1 Air-Liquid
Interface (ALI)
Cultures of Human
Primary Nasal
Epithelial Cells
(hPNEC)
1. Nasal brushes.
2. Sterile-ﬁltered, culture grade Dulbecco
Saline (DPBS), without Ca
2+
/Mg
2+
.
3. T75 vented-capped tissue culture ﬂasks.
4. Sterile cell culture grade water.
2.1.1 Cellular Expansion:
Submerged Cultures of
hPNEC
5. PureCol solution
3 mg/mL (Advanced BioMatrix_CAT#5005) or any other
similar collagen I stock solution.
6. PneumaCult Medium: 490 mL PneumaCult
Plus Basal Medium (STEMCELL_CAT#05041), 10 mL

SARS-CoV-2 Infection of Air-Liquid Interface Human Cultures 29
PneumaCult
CAT#05042), 0.5 mL 200×
(STEMCELL_CAT#07925), 0.5 mL 1000
Gentamycin, 5 mL 100×
mycin (10 mg/mL), 0.5 mL 1000
Amphotericin.
7. 30 mL sterile Universal tubes.
8. 50 mL sterile conical tubes.
9. Sterile, ﬁltered pipette tips (200, 1000 L).
10. Serological pipettes (5, 10, 25 mL).
11. Scissors.
12. 70% (v/v) ethanol.
13. 1% (w/v) Virkon
14. Equipment: Class II microbiological safety cabinet (MSC),
standard microscope, humidiﬁed CO
2 (5% v/v) incubator,
refrigerated centrifuge.
2.1.2 Cell Storage 1. Sterile-ﬁltered, culture grade DPBS.
2. 1
3. Dulbecco′ becco′
without L-glutamine and sodium pyruvate, 5 mL 200 mM L-
glutamine, 5 mL 100×
cin (10 mg/mL), 50 mL heat-inactivated, sterile-ﬁltered fetal
bovine serum (10% FBS, ﬁnal concentration).
4. Freezing Medium: 70% (v/v) PneumaCult
Medium, 20% (v/v) heat-inactivated, sterile-ﬁltered fetal bovine serum (FBS), 10% (v/v) Dimethyl sulfoxide (DMSO).
5. Cell freezing container that allows a rate of cooling very close to1
6. 30 mL sterile Universal tubes.
7. Cryogenic vials.
8. Sterile, ﬁltered pipette tips (200, 1000 L).
9. Serological pipettes (5, 10, 25 mL).
10. 70% (v/v) ethanol.
11. 1% (w/v) Virkon
12. Equipment: Class II MSC, humidiﬁed CO
2 (5% v/v) incuba-
tor, refrigerated centrifuge,70
2.1.3 Cellular
Differentiation: Air-Liquid
Interface (ALI) Cultures of
hPNEC
1. Sterile-ﬁltered, culture grade DPBS.
2. Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS).
3. 1
4. DMEM.

30 Maria Victoria Humbert et al.
5. 24-well plate containing 12 m pore
polyester membrane inserts.
6. Sterile cell culture grade water.
7. PureCol
3 mg/mL (Advanced BioMatrix_CAT#5005) or any other
similar collagen I stock solution.
8. PneumaCult 2.1.1,
step 6
9. PneumaCult
Basal Medium (STEMCELL_CAT#05002), 50 mL
PneumaCult
CAT#05003), 5
nance Supplement (STEMCELL_CAT#05006), 2.5 mL
200 CAT#07925), 1 mL 0.2% Heparin Solution (STEMCELL_-
CAT#07980), 5 mL 100×
Streptomycin (10 mg/mL), 0.5 mL 1000
Amphotericin.
10. 30 mL sterile Universal tubes.
11. 7 mL sterile polystyrene Bijous.
12. Standard 96-well plate.
13. Hemocytometer chamber.
14. Cell counter.
15. Sterile, ﬁltered pipette tips (10, 200, 1000 L).
16. Serological pipettes (5, 10, 25 mL).
17. 1
18. 70% (v/v) ethanol.
19. 1% (w/v) Virkon
20. 1
21. Equipment: Class II MSC, humidiﬁed CO2 (5% v/v) incuba-
tor, refrigerated centrifuge, EVOM Voltohmmeter (World Pre-
cision Instruments) or any Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) meter, vacuum pump, standard
microscope.
2.1.4 Analysis of Cellular
Differentiation (Ciliation) at
ALI
1. DPBS.
2. 4% w/v paraformaldehyde (PFA) solution in DPBS.
3. Permeabilization Buffer: DPBS with 0.2% (v/v) Triton X-100.
4. Blocking Buffer: 1% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.1%
(v/v) Tween-20 and 0.1 M Glycine.
5. Wash Buffer: DPBS with 0.05% (v/v) Tween-20.

SARS-CoV-2 Infection of Air-Liquid Interface Human Cultures 31
6. Primary antibody: Anti-Acetylated alpha Tubulin antibody,
mouse monoclonal, Abcam ab24610.
7. Secondary antibody: Goat anti-mouse AlexaFluor 488, Invitro-
gen Molecular Probes A11001.
8. DAPI Stock Solution: Sigma-Aldrich MBD0015, 1 mg/mL.
9. MOWIOL 4-88 Mounting Media: add 2.4 g of MOWIOL
4-88 (Sigma Aldrich, 813881) to 6 g of glycerol and stir to
mix. Add 6 mL of water and stir for several hours at room
temperature. Add 12 mL of 0.2 M Tris (pH 8.5) and heat to
50
4-88 dissolves, clarify the solution by centrifugation at 5000
for 15 min. For long-term storage, make appropriate aliquots
and store at20
10. 12-well plates.
11. Petri dishes.
12. Tweezers.
13. Pastettes.
14. 1.5 mL Eppendorf tubes.
15. Paraﬁlm.
16. Pipette tips (10, 200, 1000 L).
17. Straight edge, pointed tip scalpels (Swann-Morton ref.0502).
18. Microscopy slides and cover slips.
19. Fluorescence microscope.
2.2 SARS-CoV-
2 Infection of hPNEC
ALI Cultures
1. Sterile-ﬁltered, culture grade DPBS.
2. PneumaCult
PneumaCult
CAT#05002), 50 mL PneumaCult
(STEMCELL_CAT#05003), 5 mL 100×
(10,000 U/ml) (10 mg/mL), 35 L 30%
(w/v) BSA stock solution.
2.2.1 Preparation of
hPNEC ALI Cultures for
Infection
3. 24-well cell culture plates.
4. Tweezers.
5. Sterile, ﬁltered pipette tips (10, 200, 1000 L).
6. 30 mL Universal tubes.
7. 70% (v/v) ethanol.
8. 1% (w/v) Virkon
9. 1
10. Equipment: Class II MSC, humidiﬁed CO
2 (5% v/v) incuba-
tor, EVOM Voltohmmeter (World Precision Instruments) or
any TEER meter, vacuum pump, standard microscope.

32 Maria Victoria Humbert et al.
2.2.2 SARS-CoV-
2 Infection of hPNEC ALI
Cultures
1. SARS-CoV-2 variant.
2. hPNEC ALI cultures.
3. PneumaCult 2.2.1,
step 2
4. QIAzol
lysis reagent.
5. Sterile-ﬁltered, culture grade DPBS.
6. Sterile, ﬁltered pipette tips (10, 200, 1000 L).
7. 30 mL sterile Universal tubes.
8. 1.5 mL sterile screw-capped tubes.
9. Airtight plastic box.
10. 70% (v/v) ethanol.
11. 1% (w/v) Virkon
12. Virusolve
13. Equipment: Class II MSC, Class III MSC, humidiﬁed CO
2 (5%
v/v) incubator, autoclave.
2.2.3 Prophylaxis Model of Infection 1. PneumaCult 2.1.3,
2. Appropriate stock solutions of compounds and their
corresponding solvents if different to water.
3. Sterile-ﬁltered, culture grade DPBS.
2.2.4 Treatment Model of
Infection
1. PneumaCult 2.2.1,
step 2
2. Appropriate stock solutions of compounds and their
corresponding solvents if different to water.
3. Sterile-ﬁltered, culture grade DPBS.
2.3 Analysis of Viral
Infection (Shedding)
by Plaque Assay 1. Vero E6 kidney cell line (1 frozen vial).
2. DMEM (see 2.1.2,
3. Sterile-ﬁltered, culture grade DPBS.
2.3.1 Vero E6 Cell
Culture
4. 1
5. T75 vented-capped tissue culture ﬂasks.
6. 12-well cell culture plates.
7. 30 mL sterile Universal tubes.
8. Standard 96-well plate.
9. Hemocytometer chamber.
10. Cell counter.
11. Sterile, ﬁltered pipette tips (10, 200, 1000 L).
12. Serological pipettes (5, 10, 25 mL).

SARS-CoV-2 Infection of Air-Liquid Interface Human Cultures 33
13. 0.4% (w/v) Trypan Blue.
14. 70% (v/v) ethanol.
15. 1% (w/v) Virkon
16. Equipment: Class II MSC, humidiﬁed CO2 (5% v/v) incuba-
tor, standard microscope.
2.3.2 Plaque Assay 1. SARS-CoV-2-infected hPNEC ALI apical supernatants.
2. Vero E6 culture (at ~4
5
cells/well, ~80% conﬂuent) in a
12-well cell culture plate.
3. DMEM (see 2.1.2,
4. DMEM Infection Medium: 500 mL DMEM
without L-glutamine and sodium pyruvate, 5 mL 200 mM
L-glutamine, 13 mL 1 M HEPES, 5 mL 100×
(10,000 U/ml)
5. 2
15 mL 7.5% Sodium Bicarbonate Solution, 5 mL 200 mM
L-glutamine, 13 mL 1 M HEPES, 20 mL heat-inactivated,
sterile-ﬁltered fetal bovine serum (8% FBS, ﬁnal concentra-
tion), 147 mL sterile cell culture grade water.
6. 2.4% (w/v) Cellulose Solution: 12.5 g cellulose powder
(Sigma-Aldrich CAT#435244) added to 500 mL distilled
water
7. Overlay (20 mL/12-well plate required): 10 mL 2
Medium (
tion (
8. 8% (v/v) Formaldehyde Solution in DPBS.
9. 0.1% (w/v) Crystal Violet Solution: 0.1 g Crystal Violet, 20 mL 100% Methanol, 80 mL distilled water.
10. Distilled (or tap) water.
11. Sterile, ﬁltered pipette tips (200, 1000 L).
12. Serological pipettes (5, 10 mL).
13. 30 mL Universal tubes.
14. Airtight plastic box.
15. Zip-lock plastic bag.
16. 70% (v/v) ethanol.
17. 1% (w/v) Virkon
18. Virusolve
19. Equipment: Class II MSC, Class III MSC, humidiﬁed CO
2 (5%
v/v) incubator, autoclave.

34 Maria Victoria Humbert et al.
3 Methods
The following methods describe the optimized protocols for SARS-
CoV-2 infection of hPNEC ALI cultures as physiological relevant
in vitro models of the human airways. They include experimental
procedures to test the antiviral effect of any compound of interest.
Special consideration is given to the analysis of cellular differentia-
tion phenotypes at ALI, cilia formation in particular, which are key
to allow infections with SARS-CoV-2. These described methods
should be considered as a general guide, with optimization of these
techniques likely being required if challenging with different viruses
or other microbial pathogens, as well as if using other primary or
immortalized respiratory cell lines.
3.1 Air-Liquid
Interface (ALI)
Cultures of Human
Primary Nasal
Epithelial Cells
(hPNEC)
1. Prior to collecting and processing the cells, prepare a solution
of type I collagen by adding 0.5 mL PureCol (or appropriate
dilution of a similar type I collagen stock solution) to 50 mL of
sterile cell culture grade water in a 50 mL conical tube (ﬁnal
concentration: 30 g/mL).
2. Pre-coat a T75 tissue culture ﬂask (one per sample required)
with 10 mL of collagen I solution (30 g/mL) for at least
30 min at 37
3.1.1 Cellular Expansion:
Submerged Cultures of
hPNEC
3. Remove the collagen I solution from the T75 pre-coated tissue
culture ﬂasks, add 5 mL of PneumaCult
and leave at 37
4. For collection of nasal epithelial cell brushings, prepare 30 mL
universal tubes containing 5 mL DPBS (without Ca
2+
/Mg
2+
).
Immediately upon collection, transfer the brush into the
DPBS-containing tube to minimize cell death due to the sam-
ple drying up. Cut the brush short enough that allows you to
close the tube and store on ice until processing (
5. Open the universal tube carefully to avoid the brush inside
from springing out.
6. With a clean pair of scissors (previously sprayed with 70% (v/v)
ethanol), cut off the end of a 1000 L pipette tip by 2 insert the brush from the top of the pipette tip and carefully
insert the brush bristles through the tip (up and down) to help
dislodge the cells from the bristles into the DPBS.
7. Discard the brush.
8. Centrifuge the cell suspension at 400
Discard the supernatant (SN) and resuspend the cell pellet in
1 mL PneumaCult
9. Add the cell suspension into the pre-collagen coated,
pre-warmed T75 tissue culture ﬂask containing 5 mL
PneumaCult

Another Random Scribd Document
with Unrelated Content

en daaronder bij name Oudewater dat zij alle oproerige en verdachte
personen uit hunne steden zouden bannen en geene van elders innemen, dan
alleen zij, die van behoorlijke getuigschriften voorzien waren en den eed
van getrouwheid aflegden.
Die voorzorg belette echter niet, dat spoedig na dit bevel, de persoon van
Balthazar Gerards tot in het hof van den Prins wist door te dringen en op
den 10 Julij 1584, verraderlijk den Prins van het leven beroofde.
Groot was de droefenis en de rouw, die dit ontzettende berigt alomme te
weeg bragt, en alhoewel wij het vroeger ter nederschreven, zoo moet om
den geregelden gang het hier herhaald worden. Daags na den moord aan
Willem den Zwijger gepleegd, vergaderden op het stadhuis binnen Delft de
twee voorzitters van de Hoven, edelen en eenige steden. De vergadering der
Staten, werd nu ten spoedigste te Delft beschreven, om orde en voorziening
op het stuk der regering te brengen206 en namens Oudewater verschenen
dan ook de gemagtigden ten behoorlijken tijd, na alvorens, volgens
uitdrukkelijk bevel gemagtigd te zijn207.
»Intusschen,” zoo schrijft Van Kinschot208, waren die van ’s Prinsen Raad
gemagtigd, om hunne diensten te vervolgen, totdat ten aanzien der Regering
anders zoude voorzien zijn. De edelen en afgevaardigden der steden nu te
Delft bijeen zijnde, deden den eed voor den Voorzitter Nicolai, dat alle
beraadslagingen en gevoelens op het stuk der Regering zouden geheim
blijven. Toen men nu voorloopig genoeg over dit gewigtig onderwerp had
gesproken, getuigden die van al de kleine steden te willen vertrekken, om
de groote kosten van het bijwonen der vergaderingen te verhoeden,
belovende echter, zich van de vereeniging tusschen Holland en Zeeland
nimmer te zullen scheiden, waarop zij den volgenden dag ontslagen
werden.
Voorts verschoonde Oudewater nevens de kleine steden zich, om dezelfde
reden, tot het niet bijwonen der begrafenis van den Prins. De Staten
namelijk hadden bevolen, dat die teraardebestelling op de plegtigste wijs
zoude geschieden, en onder anderen zouden er twee gemagtigden van
iedere kleine stad tegenwoordig moeten zijn, gekleed in lange rouwmantels

en ieder hunner weder vergezeld van hunne boden, die achter hen moesten
gaan met een zwarten mantel omhangen waarop of op de borst de bus der
stad moest aanwezig zijn.
Maar vervolgen wij den algemeenen loop van zaken. De koningin van
Engeland stond eerlang de Staten bij, met eenige duizenden krijgslieden,
onder bevel van den Graaf van Leycester, maar hij rigtte weinig tegen de
Spanjaarden uit, en daar hij een slecht en heerschzuchtig mensch was, onder
schijn van godsvrucht den baas zocht te spelen, niet alleen naar het
Stadhouderschap trachtte, maar zelfs de opperste magt in het land
uitoefende, benoemden de Staten Prins Maurits, zoon van Willem den I,
spoedig tot opvolger zijns vaders.
Leycester aldus teleurgesteld, keerde spoedig weder terug, hoewel de
krijgslieden nog eenigen tijd bleven.
Woelig was dus de tijd en schadelijk voor de kleinere gemeenten, die de
lasten van den krijg zeer zwaar te dragen vielen. De Staten van Holland
zonden dan ook op den 17 Augustus 1584 eene aanmaning aan de stad
Oudewater tot voldoening van 250 pond, als aandeel der gemeenten in den
algemeenen omslag en contributie, ten einde in de groote lasten van den
oorlog te voorzien.
De stad moet echter ten dezen tijde van vrij goede defensien voorzien zijn
geweest, ware dit toch niet aldus, dan hadden ongetwijfeld de Staten in
1585 niet aan de stad bevolen, om binnen hare muren voor min of meer
geruimen tijd eene vrij aanzienlijke bergplaats voor granen in te ruimen.209
Het was mede in het jaar 1585, dat de stad aan de Westzijde aanmerkelijk
vergroot werd, daar de Staten het Veer aan Oudewater toevoegden.210
Zooals wij hierboven meldden, moest de heerschzuchtige Leycester weldra,
in 1586, de Nederlanden verlaten, doch het leger,—staande onder soldij der
koningin van Engeland,—dat hij achter liet, was nog 10,000 man sterk.
Deze manschappen wilde Leycester in verschillende steden en sterkten
gelegd zien, en daardoor wilde de graaf zich van die steden verzekeren.211
Alhoewel wij Oudewater niet op de lijst dier steden vinden gerangschikt,

zoo vinden wij toch op het gemeente-archief van het jaar 1586 diverse
copijen van bevelen, tot het leggen van een ander garnizoen binnen de stad,
als ook verschillende stukken aangaande den kommandant van de bezetting
binnen de stad Lancelot, Heer van Marbaijs.
In sommige steden, gingen in 1587 de vijandelijkheden der Engelschen
zelfs tot geweldenarijen over en ook liepen zij het platte land tusschen
Utrecht, Amsterdam en Gouda af.212
De Staten van Holland en Zeeland namen nu dan ook maatregelen, om zich
tegen den aanhang van Leycester te versterken, en magtigden prins Maurits,
om het gezag hem bij lastbrief en berigtschrift, als stadhouder en kapitein
Generaal opgedragen, metderdaad te gebruiken: om alle oversten, bezetting
houdende in de gemelde gewesten, lastbrieven te geven, en zich en de
staten gehoorzaamheid en getrouwheid te doen zweren. Het veranderen der
bezetting stelden zij aan hem of aan Hohenlo, zijnen luitenant, bij
goeddunken van de Staten of hunne gemagtigden; het verleenen der
patenten tot inlegering of doortogt, moest op dezelfde wijs geschieden.
Deze regelen uit Wagenaar213 naast het archief der stad Oudewater gelegd,
komen treffend overeen, immers van den 6 Maart 1587, vinden wij daar een
placcaat, aangaande de order, gesteld op de passagiën en doortogten van de
ruiters en knechten, binnen de landen van Holland en West Vriesland en
tegen alle inlegeringen en overlast van hen, binnen de voorschreven landen,
en van 12 October 1587 eene missive, houdende verzoek, om meerder
garnizoen binnen de stad te willen ontvangen, geteekend door Philips, grave
van Hohenlo.
Voorts werden insgelijks in verscheidene Hollandsche steden, tot bewaring
derzelve, ingevolge besluit der Staten eenige knechten in waardgeld
aangenomen.
Inmiddels sloeg in verscheidene steden de bezetting aan het morren, dat tot
hevige dadelijkheid overging. Het krijgsvolk van den Staat, had zich al
eenige jaren moeten vergenoegen met ⅔ hunner soldij, terwijl hun voor het
overige gedeelte, schuldbrieven geleverd werden. Nu wilden zij volle

afdoening en weigerden den Staten en Prins Maurits gehoorzaamheid, zich
beroepende op den eed aan Leicester gedaan.
Te Oudewater was men insgelijks ontevreden, getuigen de diverse
processenverbaal tegen het garnizoen in 1587–1588 opgemaakt.214
Maar Philips den II. zat insgelijks niet stil. Ook voor hem moest men steeds
op zijne hoede zijn, doch in 1588 poogde men weder vrede te maken, en op
de Statenvergadering, uit dien hoofde te ’s Gravenhage belegd, waren de
gemagtigden van Oudewater weder tegenwoordig. Het schijnt echter, dat
men meer en meer de meest mogelijke voorzorgen ter verdediging nam, ten
minste de schutterij te dezer stede was in dezen tijd op een zeer actieven
voet gebragt.
Utrecht zelfs, dat Oudewater zoo menigen keer met zijne troepen bevochten
had, zond op den 22 April 1589 eene missieve aan die van Oudewater,
waarin gemeld werd, dat de vijand omtrent 30 man sterk, den vorigen
avond door Jutphaas neerwaarts gepasseerd was. Die van Utrecht
verzochten daarin »Crysvolck” uit te zenden, het slaan der klokken ten
platten lande als anderzins, ten einde de Spanjaarden betrapt en achterhaald
mogten worden. De Stichtschen schreven voorts, dat ook zij hunne
maatregelen genomen hadden.
Maar de toestand van het Spaansche leger in deze gewesten werd al
zwakker en geringer, de troepen gingen eerlang hier en daar aan het muiten,
en prins Maurits won door list en krijgsmagt een aantal steden.
Het was in 1598, dat Philips de II. overleed, en in de Spaansche
Nederlanden werd opgevolgd, door zijnen zoon Philips den III.
De krijg duurde inmiddels voort. In het jaar 1600 had de groote
overwinning door Maurits bij Nieuwpoort plaats, waarbij de Admirant van
Arragon krijgsgevangen gemaakt werd. Men wilde nu van de zijde der
Staten, dat deze niet dan met woeker zoude ingewisseld worden, en wij
vinden dan ook in het archief der stad Oudewater van den 21 Januarij 1601,
de copij van eene missieve, aan de Staten van Holland, houdende aanvraag

van wege de algemeene Staten om eene naamlijst van al de
krijgsgevangenen, om te kunnen worden ingewisseld tegen den Admirant
van Arragon.
Wij stappen nu eenige jaren met stilzwijgen voorbij, waarin weinig van
aanbelang te Oudewater geschiedde. Philips den III. echter werd in 1609
den krijg zoodanig moede, dat hij met de Staten een 12 jarig bestand
sloot.215 Men mogt nu van buiten eenige ruste genieten, maar van binnen,
zou weldra weder een zeer hevig vuur van tweedragt beginnen te branden.
Wij bedoelen de twist tusschen de Remonstranten en contra-Remonstranten.
In eenige steden liepen de geschillen weldra zeer hoog en wij zullen den
vriendelijken lezer bij behoorlijke verwijzing naar de bronnen aantoonen,
dat die in de stad Oudewater niet van de minste waren.
De stichter van het Remonstrantismus was Jacobus Arminius, zoo als wij
weten in Oudewater geboren,216 en zijn grootste tegenstrever de Heer
Gomarus, ten jare 1603, beide Hoogleeraren in de theologie aan de
hoogeschool te Leiden.
Wij mogen ons bij de punten hunner geschillen niet uitsluitend ophouden
maar ons in het kort bepalen bij de uitwerkselen hunner twist.
Over den inhoud van den Heidelbergschen-Catechismus echter, waren
beiden het zeer oneens, en na veel aanhouden werd er in 1606 eene
Nationale Synode met toestemming der Algemeene Staten gehouden.217
De verdeeldheid won echter meer en meer veld en in het jaar 1608, werden
de zaken voor den Hoogen Raad gebragt.
Wij zeiden het reeds vroeger, ieder dezer hoogleeraren had zijnen aanhang.
De predikanten deelden voor het grootste gedeelte in het gevoelen van
Gomarus; doch de meeste Wethouders hielden het met Arminius wiens leer
gemakkelijker te bevatten scheen.218 Onder anderen was de balluw Gerrit
Gerritszoon Crayestein te Oudewater den contra-Remonstranten eveneens
zeer vijandig.

Weldra ontstond er nog een ander geschil, waarbij de Wethouders nader
belang hadden en dat hen meer en meer genegen maakte tot hen, die van
Arminius gevoelen waren; deze toch schreven der burgerlijke overheid het
regt toe, om over kerkelijke zaken te oordeelen, daar Gomarus en de zijnen
beweerden, dat men over kerkelijke zaken, in kerkelijke vergaderingen
moeste beslissen.
In 1609 werden de hoofden van beide partijen nog eens gehoord in de
vergadering der Staten van Holland, waarop Arminius echter spoedig
overleed219.
De verdeeldheid ging echter met onzen stadgenoot niet ten grave; maar
barstte spoedig in verschillende steden tot openbare beroerten uit.
Te Oudewater had de Contra Remonstrantsche predikant Joannus Lijdius
zich in 1617 afgezonderd van de Classis, zonder zich, door de Staten, of
hunne afgezondenen te laten bewegen tot hereeniging. De opschudding, die
hieruit ontstond, was op het hevigst ten tijde der gewoonlijke verandering
der Wethouders, die men nu genoodzaakt werd te doen naar den zin der
ijveraars, die de zijde hielden van Lijdius220.
Wij zullen ons bij de bijzonderheden van die twisten binnen Oudewater niet
ophouden, omdat wij er over beginnende, een paar honderd pagina’s
daarvoor zouden behoeven. Wie lust heeft zich met die bijzonderheden van
de oneenigheid der twee partijen nader bekend te maken, leze de volgende
drie in de noot aangeduide brochures221 en ga de diverse stukken op het
raadhuis over die geschillen bestuderen. Indien hij dan van het »Audi et
alterem partem” houdt, zal zijn wensch in ruime mate bevredigd worden.
Wij ontleenen aan het »historisch verhaal” kortelijk het volgende:
Het was op den 27 Februarij 1615, toen de resolutie van de Staten omtrent
den kerkevrede in het licht verschenen, maar nog niet aan de steden
overgezonden was, dat de predikanten, de Raat en Lijdius op het stadhuis
ontboden waren, en gevraagd werden, of zij al dan niet van voornemen
waren, zich daarnaar te gedragen.

De leeraars stemden in eenige zaken terstond in, dat zij zich er naar zouden
gedragen, doch omtrent alles wat in die resolutie vervat was, konden zij
hunne toestemming nog niet geven, waarom zij 14 dagen tijd van beraad
verzochten, dien zij verwierven222.
Des avonds waren er eenigen van den kerkeraad bij Lijdius, en zij
verhaalden, wat hun dien dag was voorgehouden, waarop men besloot aan
de broeders, de predikanten te Amsterdam, en nog aan een andere »kercke”
schriftelijk om raad in die aangelegenheid te vragen.
De ouderling Gerrit van Galen, was echter niet bij die bijeenkomst geweest,
dat hem zeer zoodanig verbitterde, dat hij den 9 Maart in den kerkeraad
ontboden zijnde, weigerde te verschijnen, en hoewel hem dikwijls gezegd
werd, dat het zonder kwade bedoelingen geschied was, zoo konde men hem
niet overtuigen.223
Op het schrijven aan de predikanten der stad Amsterdam volgde den 7
Maart daaraanvolgende van den Magistraat eene missive224 aan de
eerentfeste, wijse voorsienige, seer descrete heeren van Oudewater, waarin
de leden van den magistraat »vrunts ende naburlijk versocht werden, de
gemoederen van den ingezetenen niet te verbitteren, ofte hen in hun
gemoed te bezwaren”, verder verwezen zij naar den zorgvollen toestand des
lands en op de gevaren die voor hetzelve door de tweedragt ontstaan zouden
enz. enz.
De Magistraat beantwoordde spoedig deze letteren, waarin hij de toedragt
der zaak meldde, en zeide zonder kwade bedoelingen te zijn.
De gemoederen werden echter spoedig meer en meer verbitterd. Menigmaal
gingen de oneenigheden tusschen predikanten, magistraat, burgers en
militairen tot dadelijkheden over, zoodat wij ons genoopt gevoelen tot den
draad der geschiedenis terug te keeren.
Men had nu te Oudewater en elders gezien, dat de onderlinge verdeeldheid
niet alleen uitliep, op scheuring in de kerk, maar dat er insgelijks ongewone
veranderingen in de regering der steden daardoor te weeg gekomen waren.

Zij, die nader de zijde der Remonstranten hielden, hadden al in den aanvang
der oneenigheid, ongewone pogingen gedaan, om lieden van hunne
gezindheid op het kussen te helpen, op plaatsen daar de meerderheid der
Regenten hen tegen was225. Doch nu sterker en meer openlijk ondersteund
wordende, begonnen de Contra-Remonstranten, de door hen gewenschte
veranderingen, met beteren uitslag in het werk te stellen.
Ook had men den prins doen gelooven, dat de advokaat van Holland en de
tegenwoordige regering de beperking van zijn gezag zochten; immers niet
bewilligen zouden in zijne verheffing en dat de Contra Remonstranten
daarentegen op een vergroot gezag van den prins gesteld waren. Geen
wonder dus, dat men besloot op eene bijzondere wijs tegen hen te waken.
Dit nu kon geschieden door middel der gewone landssoldaten, door de
schutterij of door van nieuws geworven knechten uit de ingezetenen. De
prins had echter zwarigheid gemaakt, om die van de vesting Oudewater na
den moedwil aldaar gepleegd, op hun verzoek nog een vendel knechten toe
te staan226, het moet ons dus niet vreemd toeschijnen, dat wij van het jaar
1617, waarvan wij nu schrijven, onder de archieven der stad diverse
stukken en naamlijsten vinden, omtrent de »rustbewaarders” binnen
Oudewater.
Men besloot nu tevens, tot het aanstellen van waardgelders en de
meerderheid der Staten van Holland nam op den 4 September 1617 een
besluit, dat de Contra Remonstranten, sedert genoemd hebben de »Scherpe-
Resolutie”227 maar eenigen tijd hierna besloot,—na veel discussien, die
over dit punt gevoerd waren,—de Hooge Raad, die Resolutie van den 4
September niet te achtervolgen.
Veel, ontzaggelijk veel zouden wij nu nog over die oneenigheid kunnen
schrijven tot in het jaar 1618, als wanneer prins Maurits zelf besloot
verandering in den Magistraat van eenige steden te gaan maken, en zoo
toog hij dan ook onder anderen in September 1618 naar de stad Oudewater
waar hij eveneens verandering in de regering bragt.

De synode van Dordrecht werd in 1618 en 1619 gehouden, dat eveneens
geruimen tijd een punt van verschil had uitgemaakt.
Wij moeten onze lezers nu opmerken, dat het 12jarig bestand met het begin
van het jaar 1621 zoude ophouden, en nu begonnen de vereenigde Staten
zich gereed te maken om verwerender wijs te oorlogen.
Het was eveneens in dit jaar, dat Philips de III. overleed, en dat zijn zoon
Philips IV. hem in de regering opvolgde en spoedig werd nu de krijg weder
hervat.
Wij vinden echter niet, dat de stad onzer beschrijving in den oorlog
vooreerst betrokken werd, slechts treffen wij op het stadhuis het afschrift
van een bevel aan van Prins Maurits, aan den te Oudewater liggenden
kapitein Gibson, om met zijne compagnie uit Oudewater te gaan, onder de
bevelen van prins Hendrik van Nassau dato 9 Augustus 1623.228 Terwijl de
tijden aldus in woeling voortvlieden, ontving men in April 1625, de tijding
van het overlijden van Prins Maurits, en het aanstellen van Prins Frederik
Hendrik en wij vinden dan ook al spoedig op het archief der gemeente de
bewijzen zijner stadhouderlijke waardigheid.
Inmiddels in den oorlog, die ter zee gevoerd werd, waren er van Oudewater
eveneens meestentijds tegenwoordig, zoodat er dan ook, dato 16 Februarij
1626, eene merkwaardige lijst op het stadhuis bewaard wordt, waarop de
namen staan uitgedrukt van personen alhier te huis behoorende en ter zee
krijgsgevangen gemaakt, en eveneens berusten er van 1636 dergelijke
stukken ten raadhuize.229 De bevolking der stad dunde dus door dit
gestadig oorlog voeren zeer. Nog in 1637 werden daarenboven uit
Oudewater 50 manschappen uit de burgerij geligt om te Steenbergen
garnizoen te houden. Dit deed de oorlog, maar hij dunde niet alleen de
bevolking der stede. Weder was het de vege pestziekte die er woedde. In het
jaar 1627 had zij een derde en in 1636 de helft der bevolking ten grave
gesleept.230
In het jaar 1647 overleed de zeer vereerde prins Frederik Hendrik en zijn
zoon Willem de II. volgde hem spoedig op, maar reeds in het volgende jaar

1648 werd de vrede met Spanje gesloten. De vereenigde gewesten werden
nu voor eenen vrijen staat erkend.
Veel bloed is er in dien krijg vergoten en de stad Oudewater had er in
groote mate zijne treurige rol in gespeeld.
Wij zouden nu een tijdvak van een 30tal jaren met stilzwijgen kunnen
voorbijgaan, waarin men den naam van de stad bijna noch in openbare,
noch bijzondere geschiedenis vindt aangeteekend. Om den draad der
gebeurtenissen echter niet te verliezen, moeten wij toch vlugtig den loop
van zaken schetsen.
Nadat de vrede met Spanje gesloten was, behoefde men zoo veel krijgsvolk
niet meer in dienst te houden; maar nu wilde de provincie Holland meer
volk afdanken dan de prins en de overige provinciën, en de twisten, die
hieruit ontsproten, waren spoedig weder allerhevigst.
De prins overleed echter in het jaar 1650, en eenige dagen daarna beviel de
weduwe van eenen zoon, die men spoedig onder den naam van Willem den
III. zal leeren kennen.
Na den dood, van den Spaanschen koning Philips den IV. maakte de
fransche vorst Lodewijk de XIV., die gehuwd was, met eene dochter van
den overledenen Philips, aanspraak op de Spaansche Nederlanden, waarin
hij ook dadelijk eenige veroveringen maakte.
De Staten nu, wilden Lodewijk niet gaarne tot nabuur hebben en wisten een
verbond te sluiten met Engeland en Zweden, ten einde Lodewijk XIV weder
met Spanje te verzoenen. De vrede kwam dan ook terstond tot stand; maar
Lodewijk was hierover op onze Staten zeer verbitterd. Hij was echter te
loos, om hun terstond den oorlog aan te doen; eerst moest hij het verbond
tusschen Engeland en Zweden met de Staten hebben vernietigd, eerst
poogde hij de Staten er van af te trekken, doch toen hem dit mislukte,
beproefde hij het met Engeland, dat gemakkelijker ging. Ja, Karel liet zich
zelfs door Lodewijk overreden om met hem ons te beoorlogen.

De twee vorsten, wisten nu Zweden insgelijks aan hunne zijde te brengen,
en daarenboven spanden zij nog zamen met den Bisschop van Munster en
den keurvorst van Keulen, ten einde met vereende magt ons land te
overrompelen en te verdeelen.
Duister was dus het vooruitzigt. Wel sloten wij een verbond met onze oude
vijanden, de Spanjaarden, maar die waren nu te magteloos, om er veel van
te kunnen verwachten. Men zocht zich te wapenen, maar het was weder
inwendige verdeeldheid, die dit grootelijks verhinderde. De oneenigheid
ontsproot ter oorzake van den Prins van Oranje, die toen nog geene
staatsambten bekleedde, dat velen, en inzonderheid het gemeen, zeer
mishaagde.
Eindelijk stemde men echter toe, dat de Prins voor eenen veldtogt, den
veldtogt, die nu aanstaande was, en ook Oudewater zoude beroeren, zou
worden bevorderd.
Den 7 April 1672, werd door Lodewijk den XIV en Karel den II, aan de
Staten, gelijktijdig den oorlog aangezegd en naauwelijks was dit gebeurd,
of de Fransche, Munstersche en Keulsche legers trokken met eene
ontzaggelijke magt op ons land aan, die op omtrent 170,000 man begroot
werd. Overwinning op overwinning werd spoedig door hen behaald en
Oudewater viel insgelijks in den magt der franschen.231
Wij moeten dit echter eenigzints breeder uiteen zetten.
Het Sticht was nu bijna geheel in de magt der Franschen en ook Montfoort
werd den 25 Junij 1672 met een 150tal van hunne musketiers bezet.
Voorts had het leggen van een dam in den Rijn aan de Nieuwerbrug de
steden Woerden en Oudewater, doen besluiten, dat het ongeraden was, zich
te verdedigen, hoezeer er ook op aangehouden was. Zij zagen zich dus in de
noodzakelijkheid gebragt, eveneens van den Franschen koning vrijhoede te
verzoeken. Dit werd vergund, en de markgraaf van Rochefort werd op den
24 Junij met eenige honderde paarden in Woerden gelegerd, terwijl hij des
anderen daags ook eenig paardenvolk naar Oudewater zond. Beide steden

bedongen de gewone vrijheden.232 Tot dusverre Wagenaar. Omtrent dit
voor geheel ons vaderland en ook voor Oudewater zoo merkwaardig jaar,
meldt de Nederlandsche historieschrijver Lambert van den Bosch, ons233 in
betrekking tot de stad onzer beschrijving nog een aantal bijzonderheden, die
overwaardig zijn hier kortelijk te herhalen. Nadat Turenne den 11 Julij door
Nijmegen over de Maas naar ’s Hertogenbosch getrokken was, vervolgt hij
in dier voege:
De prins was met zijne troepen naar beneden afgezakt, en de Hollandsche
posten alom bezettende, beval hij den grave Willem de Hornes, (ook de
graaf van Hoorn genoemd) om zich een uur beneden Oudewater te legeren.
De stad bevond zich intusschen in de uiterste verlegenheid, en geen wonder,
daar er binnen hare wallen noch oorlogsvoorraad, noch garnizoen, noch een
genoegzaam getal burgers ter verdediging waren. Men begrijpt dus ligtelijk,
dat men vreesde den moedwil der vijanden ten prooi te zullen worden. Om
hierin echter zoo goed mogelijk te voorzien zond de magistraat aanstonds
een persoon naar Utrecht om aldaar te verblijven, met aandacht alles gade te
slaan en vandaar, der stede regering omtrent den stand van zaken te
verwittigen, met en door de posten die zij daartoe van plaats tot plaats
hielden; alzoo ontvingen zij op verscheidene uren des daags kondschap.
Intusschen verzuimde men alhier niet, Gecommitteerden naar ’s
Gravenhage te zenden; niet alleen om beklag te doen, over hunne afsnijding
van de gemeene defensie; maar eveneens om te verzoeken, dat in de
benarde veste het noodige garnizoen en oorlogsammunitie bezorgd werden;
tevens ook aandringende op eene spoedige herstelling en verbetering van de
stads wallen en sterkten; men beval den Gecommitteerden voorts, te
zeggen, en de Raden te doen overtuigen van de gewillige genegenheid der
burgerij voor vaderland en stad, die zich bereid toonde goed en bloed te
wagen.
Voorts verlangden de afgezanten te willen weten, indien hun de magt tot
tegenweêr ontbrak, hoe de autoriteiten der stad zich te gedragen hadden, als
de vijand Oudewater naderde, zijn legerschare zich voor de veste
ontplooide, en haar opeischte, daar zij den eed van getrouwheid aan den

staat hadden gedaan, en zonder hunne kennis geen ander Heer aannemen
konden. Op het eene zoo goed als op het andere, ontvingen zij echter weinig
troost en raad. Men besloot dus naar den prins te gaan, die met zijne troepen
te Bodegraven lag, maar de verwarring, die in de gemeene zaken heerschte
en den geringen tusschentijd die men had, om te overleggen wat men doen
zoude, deden hen ook van hier onverrigter zake wederkeeren.
Hagchelijk dus was den toestand binnen de verzwakte muren; wel is waar
lag de graaf van Hoorn met de zijnen omtrent een uur afstands van het
stedeken bij de Wierinkken en derzelver sluizen, kunnende hij daardoor
Oudewater en omtrek deels onder water zetten door middel van den Yssel,
wanneer er slechts water genoeg in opvloeit, maar gelijk de zorgeloosheid
dier tijden, de veste had doen vervallen, als niet bedenkende, ja bijna
onmogelijk achtende, dat eenig vijand tot zoo ver zoude kunnen inboren,
zoo was er in de stad bijna geen krijgstuig, dan slechts in een »vervuilden
hoek” een paar oude ijzeren stukken, en eene koperen goteling van vier
pond; buskruid bezat men niets. De magistraat zond naar deze en gene
plaats om eenige tonnetjes te koopen, doch ijdel was hunne poging,
alleenlijk zond de persoon; die te Utrecht op kondschap lag, nog een
tonnetje van ongeveer 80 ponden. Wanneer alles in de wapenen kwam, kon
de burgerij ter naauwernood 5 à 600 man uitmaken, anders konden de 2
compagnien niet boven de 300 mannen uitleveren.
Soldaten, officieren, commandeurs enz., had onze stad234 in geen 30 à 40
jaren gekend, zoodat de inwoners met den dappersten leeuwenmoed bezield
als zij waren, weinig konden uitrigten tegen de magt der Franschen, die als
een dreigend onweder van boven kwam opzetten.
Men wachtte echter nog op tijding uit Utrecht. Ondertusschen werd de
Magistraat van zijne naburen gewaarschuwd, dat het zeer verkieslijk zoude
zijn, bij tijds naar eenig goed accoord uit te zien, daar die van Utrecht al
gecapituleerd hadden; maar daartoe ging men echter nog niet over.
Daar komt eensklaps de persoon die te Utrecht op kondschap was, de
verpletterende tijding aan den magistraat berigten, dat hij in persoon de
Franschen binnen Utrecht had zien trekken, en hij ter naauwernood hen

vooruit had kunnen spoeden om dit berigt hier kenbaar te maken, niet
twijfelende of zij zouden zich ook spoedig voor de poorten van Oudewater
bevinden. En de bode had zich in die meening niet bedrogen. Immers de
Franschen nergens eenigen tegenstand vindende, zakten gedurig
nederwaarts af.
De graaf van Hoorn had echter door het openen der sluizen het land aan de
benedenzijde der stad onder water gezet, maar dit kon de dijken en het
hooge land boven de stad, naar de zijde van Utrecht, niet hinderen. De
magistraat aldus geen anderen uitkomst dan capituleren vinden kunnende,
en vernomen hebbende, dat de vijand in aantogt was, besloot ten laatste
hem in het gemoet te gaan, om eenige gunstige voorwaarden te bedingen;
en men had nog juist bij tijds dezen gewenschten maatregel genomen.
Naauwelijks toch waren de Gecommitteerden tot het naburig Montfoort
genaderd, of zij ontmoetten de Fransche voortroepen, aangevoerd door den
Markies de Genly. Ons gezantschap werd beleefdelijk door hem ontvangen
en hij deed hen terstond goede beloften.
Vreemd was hier de uitwerking, die de spoedige beslissing van de
Gecommitteerden gehad had. Zij toch waren 2 à 3 uren ter naauwernood ter
poorte uit, en treden haar nu weder binnen, vergezeld van genoemden
Markies en eene menigte musketiers. Dit gebeurde in den namiddag van
den 25 Junij 1672, des namiddags tusschen 2 en 3 ure; en ziet hier dus
Oudewater insgelijks gebukt onder de fransche overheersching. De Markies
Genly hield met zijne troepen halt, toen de Burgemeesters hem
ontmoetende ontvingen, als wanneer hij uit naam van zijne Majesteit
bekend maakte, dat om reden de stad zich zoo gewillig stelde onder de
gehoorzaamheid van den koning, zij ook zoude behouden vrijheid harer
regten, privilegien, goederen en personen, als ook van religie en
conscientie; voorts dat hij in den naam zijns konings tot bezetting binnen
Oudewater zoude leggen niet meerder dan 50 van zijne troepen of
musketiers. Deze waren allen edellieden, die te paard en te voet den koning
dienden. Hunne uniform bestond in een blaauwe casakke met zeer fraaije
passementen en lelien gegarneerd.

Het was echter eene geringe bezetting. Buskruid bezaten zij niet, zij hadden
geene andere verdedigingsmiddelen dan hunne snaphanen, pistolen en
zijdgeweer. Niemand dezer troepen sliep gedurende den nacht binnenshuis,
maar zij waren allen gedurig beurtelings op straat, uit vreeze van overvallen
te worden.
Zij schreven naar Utrecht om ammunitie en daar die ook zoo spoedig niet
kwam, verdeelden zij de 80 ponden kruid die men vroeger van Utrecht
ontvangen had.
Niet lang bleef het bij deze weinige manschappen, daar zij op den 29 Junij
des namiddags naar Utrecht vertrokken zijnde, zij des voormiddags
vervangen waren door ongeveer 300 fransche voetknechten, waarvan de
helft Zwitsers waren. Ook die vertoefden hier slechts een paar dagen, maar
op den 1 Julij kwamen hier in garnizoen niet minder dan 32 compagniën,
die ongeveer 1600 man sterk waren.
Dit was een zeer schoon volk, zijnde van het regiment Royal. Tot hun
legertros behoorden eene menigte paarden, muilezels, karren en bagage, en
zooals men ligtelijk begrijpt, ook de »fransche wijven soetelende” waren
insgelijks hierbij tegenwoordig. Wat echter de bedrijvigheid aanmerklijk
verhoogde en zeer afstak bij de blaauwe met leliën bestikte uniformen,
waren eene groote menigte paarden, koeijen, schapen etc., die onderwege
den boeren waren afgenomen, en nu mede ter stede werden binnengevoerd.
De officieren werden hier en daar bij de burgers gebilletteerd, maar de
soldaten, moesten zich op de wallen en in de baanhuizen behelpen.
De commandant der troepen, die in de stad verbleef, was een La Pornerie,
maar op den weg naar Utrecht lagen nog 9 standaarden Ruiterij, waarover
de Markies de Renti gebood.
Nadat de Franschen zich dus in en om Oudewater gelegerd hadden, eischte
de Commandeur van den magistraat al de timmerlieden om de ypenboomen
rondom den stads cingel staande, af te kappen, die tot pallissaden gebezigd
werden. Men groef namelijk boven op de wallen (in plaats van de
borstweringen, die geslecht lagen), eene diepe doorgaande voor, waarin de

pallissaden, beurtelings korte en lange, geplaatst werden. Daarna werden
deze zoo digt met aarde aangevoerd, dat men er slechts met een musket
konde doorschieten. Voorts hield men eene zeer scherpe wacht, terwijl het
aan een ieder verboden was, na negen ure des avonds over de straten te
gaan.
De stad aldus met een groot getal militairen bezet blijvende, deed de
Commandant ook eene brigade ruiterij leggen, van af de Nieuwpoort langs
den IJssel, dat dan grave van Hoorn, die zooals men weet tot het leger van
den prins behoorde, deed besluiten, zoo digt mogelijk ook met den zijnen
onder de stad post te vatten, ten einde aldus des te beter den vijand dagelijks
te bestoken in stede van door hem in zijn kwartier gedurig verontrust te
worden, en alzoo dit in het gezigt der stad op de sluis bij het huis te Vliet
het voordeeligst konde235 geschieden, zoo heeft hij, om den vijand te
misleiden, en op dat hij hem in de uitvoering van zijn plan niet hinderlijk
zoude zijn, 150 musketiers van zijn regiment, door den tiendeweg langs
Honkoop doen defileeren. Deze nu aan de andere zijde van Oudewater
aangekomen zijnde, bezetten de huizen, die aan den IJssel stonden, waaruit
zij onophoudelijk op het ruiterkwartier des vijands begonnen te vuren. Niet
alleen dat de krijgslist van den wakkeren grave van Hoorn gelukte, maar de
Franschen werden door het gestadig schieten van deze 150 man zoodanig
verontrust, dat zij naar Woerden, Montfoort en Utrecht om bijstand zonden,
en daar zij voor verdere bemoeijelijking bedacht waren, verbrandden zij de
meeste huizen van de buurtschap Willeskop en die om de stad stonden.
Toen intusschen de prins, in zijn kwartier het gestadig en langdurig schieten
hoorde, en den zwaren brand zag opgaan, wist zijn Hoogheid niet wat dit
beduidde.—Hij kwam dus eerlang met eenige Ruiterij tot aan
Goejanversluis en nu niet anders denkende of het voornoemden kwartier
werd aangegrepen, reed hij in persoon tot het huis te Vliet nabij de stad. De
krijgslist van den grave van Hoorn vernemende, droeg dit ’s prinsen hooge
goedkeuring weg, en ziende hoe de vijand nog immer aan de andere zijde
der stad misleid werd, deed de grave van Hoorn in het gezigt van het leger
der Franschen een retrenchement opwerpen. Dit alles geschiedde bijna
zonder verlies der onzen; slechts een Kapitein werd zwaar gekwetst. De

vijand daarentegen had naar berigt van gevangenen en overloopers een
aantal dooden, waaronder eenige voorname officieren.
Verder verhaalt van den Bosch nog het volgende, dat wij hier doen volgen:
»De Franschen hadden doorgaans grooten lust en moed om Holland in te
breken; en sekeren kapiteyn S. Mark, hoorende dat men het lant konde
onder water setten, bestond daar op te vragen, of men soo gantsch Holland
konde doen? men antwoorde hem ja: en dat hy maar eens op den tooren
klimmen soude, soo konde hy naaktelijk het water beneden de stad
rontomme sien stroomen. Hy vraagde, hoe het dan de steden maakten, of
die ook niet onder water raakten? men seyde neen, dat die hooger als het
platte lant waren, en dat men het water soo hoog door de sluysen in konde
laten als men wilde. Hy vraagde ten derde-malen, of het lant dan niet door
dit water bedorven wierd? en bericht werdende, dat de Hollanders liever
een bedorven, als geen lant hadden: en wanneer sy geen vyant meer en
hadden, dat sy dan hare landeryen met molens wederom droog maakten, de
welke met’er tijt wederom haar oude wesen ontfingen. Doen seyde hy met
een euvelen moed, ik hoore wel, die duyvels sullen aan onsen koning niets
willen geven.
»Voorts waren sy bysonder bezig de gestalte van de Staatsche troepen, aan
Goverwelle, uyt te vorsschen; vragende, hoe den oversten van de
Hollandsche troepen, beneden de stad, genaamt was, en hoe veel volk hy by
hem hadde; men antwoorde haar, dat het de Grave van Hoorn was, zijnde
onseker hoe sterk hy van volk mochte zijn: maar men giste omtrent de 6000
man, gelijk ook de burgers niet beter wisten: hoewel naderhant gebleken is,
dat sy in het eerste geen 1000 mannen konden uyt-maken. Sy spraken veel
van Leyden, en wilden daar na toe: men seyde, sy moesten dan aan een
andere oort zijn, en voor-by het quartier van sijn Hoogheyt den Prince van
Orangien trekken; sy vraagden, hoe sterk die van volk was? het antwoord
was, dat, dewijle hy den Generaal was, wel 10000 man moeste by hem
hebben: waar op sy, dit getal seer gering oordeelende, het een lichte saak
achten, en seyden geheel Holland te vermeesteren: maar toen men haar
berichte, dat sy seer naauwe en afgetrencheerde dijken en wegen te

passeeren hadden, daar sy naauwelijks 4 a 5 in front souden konnen
aankomen, sakten den grooten moed gelijk sy was opgeswollen.
»Den 11 July, als wanneer ik des morgens vroeg ten half drien, met het
opkomen van den dag, op-geschelt werdende, en ter bedde uyt-springende,
sag ik door het venster de gantsche stad in rep en roer, en den Marquis de
Genly, sittende op syn paart voor mijn deur, met een seker ander groot Heer,
wiens name ik niet en wete: ik haastede my terstont in mijn onderklederen
na de deur, en die geopent hebbende, begon den Marquis te lagchen,
seggende, zoo moeste ik u eens komen opwekken; (ik was hem nu bekent
geworden, als meermalen met hem gesproken hebben) ik antwoorde, u
Excellentie moet sijn selven noch al eerder opgewekt hebben, soude anders
soo vroeg niet hier konnen wesen van Utrecht; hij seyde, dat is waer: ik
hebbe den gantschen nacht te paarde geseten, en omtrent de stad stil
gehouden, tot dat den dag aanquam. Ik vraagde, wat dit gewoel beteekende,
dat ik soo alles in beweging sag? hy seyde, dat hy was gekomen, om de
troepen by-een te vergaderen: meerder derfde ik niet ondersoeken,
genoegsaam merkende, dat het Fransche guarnisoen van hier vertrekken
soude. Doen veranderende van dit discours, vraagde, of ik ook sijn
Excellentie met yets tot ontnuchteringe dienen konde? hy seyde in het
eerste neen: maar korts daar aan eyschte hy een stuk broot met boter; ik
dede aanstonds twee wel-geboterde stukken witte-broot op een schoon
taaffel-bort langen, waar van den Marquis eene, en dien anderen Heer het
andere nam, en nuttigden. Ik vraagde doen, of ik hem wijn wilde doen
brengen? maar weygerde zulks; ik seyde in mijn kelder te hebben morelle-
bier, dat ongemeen schoon was: dit was hem aangenaam, en nam hy met
dien anderen Heer daar van een goede teug naar hem. Naar eenige andere
discoursen, zoo preste hy het volk hard aan tot den uyttocht, zoo dat
tusschen 5 uuren en half sessen, het volk aan het marcheeren raakten;
gevende de sleutelen van de stads poorten buyten de stad, aan de
Burgemeesteren wederom, met beding, geen poorten te openen tot den
middag. In het uyttrekken wierd dat koopere stukjen op een karre geladen,
om mede te nemen: daar den oudsten Burgemeester tegen sprak, en ontbood
my, om te seggen aan den Marquis, dat het geen stuk was van den Staat,
maar eygen aan de stad, aan de welke sijn Excellentie immuniteyt van hare
goederen, in den naam des Konings hadde toegesegt: maar den Marquis

antwoorde het komt nu den Koning toe, en nam het mede. Anders is aan de
stad de minste overlast niet gedaan.”
Gedurende den tijd, dat deze toebereidselen tot den uittogt gemaakt werden,
waren de poorten echter aan de andere zijde der stad gesloten, opdat men in
het staatsche leger onkundig van hun voornemen zoude zijn; maar een zeker
burger, liet zich aan de zijde der stad waar de graaf van Hoorn zich bevond
van de vestingmuur glijden en door de grachten badende, liep hij met de
meesten spoed naar des graven kwartier, de tijding brengende, dat de
Franschen ter stede waren uitgetogen. Innig verheugd was van Hoorn bij
het vernemen van deze tijding, en niettegenstaande er tusschen 6 en 7 ure
een hevige regenbui zich boven deze stad ontlastte, zoo verzuimde hij
echter niet tusschen 10 en 11 ure met zijne bijhebbende ruiterij en
verscheidene compagniën voetknechten voor de stad te komen en te
eischen, dat men hem de poorten openen zoude. De burgers liepen
aanstonds naar den burgemeester en ontnamen hem de sleutels,
niettegenstaande hij niet onwillig was, en onder vreugde en gejuich nam de
Graaf weder bezit van de stad; Oudewater behoorde weder aan de staatsche
zijde! Tot het gevolg van van Hoorn behoorden den Graaf van Merode, den
Heer van Brederode, zijn eigen broeder Graaf Jan en anderen.
Naauwelijks had de Graaf weder bezit van de stad genomen, of hij zond
eene partij ruiters, ieder een partij musketiers achter zich hebbende, den
vijand achterna, die hen tot aan de stad Montfoort op de hielen vervolgden
en een gedeelte der achterhoede aangrepen. Des namiddags kwam de
Luitenant van den Heer van Amerongen met 36 gevangenen waaronder
eenige koninklijke Sauvergardes binnen de veste weder. Juist ter regter tijd
en ure was de Graaf van Hoorn ter bezetting van Oudewater aangekomen.
Immers nadat de Koning, van Zeijst was opgebroken en de Franschen
Oudewater, Woerden en Montfoort ontledigd hadden, bestoken zij niet lang
daarna, voornamelijk door den bekenden Mombas opgeruid, dezelve weder
te bezetten, gelijk zij ook Woerden en Montfoort gedaan hebben, maar
Oudewater werd door de spoedige aankomst van den Graaf van Hoorn
ontzet, daar de Franschen bereids met 2 geheele regimenten, dat van
Piedmont en Royal Vaisseaux tot nabij Montfoort genaderd waren. Zij
echter, zegt van den Bosch, vernemende, »dat hen de Graaf was

voorgekomen, droopen sy weder na Utrecht; daar het hun seker seer licht
soude gevallen hebben de stad, noch geensins versterkt, te bemachtigen, en
de Staatschen weder na haar voorige post te doen verhuysen.
»Nu liet sijn Excellentie in ’t eerste aldaar slechts 300 man van de Mariners,
met eenige ruyterye: maar alsoo geen naardere ordre bequam, bleef daar
slechts een Capiteyn met 50 man, durvende sijn Excellentie, sonder bevel,
op eygen gesag, tot geen meerder besluyten. Desen Capiteyn Commandant
met die gedetacheerde 50 man, wierden alle weken verandert; in-voegen
Oudewater doenmaals maar als een brandwacht en buyten-post gerekent
wierd.
»Den 29. July, des avonts, ontfongen de Regeerders een brief van Utrecht,
geschreven by den Franschen Commandant aldaar, dat die van Oudewater
daar moesten komen voor seven uuren des volgenden daags, of dat hy de
stad in 4 hoeken soude in den brand doen steken; waar op aanstonds in dien
nacht Gecommitteerden naar Utrecht vertrokken, die op den 31. des avonts
wederkeerende: verstond men, dat op de stad van de Franschen een
brandschattinge gelegt was, om binnen sekeren korten tijt op te brengen 700
paar schoenen, behalven dat’er noch een vereeringtjen in de kaars vloog
voor seker Heer; en bequamen die van Oudewater daar door een vryen pas
van de Franschen Commandant.
»Den 11. Augusti quam sijn Hoogheyt de eerste-maal hier de wallen, en de
gelegentheyt van de stad, besichtigen; maar die te versterken, wierd
doenmaals by verscheydene, van die by hem waren, niet raadsaam
geoordeelt; doch naderhant op het sterk vertoog van sijn Excellentie den
Graaf van Hoorn, die de behoudenisse der stad als een notabele post ter
herten nam, soo wierd hem van sijn Hoogheyt toe-gelaten, te doen soo hem
goet docht; die dan ook op den 15. September sijn broeder, de Heer Johan
Belgicus, Graaf de Hornes, Luytenant-Colonel van een regiment Mariners
hier binnen sond, met 600 man te voet, en 200 te paarde, om hier
guarnisoen te houden. Waar op de burgerye moed scheppende, soo hebben
sy aanstonts alle, selfs ook de Burgemeesteren, Predikanten, mannen en
vrouwen, haar na de wallen begeven, de borstweeringen opgeworpen, en
soo het werk tot versterkinge begonnen; ’t welke sijn Hoogheyt (op den 20.

dito hier voor de tweede reyse gekomen) siende, sprak de burgers moed
aan, seggende, Mannen werkt wel aan, ik sal u alle mogelijke bescherminge
bestellen.
»Daags te vooren, op den 19. September, was ook den Colonel Palm,
doenmaals noch Luytenant Colonel, hier binnen gekomen met 5 vaandelen
Mariners, en daar-en-boven sestig ruyters onder den Majoor Ittersum.
»Den 20. dito quam sijn Excellentie Graaf Willem van Hoorn, des avonts
ten tien uuren, met sijn hof-houdinge, persoonelijk in guarnisoen binnen
Oudewater, logeerende in het huys van den overleden Heer Bailju Hendrik
Schrijver, de welke aanstonts, door ordere van sijn Hoogheyt, den vierden
huysman op ontbood, om aldaar te komen werken aan de fortificatien. En
heeft sijn Excellentie, soo lange hy hier was, en sijn Heer broeder, Graaf
Johan Belgicus, van sijn Hoogheyt naderhand tot Gouverneur gestelt, op
den 2. December geduuriglijk met een onvermoeyden yver gearbeyd tot het
brengen van dese stad in een bequame en genoegsame defensie, soo veele
doenlijk was, en noch tegenwoordig te sien is. Jonker Wilhelm Ingelby,
namaals Capiteyn geworden onder het regiment van sijn Excellentie den
Graaf van Hoorn, was van sijn Hoogheyt gestelt tot Majoor van de stad; en
dewijle hy sich op de vesting-bouw wel verstond, soo stak hy voor de
poorten aanstonds af halve-manen, en andere werken, die ook met groote
vlijt in korten voltrokken wierden. Het geschut wierd alomme op de wallen
gebracht, en de bateryen gemaakt zijnde, daar op geplant: een groote
quantiteyt van ammunitie wierd hier binnen gevoert; en aldus kreeg
Oudewater in ’t korte een heel ander oog; en de plaatse, die by duysenden
Hollanders naauwlijks genoemt, en by weynige voor een Hollandsche stad
bekent was, wierd tegenwoordig een grensstad, en versekerde waar-burg
van die Provintie, welke alle uuren den vyant te gemoed sag. De besettinge
van Oudewater was ook te meer noodzakelijk, dewijle de Franschen aan die
zijde met de minste moeyte, en het schijnbaarste gevolg soude hebben
konnen door-dringen.
»Sijn Excellentie sond geduurig partyen op den vyant uyt, die nooyt
wederom quamen, of hadden dese of gene gevangens: gelijk als op den 21.
van de maant September, wierden’er 18 a 19 Fransche gevangenen binnen

Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
ebookultra.com

Cilia Methods and Protocols 1st ed. 2024 Edition Edition Vito Mennella

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Cilia Methods and Protocols 1st ed. 2024 Edition Edition Vito Mennella

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Slide 66

Slide 67

Slide 68

Slide 69

Slide 70

Slide 71

Slide 72

Slide 73

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics