Cytokine Bioassays Methods and Protocols 1st Edition Ivana Vancurova (Eds.)

Cytokine Bioassays Methods and Protocols 1st Edition Ivana Vancurova (Eds.)
Cytokine Bioassays Methods and Protocols 1st Edition Ivana Vancurova (Eds.)
Cytokine Bioassays Methods and Protocols 1st Edition Ivana Vancurova (Eds.)

1. Visit https://ebookultra.com to download the full version and
explore more ebooks or textbooks
Cytokine Bioassays Methods and Protocols 1st
Edition Ivana Vancurova (Eds.)
_____ Click the link below to download _____
https://ebookultra.com/download/cytokine-bioassays-methods-
and-protocols-1st-edition-ivana-vancurova-eds-2/
Explore and download more ebooks or textbooks at ebookultra.com

2. Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Cytokine Bioassays Methods and Protocols 1st Edition Ivana
Vancurova (Eds.)
https://ebookultra.com/download/cytokine-bioassays-methods-and-
protocols-1st-edition-ivana-vancurova-eds-2/
Polyadenylation Methods and Protocols 1st Edition Joanna
Rorbach
https://ebookultra.com/download/polyadenylation-methods-and-
protocols-1st-edition-joanna-rorbach/
Microsatellites Methods and Protocols 1st Edition
Panagiotis Madesis
https://ebookultra.com/download/microsatellites-methods-and-
protocols-1st-edition-panagiotis-madesis/
Biofuels Methods and Protocols 1st Edition Shahabaddine
Sokhansanj
https://ebookultra.com/download/biofuels-methods-and-protocols-1st-
edition-shahabaddine-sokhansanj/

3. Liposome Methods and Protocols 1st Edition Subroto
Chatterjee
https://ebookultra.com/download/liposome-methods-and-protocols-1st-
edition-subroto-chatterjee/
Apoptosis Methods and Protocols 1st Edition Demetrius
Matassov
https://ebookultra.com/download/apoptosis-methods-and-protocols-1st-
edition-demetrius-matassov/
Xenotransplantation Methods and Protocols 1st Edition
Veronica Tisato
https://ebookultra.com/download/xenotransplantation-methods-and-
protocols-1st-edition-veronica-tisato/
Protoplast Technology Methods and Protocols 1st Edition
Kan Wang
https://ebookultra.com/download/protoplast-technology-methods-and-
protocols-1st-edition-kan-wang/
Chromatin Remodeling Methods and Protocols 1st Edition
Junbiao Dai
https://ebookultra.com/download/chromatin-remodeling-methods-and-
protocols-1st-edition-junbiao-dai/

5. Cytokine Bioassays Methods and Protocols 1st Edition
Ivana Vancurova (Eds.) Digital Instant Download
Author(s): Ivana Vancurova (eds.)
ISBN(s): 9781493909285, 1493909282
Edition: 1
File Details: PDF, 8.83 MB
Year: 2014
Language: english

6. Cytokine
Bioassays
Ivana Vancurova Editor
Methods and Protocols
Methods in
Molecular Biology 1172

7. METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
Series Editor
John M. Walker
School of Life Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK
For further volumes:
http://www.springer.com/series/7651

9. Cytokine Bioassays
Methods and Protocols
Edited by
Ivana Vancurova
Department of Biological Sciences, St. John’s University, Queens, NY, USA

10. ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)
ISBN 978-1-4939-0927-8 ISBN 978-1-4939-0928-5 (eBook)
DOI 10.1007/978-1-4939-0928-5
Springer New York Heidelberg Dordrecht London
Library of Congress Control Number: 2014939314
© Springer Science+Business Media New York 2014
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifi cally the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microfi lms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed. Exempted from this
legal reservation are brief excerpts in connection with reviews or scholarly analysis or material supplied specifi cally for
the purpose of being entered and executed on a computer system, for exclusive use by the purchaser of the work.
Duplication of this publication or parts thereof is permitted only under the provisions of the Copyright Law of the
Publisher’s location, in its current version, and permission for use must always be obtained from Springer. Permissions
for use may be obtained through RightsLink at the Copyright Clearance Center. Violations are liable to prosecution
under the respective Copyright Law.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not
imply, even in the absence of a specifi c statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and
regulations and therefore free for general use.
While the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication, neither
the authors nor the editors nor the publisher can accept any legal responsibility for any errors or omissions that may be
made. The publisher makes no warranty, express or implied, with respect to the material contained herein.
Printed on acid-free paper
Humana Press is a brand of Springer
Springer is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)
Editor
Ivana Vancurova
Department of Biological Sciences
St. John’s University
Queens, NY , USA

11. v
Cytokines are pleiotropic regulatory proteins involved in essentially all biological processes
and associated with a wide range of diseases, including immune and infl ammatory disor-
ders, as well as many types of cancer and leukemia. Examples of cytokines include interleu-
kins, chemokines, growth factors, interferons, and the tumor necrosis factor family.
Information about the qualitative and quantitative nature of cytokine expression and release
is essential for the understanding of physiological and pathological processes. However, the
cytokine detection in biological and clinical samples faces many challenges that include
the low abundance, the need to distinguish between active and latent cytokine forms,
and the need to measure multiple cytokines in a single assay. This volume provides a compre-
hensive collection of classic and cutting-edge methodologies that are used to analyze and
quantify cytokines and their biological activities in complex biological and clinical samples.
The chapters are divided into three main categories. The fi rst category focuses on the
immunodetection of released cytokines in tissue culture supernatants, plasma, serum, and whole
blood samples by immunoassays. These immunoassays measure the total concentrations of
released cytokines regardless of their biological activities, and include ELISPOT, immunob-
lotting, and ELISA. In addition, the complexity of cytokine responses has led to the develop-
ment of multiplex technologies that can simultaneously detect large numbers of cytokines in
small sample volumes. Thus, the fi rst part also includes the recently developed multiplex
arrays that allow the simultaneous measurement of multiple cytokines in small sample vol-
umes with time-saving advantages and less cost compared to other immunoassays.
Since immunoassays cannot distinguish between biologically active and inactive cyto-
kines, bioassays are used to measure different biological activities of cytokines, such as
cytokine- induced cytokine release, chemotaxis, phagocytosis, proteasome activity, and
immunoglobulin class switching. The second part focuses on the analysis of biologically
active cytokines by bioassays using neutralizing antibodies, chemotaxis assay, cytokine-
induced phagocytosis assay, proteasome activity assay, and analysis of cytokine-induced
immunoglobulin class switching. In addition, since cytokines exert their functions through
binding to cytokine receptors, this category also includes methods focused on the analysis
of expression and function of cytokine receptors.
Often, there is a need to identify the cytokine-producing cells, or to analyze the intra-
cellular cytokine protein levels or the mechanisms regulating cytokine expression. The third
part focuses on the analysis of intracellular cytokines by fl ow cytometry, immunohistochem-
istry, immunofl uorescence confocal microscopy, and western blotting. In addition, this cat-
egory includes protocols for quantitative analysis of cytokine gene expression by real-time
RT-PCR, luciferase assay, analysis of the cytokine promoter occupancy by chromatin immu-
noprecipitation, and analysis of alternative splicing of cytokine genes.
There is no one best method, since each has its own merits and limitations. Choosing
the right method depends on the sample, purpose of the assay, and the available instrumen-
tation. Often, using combined information from several different approaches can yield the
most accurate information about the quantitative and qualitative nature of cytokine expres-
sion. The reliability of all the protocols has been tested in laboratories around the world.
Pref ace

12. vi
Each chapter is appended by notes that navigate through the protocol and serve as a
troubleshooting guide. By covering a broad variety of methods used in cytokine research
and analysis, we hope that this book will be useful not only to biochemists, molecular biolo-
gists, and immunologists, but also to physician-scientists working in the fi eld of cytokine
research.
I would like to thank all the authors for their enthusiastic help and support in assem-
bling this volume; I fully realize that in the highly competitive environment of academic
research, many scientists are reluctant to commit their time to writing book chapters and
method articles. I also would like to express my gratitude to the series editor, Dr. John
Walker, and the outstanding staff of Humana Press for their support, help, and
encouragement.
Queens, NY Ivana Vancurova
Preface

13. vii
Contents
Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
PART I DETECTION OF RELEASED CYTOKINES BY IMMUNOASSAYS
1 The Challenge of Measuring Elusive Immune Markers
by Enzyme-Linked Immuno-Spot (ELISPOT) Technique. . . . . . . . . . . . . . . . 3
Maria Faresjö
2 Analysis of the Released Nuclear Cytokine HMGB1 in Human Serum . . . . . . 13
Haichao Wang, Lin Zhao, Jianhua Li, Shu Zhu, and Maggie Yeung
3 ELISA-Based Assay for IP-10 Detection from Filter Paper Samples . . . . . . . . . 27
Camilla Heldbjerg Drabe, Thomas Blauenfeldt, and Morten Ruhwald
4 Enhanced ELISA Based on Carboxymethylated Dextran Coatings. . . . . . . . . . 39
Benoît Liberelle, Charles Fortier, and Gregory De Crescenzo
5 A Novel Three-Dimensional Biosensor Based on Aluminum Oxide:
Application for Early-Stage Detection of Human Interleukin-10 . . . . . . . . . . . 49
Michael Lee, Abdoullatif Baraket, Nadia Zine, Miguel Zabala,
Francesca Campabadal, Raffaele Caruso, Maria Giovanna Trivella,
Nicole Jaffrezic-Renault, and Abdelhamid Errachid
6 Quantification of Multiple Cytokines and Chemokines
Using Cytometric Bead Arrays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Gemma Moncunill, Joseph J. Campo, and Carlota Dobaño
7 A Useful Guide for Analysis of Immune Markers
by Fluorochrome (Luminex) Technique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
Maria Faresjö
PART II CYTOKINE BIOASSAYS
8 Control of Pro-inflammatory Cytokine Release from Human
Monocytes with the Use of an Interleukin-10 Monoclonal Antibody . . . . . . . . 99
Hardik Patel and Dennis Davidson
9 Cytokine-Induced Neutrophil Chemotaxis Assay. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
Dennis Davidson and Hardik Patel
10 An In Vitro One-Dimensional Assay to Study Growth
Factor-Regulated Tumor Cell–Macrophage Interaction . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
Ved P. Sharma, Brian T. Beaty, Dianne Cox, John S. Condeelis,
and Robert J. Eddy
11 Chemotactic Responses by Macrophages to a Directional Source
of a Cytokine Delivered by a Micropipette. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Michael Cammer and Dianne Cox

14. viii
12 Assessment of Phagocytic Activity of Cultured Macrophages
Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Lokesh Sharma, Wenjun Wu, Sanjay L. Dholakiya, Samir Gorasiya,
Jiao Wu, Ravikumar Sitapara, Vivek Patel, Mao Wang, Michelle Zur,
Shloka Reddy, Nathan Siegelaub, Katrina Bamba, Frank A. Barile,
and Lin L. Mantell
13 Assessment of Cytokine-Modulated Proteasome Activity . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Christopher J. Kirk, Saul R. Powell, and Edmund J. Miller
14 Evaluation of the Adverse Effect of Low Concentration of Cadmium
on Interleukin-4 Induced Class Switch Recombination
in Burkett’s Lymphoma Raji Cell Line . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Vladimir Poltoratsky
15 A Mix-and-Measure Assay for Determining the Activation Status
of Endogenous Cdc42 in Cytokine-stimulated Macrophage Cell Lysates . . . . . 173
Veronika Miskolci, Désirée Spiering, Dianne Cox, and Louis Hodgson
16 Analysis of the Cell Surface Expression of Cytokine Receptors
Using the Surface Protein Biotinylation Method . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
Mahmud Arif Pavel, Clarissa Lam, Parul Kashyap,
Zahra Salehi- Najafabadi, Gurpreet Singh, and Yong Yu
17 Detection of CXCR2 Cytokine Receptor Surface Expression
Using Immunofluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
Clarissa Lam, Mahmud Arif Pavel, Parul Kashyap,
Zahra Salehi- Najafabadi, Victoria Valentino, and Yong Yu
18 Detecting Tie2, an Endothelial Growth Factor Receptor,
by Using Immunohistochemistry in Mouse Lungs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Prajna P. Guha, Sascha A. David, and Chandra C. Ghosh
19 Use of shRNA for Stable Suppression of Chemokine
Receptor Expression and Function in Human Cancer Cell Lines . . . . . . . . . . . 209
Nicole Salazar, Daniel Muñoz, James Hoy, and Bal L. Lokeshwar
PART III ANALYSIS OF CYTOKINE INTRACELLULAR PROTEIN
LEVELS AND GENE EXPRESSION
20 Intracellular Staining and Detection of Cytokines
by Fluorescence-Activated Flow Cytometry. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Giulia Freer
21 Cytokine Detection by Flow Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235
Jian-Ge Qiu, Xiao-Long Mei, Zhe-Sheng Chen, and Zhi Shi
22 Analysis of IL-17 Production by Flow Cytometry and ELISPOT Assays . . . . . 243
Ling Zhao, Yuan Chou, Yanfang Jiang, Zhenyu Jiang,
and Cong-Qiu Chu
23 Interleukin-1 (IL-1) Immunohistochemistry Assay in Oral Squamous
Cell Carcinoma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Takaaki Kamatani
Contents

15. ix
24 Immunofluorescence and Subsequent Confocal Microscopy of Intracellular
TNF in Human Neutrophils . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Janet Rollins and Veronika Miskolci
25 Evaluating Cytoplasmic and Nuclear Levels of Inflammatory
Cytokines in Cancer Cells by Western Blotting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271
Himavanth R. Gatla, Bipradeb Singha, Valerie Persaud,
and Ivana Vancurova
26 Western Analysis of Intracellular Interleukin-8 in Human
Mononuclear Leukocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
Veronika Miskolci, Louis Hodgson, Dianne Cox, and Ivana Vancurova
27 Quantitative Analysis of Bortezomib-Induced IL-8 Gene
Expression in Ovarian Cancer Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
Bipradeb Singha, Sai A. Phyo, Himavanth R. Gatla,
and Ivana Vancurova
28 Analysis of LPS-Induced, NFκB-Dependent Interleukin-8
Transcription in Kidney Embryonic Cell Line Expressing TLR4
Using Luciferase Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
Tamara Yunusova, Mumtaz Akhtar, and Vladimir Poltoratsky
29 Chromatin Immunoprecipitation Analysis of Bortezomib- Mediated
Inhibition of NFκB Recruitment to IL-1β and TNFα Gene
Promoters in Human Macrophages. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315
Shannon Sanacora, Tzu-Pei Chang, and Ivana Vancurova
30 Analysis of TGFβ1 and IL-10 Transcriptional Regulation
in CTCL Cells by Chromatin Immunoprecipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329
Tzu-Pei Chang, Myra Kim, and Ivana Vancurova
31 Radiolabeled Semi-quantitative RT-PCR Assay for the Analysis
of Alternative Splicing of Interleukin Genes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343
Felitsiya Shakola, Stephen Byrne, Kainaat Javed, and Matteo Ruggiu
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363
Contents

17. xi
MUMTAZ AKHTAR • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and
Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
KATRINA BAMBA • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
ABDOULLATIF BARAKET • Institut de Sciences Analytiques , Université de Lyon ,
Villeurbanne , France
FRANK A. BARILE • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
BRIAN T. BEATY • Department of Anatomy and Structural Biology , Albert Einstein College
of Medicine , Bronx , NY , USA
THOMAS BLAUENFELDT • Clinical Research Centre , Copenhagen University hospital of
Hvidovre , Copenhagen , Denmark
STEPHEN BYRNE • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens ,
NY , USA
MICHAEL CAMMER • Offi ce of Collaborative Science & Skirball Institute of Biomolecular
Medicine, New York University Langone Medical Center , New York , NY , USA
FRANCESCA CAMPABADAL • Centro Nacional de Microelectrónica ,
Instituto de Microelectrónica de Barcelona , Barcelona , Spain
JOSEPH J. CAMPO • Barcelona Centre for International Health Research (CRESIB) ,
Hospital Clínic - Universitat de Barcelona , Barcelona, Catalonia , Spain
RAFFAELE CARUSO • Consiglio Nazionale Ricerche, Clinical Physiology Institute ,
Milan , Italy
TZU-PEI CHANG • Department of Biology , St. John’s University , Queens , NY , USA
ZHE-SHENG CHEN • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
YUAN CHOU • Division of Arthritis and Rheumatic Diseases , Oregon Health & Science
University , Portland , OR , USA
CONG-QIU CHU • Division of Arthritis and Rheumatic Diseases , Oregon Health & Science
University , Portland , OR , USA
JOHN S. CONDEELIS • Department of Anatomy and Structural Biology , Albert Einstein
College of Medicine , Bronx , NY , USA
DIANNE COX • Department of Anatomy and Structural Biology , Gruss-Lipper Biophotonics
Center, Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University , Bronx , NY , USA
GREGORY DE CRESCENZO • Department of Chemical Engineering , École Polytechnique
de Montréal , Montréal , QC , Canada
SASCHA A. DAVID • Department of Nephrology and Hypertension , Medical School Hannover ,
Hannover , Germany
DENNIS DAVIDSON • Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Stony Brook Long Island
Children’s Hospital , Stony Brook University , Stony Brook , NY , USA
SANJAY L. DHOLAKIYA • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
Contributors

18. xii
CARLOTA DOBAÑO • Barcelona Centre for International Health Research (CRESIB) ,
Hospital Clínic - Universitat de Barcelona , Barcelona, Catalonia , Spain
CAMILLA HELDBJERG DRABE • Department of Pulmonary and Infectious Diseases ,
Copenhagen University hospital of Hillerød , Copenhagen , Denmark
ROBERT J. EDDY • Department of Anatomy and Structural Biology , Albert Einstein
College of Medicine , Bronx , NY , USA
ABDELHAMID ERRACHID • Institut de Sciences Analytiques , Université de Lyon ,
Villeurbanne , France
MARIA FARESJÖ • School of Health Sciences, Department of Natural Science
and Biomedicine, The Biomedical Platform, Jönköping University, Jönköping, Sweden
CHARLES FORTIER • Department of Chemical Engineering , École Polytechnique de Montréal ,
Montréal , QC , Canada
GIULIA FREER • Department of Translational Medicine, Retrovirus Center ,
University of Pisa , Pisa , Italy
HIMAVANTH R. GATLA • Department of Biology , St. John’s University , Queens , NY , USA
CHANDRA C. GHOSH • Division of Nephrology, Center for Vascular Biology Research ,
Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School , Boston , MA , USA
SAMIR GORASIYA • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
PRAJNA P. GUHA • Roger Williams Medical Center, Cancer Immunotherapy , Providence ,
RI , USA
LOUIS HODGSON • Department of Anatomy and Structural Biology , Gruss-Lipper
Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University , Bronx ,
NY , USA
JAMES HOY • Sylvester Comprehensive Cancer Center , University of Miami Miller School of
Medicine , Miami , FL , USA
NICOLE JAFFREZIC-RENAULT • Institut de Sciences Analytiques , Université de Lyon ,
Villeurbanne , France
KAINAAT JAVED • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
YANFANG JIANG • Department of Central Laboratory, The First Hospital ,
Jinlin University Normal Bethune Medical College , Changchun , China
ZHENYU JIANG • Department of Rheumatology, The First Hospital , Jinlin University
Normal Bethune Medical College , Changchun , China
TAKAAKI KAMATANI • Department of Oral and Maxillofacial Surgery , Showa University
School of Dentistry , Tokyo , Japan
PARUL KASHYAP • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens ,
NY , USA
MYRA KIM • Department of Biology , St. John’s University , Queens , NY , USA
CHRISTOPHER J. KIRK • Onyx Pharmaceuticals , South San Francisco, CA, USA
CLARISSA LAM • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
MICHAEL LEE • Institut de Sciences Analytiques , Université de Lyon , Villeurbanne , France
JIANHUA LI • Laboratory of Biomedical Sciences , The Feinstein Institute
for Medical Research, North Shore-LIJ Health System , Manhasset , NY , USA
BENOÎT LIBERELLE • Department of Chemical Engineering , École Polytechnique
de Montréal , Montréal , QC , Canada
BAL L. LOKESHWAR • Department of Urology , University of Miami Miller
School of Medicine , Miami , FL , USA
Contributors

19. xiii
LIN L. MANTELL • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
XIAO-LONG MEI • Department of Cell Biology and Institute of Biomedicine, College of Life
Science and Technology , Jinan University , Guangzhou , China
EDMUND J. MILLER • Center for Heart and Lung Research , The Feinstein Institute for
Medical Research , Manhasset , NY , USA; Medicine and Molecular Medicine, Hofstra
North Shore-LIJ Medical School, Hempstead, NY, USA
VERONIKA MISKOLCI • Department of Anatomy and Structural Biology , Albert Einstein
College of Medicine of Yeshiva University , Bronx , NY , USA
GEMMA MONCUNILL • Barcelona Centre for International Health Research (CRESIB) ,
Hospital Clínic - Universitat de Barcelona , Barcelona, Catalonia , Spain
DANIEL MUÑOZ • Research Service, Miami VA Medical Center , University of Miami Miller
School of Medicine , Miami , FL , USA
HARDIK PATEL • The Feinstein Institute for Medical Research , Manhasset , NY , USA
VIVEK PATEL • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
MAHMUD ARIF PAVEL • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens ,
NY , USA
VALERIE PERSAUD • Department of Biology , St. John’s University , Queens , NY , USA
SAI A. PHYO • Department of Biology , St. John’s University , Queens , NY , USA
VLADIMIR POLTORATSKY • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
SAUL R. POWELL • Cardiac Metabolism Laboratory , The Feinstein Institute for Medical
Research , Manhasset , NY , USA; Molecular Medicine and Science Education Hofstra
North Shore-LIJ Medical School, Hempstead, NY, USA
JIAN-GE QIU • Department of Cell Biology and Institute of Biomedicine, College of Life
Science and Technology , Jinan University , Guangzhou , China
SHLOKA REDDY • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
JANET ROLLINS • Division of Natural Sciences , College of Mount Saint Vincent , Riverdale ,
NY , USA
MATTEO RUGGIU • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens ,
NY , USA
MORTEN RUHWALD • Clinical Research Centre , Copenhagen University hospital
of Hvidovre , Copenhagen , Denmark
NICOLE SALAZAR • Sylvester Comprehensive Cancer Center , University of Miami Miller
School of Medicine , Miami , FL , USA
ZAHRA SALEHI-NAJAFABADI • Department of Biological Sciences , St. John’s University ,
Queens , NY , USA
SHANNON SANACORA • Department of Biology , St. John’s University , Queens , NY , USA
FELITSIYA SHAKOLA • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens ,
NY , USA
LOKESH SHARMA • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
VED P. SHARMA • Department of Anatomy and Structural Biology , Albert Einstein
College of Medicine , Bronx , NY , USA
ZHI SHI • Department of Cell Biology and Institute of Biomedicine, College of Life Science
and Technology , Jinan University , Guangzhou , China
Contributors

20. xiv
NATHAN SIEGELAUB • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
GURPREET SINGH • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens ,
NY , USA
BIPRADEB SINGHA • Department of Biology , St. John’s University , Queens , NY , USA
RAVIKUMAR SITAPARA • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
DÉSIRÉE SPIERING • Department of Anatomy and Structural Biology , Gruss-Lipper
Biophotonics Center Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University ,
Bronx , NY , USA
MARIA GIOVANNA TRIVELLA • Consiglio Nazionale Ricerche, Clinical Physiology Institute
and University of Pisa , Pisa , Italy
VICTORIA VALENTINO • Department of Biological Sciences , St. John’s University ,
Queens , NY , USA
IVANA VANCUROVA • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens ,
NY , USA
HAICHAO WANG • Laboratory of Emergency Medicine , The Feinstein Institute
for Medical Research, North Shore-LIJ Health System , Manhasset , NY , USA
MAO WANG • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
JIAO WU • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
WENJUN WU • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
MAGGIE YEUNG • Laboratory of Emergency Medicine , The Feinstein Institute
for Medical Research, North Shore-LIJ Health System , Manhasset , NY , USA
YONG YU • Department of Biological Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
TAMARA YUNUSOVA • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and
Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
MIGUEL ZABALA • Centro Nacional de Microelectrónica , Instituto de Microelectrónica
de Barcelona , Barcelona , Spain
LIN ZHAO • Laboratory of Emergency Medicine , The Feinstein Institute for Medical
Research, North Shore-LIJ Health System , Manhasset , NY , USA
LING ZHAO • Department of Rheumatology, The First Hospital , Jinlin University
Normal Bethune Medical College , Changchun , China
SHU ZHU • Laboratory of Emergency Medicine , The Feinstein Institute
for Medical Research, North Shore-LIJ Health System , Manhasset , NY , USA
NADIA ZINE • Institut de Sciences Analytiques , Université de Lyon , Villeurbanne , France
MICHELLE ZUR • Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy
and Health Sciences , St. John’s University , Queens , NY , USA
Contributors

21. Part I
Detection of Released Cytokines by Immunoassays

22. 3
Ivana Vancurova (ed.), Cytokine Bioassays: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1172,
DOI 10.1007/978-1-4939-0928-5_1, © Springer Science+Business Media New York 2014
Chapter 1
The Challenge of Measuring Elusive Immune Markers
by Enzyme-Linked Immuno-Spot (ELISPOT) Technique
Maria Faresjö
Abstract
   The enzyme−linked immuno−spot (ELISPOT) technique is a sensitive method used for measurement of 
elusive immune markers in limited−volume samples. By virtue of the exquisite sensitivity of the ELISPOT 
assay, frequency analysis of rare cell populations (e.g., antigen−specifi c responses), which was not possible 
before, is now relatively easy. However, development of a method sensitive enough to pinpoint elusive 
immune markers at the single−cell level is a challenge since there are a number of demands that have to be 
fulfi lled and traps to avoid, achieving a valuable outcome. 
 To optimize the environment for in vitro culture and analysis of immune spots by ELISPOT, a num−
ber of criteria have to be fulfi lled: processing of sample and perhaps also cryopreservation of cells before 
analysis and, for the ELISPOT assay, optimal cell culture, positive and negative controls, antigen concen−
tration, and, fi nally, development and readout of spots. 
 If these criteria are fulfi lled for your ELISPOT assay, you will likely have the opportunity to pinpoint 
elusive immune markers at the single−cell level. This chapter describes the ELISPOT assay for detection of 
cytokines (e.g., IFN−γ and IL−4), with focus on the main criteria that affect the assay. However, this method 
could be easily adapted to measure other immune markers in small volumes of biological samples.  
Key words ELISPOT  ,   Cytokines  ,   Cell separation  ,   Cryopreservation  ,   Control antigens  ,   In vitro 
stimulation conditions  ,   Development and readout of spots  
1 Introduction
 Enzyme−linked immuno−spot (ELISPOT) is a technique by which 
immune markers, e.g., cytokine and chemokine secretion, can be 
detected at the single−cell level since secreted cytokines are 
captured and accumulated in the ELISPOT plate. ELISPOT was 
initially performed for detection of antigen−secreting cells [ 1 ] and 
later adapted for enumeration of cytokine−producing cells at the 
single−cell level [ 2 ]. The ELISPOT assay provides both qualitative 
(type of immune protein) and quantitative (number of responding 
cells) information, as each spot that develops in the assay repre−
sents a single reactive cell. 

23. 4
 In principle, the immune markers of interest, e.g., cytokines, 
are captured directly on the surface as a cytokine–antibody complex 
forming a spot around each cell secreting the cytokine of interest. 
The spot size and morphology refl ect the kinetics and the quality of 
the cytokine production by individual cells over the entire test period. 
 The wells of the ELISPOT plate are coated with a primary 
antibody, and thereafter nonspecifi c binding sites are blocked 
(Fig.  1a ). Cells are added in the presence or the absence of specifi c 
stimulus. During incubation, cells become activated by the stimu−
lus, starting to produce and secrete a cytokine that binds to the 
capture antibody (Fig.  1b ). Subsequently, cells are removed, and a 
detection antibody, which may be directly conjugated with enzyme 
or biotinylated, is added (Fig.  1c ). Finally, a substrate will form a 
colored spot at the location of the secreting cell. By counting the 
number of spots in stimulated cultures and controls without stimulus, 
the frequency of responding cells is determined [ 3 ].
2 Materials
      1.    Venous blood samples from healthy human volunteers or 
patients, drawn in tubes supplemented with sodium heparin.   
   2.    RPMI−1640 medium without glutamine.   
   3.    Washing buffer: RPMI−1640 without glutamine supplemented 
with 2 % heat−inactivated fetal calf serum (FCS).   
   4.    Separation reagent: Ficoll−Paque density gradient.      
      1.    Türk’s solution.   
   2.    Trypan blue solution.      
2.1 Isolation
of Peripheral Blood
Mononuclear Cells
2.2 Cellular Number
and Viability
ab
c
Fig. 1 Methodological principle of the ELISPOT assay. The wells are coated with a primary antibody, and there-
after nonspecifi c binding sites are blocked ( a ). Cells are added in the presence or the absence of specifi c
stimulus. During incubation, cells become activated by the stimulus and start to produce and secrete a cytokine
that binds to the capture antibody ( b ). Cells are removed, and a detection antibody, which may be directly
conjugated with enzyme or biotinylated, is added ( c )
 
Maria Faresjö

24. 5
      1.    Freezing medium: 50 % RPMI−1640 without glutamine, 40 % 
FCS, and 10 % dimethyl sulfoxide (Me 2 SO).   
   2.    Cryo 1 °C Freezing Container (Nalge Nunc International) 
containing isopropanol.   
   3.    Vials appropriate for cryopreservation (Nalge Nunc International).      
      1.    Washing buffer: RPMI−1640 without glutamine supplemented 
with 10 % heat−inactivated FCS.   
   2.    Iscove’s modifi cation of Dulbecco’s medium (Life 
Technologies) supplemented with 50 U/ml penicillin, 50 μg/
ml streptomycin, 10 ml/l 100× nonessential amino acids, and 
5 % FCS.      
      1.    Sterile PVDF membrane plate.   
   2.    Ethanol (70 %).   
   3.    MultiScreen™ Vacuum Manifold 96−well (Merck Millipore).   
   4.    Sterile phosphate−buffered saline (PBS).   
   5.    Sterile PBS−Tween (Life Technologies).   
   6.    Iscove’s modifi cation of Dulbecco’s medium (Life Technologies) 
supplemented with 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, 
10 ml/l 100× nonessential amino acids, and 5 % FCS.   
   7.    Human IFN−γ or IL−4 ELISPOT kit including mouse anti− 
human (IFN−γ or IL−4) monoclonal antibody, biotinylated 
anti−human (IFN−γ or IL−4) monoclonal antibody, and strep−
tavidin conjugated with alkaline phosphatase.   
   8.    Alkaline phosphatase (AP) conjugate substrate kit.   
   9.    AID ELISPOT Reader System.       
3 Methods
  Separation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) 
should be handled at room temperature in a ventilated hood 
( see   Notes 1  and  2 ).
    1.    Dilute venous heparinized blood in RPMI, 1:2 (i.e., half− 
volume blood, half−volume RPMI).   
   2.    Invert the Ficoll−Paque bottle several times to ensure through 
mixing. Then, withdraw the required volume of Ficoll−Paque 
using aseptic technique. Ficoll−to−blood ratio should be 3:5 
(i.e., 12 ml of Ficoll and 20 ml of diluted blood sample).   
   3.    Transfer the required volume of Ficoll−Paque to a sterile cen−
trifuge tube.   
   4.    Carefully lay the diluted blood sample on the Ficoll layer to 
avoid mix between Ficoll and blood sample.   
2.3 Cryopreservation
of PBMC
2.4 Thawing
of PBMC
2.5 ELISPOT
3.1 Isolation
of Peripheral Blood
Mononuclear Cells
The Challenge of Measuring Immune Markers by ELISPOT

25. 6
   5.    Centrifuge at 400 ×  g  for 30 min, without brake, at 18–20 °C.   
   6.    Carefully draw up the layer of PBMC using a clean Pasteur 
pipette, and transfer PBMC to a sterile centrifuge tube.   
   7.    Resuspend PBMC in 20 ml of washing buffer.   
   8.    Centrifuge at 400 ×  g  for 10 min, with low brake, at 18–20 °C.   
   9.    Remove the supernatant, and wash PBMC by repeating the 
 steps 7  and  8  once more.   
   10.    Remove the supernatant.    
         1.    Dissolve the PBMC pellet in 1 ml of washing medium.   
   2.    For determination of the number of PBMC, dilute 10 μl of 
PBMC suspension with 90 μl of Türk’s solution (1:10).   
   3.    Place 10 μl of PBMC suspension in a Bürker’s chamber. Count 
the number of PBMC using a light microscope ( see   Note 3 ).   
   4.    For determination of membrane integrity, dilute 10 μl of 
PBMC suspension with 10 μl of trypan blue solution (1:1).   
   5.    Place 10 μl of PBMC suspension in a Bürker’s chamber. Count 
100 PBMC in a light microscope ( see   Note 4 ).      
      1.    Centrifuge the solution of PBMC at 400 ×  g  for 10 min at 
18–20 °C.   
   2.    Remove the supernatant.   
   3.    Resuspend PBMC in freezing medium (4 °C) by adding freezing 
medium dropwise, while the tube is continuously agitated, to 
a concentration of 5–10 × 10 
6
  PBMC/ml.   
   4.    Transfer 1 ml of PBMC solution to vials suitable for cryo−
preservation.   
   5.    Place the vials with PBMC in a precooled (4 °C) Cryo 1 °C 
Freezing Container containing isopropanol.   
   6.    Place the container at −70 °C (the freezing rate is −1 °C/min).   
   7.    Transfer the vials to liquid nitrogen (−196 °C) the following day.      
      1.    Thaw PBMC, directly from −196 to +37 °C, in a water bath 
under continuous agitation.   
   2.    Immediately thereafter, add washing buffer dropwise to the 
cells until a total volume of 10 ml is reached.   
   3.    Centrifuge the solution of PBMC at 400 ×  g  for 10 min at 
18–20 °C.   
   4.    Remove the supernatant.   
   5.    Resuspend PBMC in 1 ml of Iscove’s modifi cation  of 
Dulbecco’s medium with supplements.   
3.2 Cellular Number
and Viability
3.3 Cryopreservation
of PBMC ( See Note 5 )
3.4 Thawing
of PBMC
Maria Faresjö

26. Other documents randomly have
different content

27. "Ei, kuulehan, me olemme yhdessä samonneet sotaretkelle,
istuneet ratsailla kahdeksantoista tuntia yhteen menoon ja vielä
naureskelleet, kun altamme on sortunut jo kolme ratsua
uupumuksen tai nälän menehdyttäminä. Väsymys ei nyt noin
painosta mieltäsi, kreivi."
"No, lienen sitten alakuloisena pelkästä äkäännyksestä."
"Lordi Buckinghamin hupsuuden tähden?"
"Niin kylläkin; eikö meille herraamme edustaville ranskalaisille ole
suututtavaa nähdä englantilaisten liehittelevän tulevaista
valtiatartamme?"
"Oikeassa olet; mutta herttua ei luullakseni ole vaarallinen."
"Ei, mutta hän tuottaa häiriötä tungettelullaan. Eikö hän tänne
saapuessaan ollut vähällä aiheuttaa rettelöä englantilaisten ja
meidän kesken? Ilman sinun ihmeellistä ymmärtäväisyyttäsi ja
lujuuttasi olisimmekin joutuneet miekkasille koko kaupungin
nähden."
"Huomasithan hänen muuttuvan."
"Se on totta, mutta siitä käänteestä juuri olenkin ymmällä' Sinä
puhelit hänen kanssaan hiljaa; mitä haastoitkaan hänelle? Uskoit
hänen rakastavan prinsessaa ja huomautit siitä hänelle; mutta
intohimo ei mukaudu noin helposti, — hän ei kai siis lopultakaan
oikealla tavalla rakasta madame Henrietteä!"
De Guiche lausui viime sanansa niin hillittömän kiihtymyksen
vallassa, että Raoul kohotti päätänsä. Varakreivin ylevät kasvot
kuvastivat ilmeistä mielipahaa.

28. "Voin kyllä mainitakin sinulle, mitä hänelle lausuin, kreivi", sanoi
hän. "Huomautin herttuan katselevan hallitsijansa sisarta suorastaan
luvattomaksi kiihkoksi yltyneellä kiintymyksellä, jolla ei voinut olla
mitään kunniallisesti tavoitettavaa päämäärää, niin että sellainen
esiintyminen ehdottomasti loukkasi meitä, jotka olimme tulleet
noutamaan nuorta morsianta kihlattunsa luokse."
"Niinkö hänelle sanoit?" tokaisi de Guiche punastuen.
"Aivan suoraan, ja menin pitemmällekin. Virkoinpa hänelle: 'Mitä
te itse ajattelisitte meistä, jos havaitsisitte keskuudessamme jonkun
niin riivaantuneeksi ja alamaistuntonsa menettäneeksi, että hän
sallisi sydämessään syntyä muita tunteita kuin mitä puhtainta
kunnioitusta hallitsijahuoneeseensa liittyvää prinsessaa kohtaan?'"
Nämä sanat kohdistuivat niin suoranaisesti de Guicheen, että tämä
kalpeni, ja äkillisen väristyksen valtaamana hän saattoi vain
koneellisesti ojentaa toisen kätensä Raoulia kohti, peittäessään
toisella silmänsä ja otsansa.
"Mutta, Jumalan kiitos", pitkitti Raoul ystävänsä
mielenliikutuksesta välittämättä, "ranskalaiset, joita huudetaan
kevytmielisiksi, maltittomiksi, velvollisuuksiaan polkeviksi, osaavat
käyttää tervettä harkintaa ja ankaraa kunniantuntoa korkean
sopivaisuuden kysymyksissä. Tästä huomauttaessani lisäsin
herttualle, että me Ranskan aatelismiehet palvelemme
kuninkaitamme uhraamalla heille kaikki intohimomme niinkuin
omaisuutemme ja henkemmekin, ja milloin sattumalta kiusaaja
johdattaa mieleemme sellaisia pahoja ajatuksia, jotka sytyttävät
tuleen sydämen, me heti sammutamme liekin vaikka verellämme.
Tällä tavoin — sanoin — me pelastamme kolme kunniaa yhdellä
kertaa: isänmaamme, valtiaamme ja omamme. 'Niin me toimimme,

29. hyvä herttua', lopetin selittelyni, 'ja siten tulee jokaisen kunnon
miehen menetellä'. Ja pätevää se todisteluni näkyy olleenkin,
veikkoseni", jatkoi Raoul, "koska kuumaverinen ulkomaalainen
vastustelematta alistui siihen."
De Guiche oli tähän asti yhä kumarampaan vaipuneena kuunnellut
ystävänsä puhetta, mutta nyt hän nousi ylpein katsein ja tarttui
kuumeisella kädellään Raoulin käteen; hänen poskipäänsä hehkuivat,
äsken oltuaan kylmän verettömät.
"Sinä puhuit hyvin", tunnusti hän tukahtuneella äänellä, "ja olet
kelpo ystävä, Raoul. Kiitos! Nyt pyydän sinua jättämään minut
yksin."
"Tahdot olla rauhassa?"
"Niin, tarvitsen lepoa. Aivojani ja sydäntäni on tänä paljon
koeteltu; kun huomenna palaat, en ole enää sama mies.
"No niin, nuku yösi hyvin", toivotti Raoul peräytyen.
Kreivi astahti ystäväänsä kohti ja veti hänet sydämellisesti syliinsä.
Mutta tässä ystävällisessä puristuksessa kykeni Raoul vielä
tuntemaan suuren, lannistetun intohimon vavahtelua.
Yö oli raikas, tähtivaloinen, ihana; tuulen vaimennuttua oli
auringon lämpö tuonut kaikkialle iloa, riemua ja rauhaa. Taivaalle oli
muodostunut muutamia pitkiä pilvenlonkia, joiden villava valkoisuus
lupasi useita itätuulahduksen lauhduttamia kauniita päiviä.
Kaupungintalon aukiolla olivat suurten sädekimppujen katkomat
pitkät varjot levinneet ikäänkuin jättimäiseksi mustien ja valkoisten
paasien mosaiikiksi.

30. Piankin koko kaupunki vaipui uneen; jäi vain heikko valo
pilkoittamaan prinsessan asunnosta öiselle turulle, ja tämä leppoisa
alaskierretyn lampun hohde tuntui nuoren tytön tyynen unen
heijastukselta, — immen, jolle elämä on vasta alkanut esittää
ensimmäisiä ihmeitään ja jonka sielunliikkeet tyyten tasaantuvat
ruumiin uinahtaessa.
Bragelonne astui tovin kuluttua telttansa ovelle hiljaa ja käyntiänsä
pidätellen kuin ihminen, joka on utelias katselemaan ja haluaa itse
jäädä näkymättömäksi. Paksujen verhojen suojasta hän sai yhdellä
ainoalla silmäyksellä tarkatuksi koko aukiota ja havaitsi hetken
kuluttua, että de Guichen teltan oviverhot niinikään puolittain
avautuivat ja liehuivat. Raossa kuvastui nuoren kreivin hahmo, kun
hän hämyssä hehkuvin silmin tähysti kiihkeästi prinsessan
makuuhuoneesta tuikkivaan heikkoon kajastukseen.
Se ystävällinen pilkotus oli kreivin tähtenä. Hänen katseisiinsa
ilmestyi koko sielun valtaava pyrkimys. Varjossa vakoillen Raoul
käsitti, mitkä hehkuvat ajatukset kutoivat nuoren lähettilään teltasta
prinsessan ulokkeelle myötätunnon ihmeellistä ja loihtuista siltaa,
kun niitä nostatti niin harras tahto ja hellittämätön kiintymys, että ne
varmaankin herättivät rakkauden unelmia laskeutumaan tuoksuiselle
makuusijalle, jota kreivi sielunsa silmillä ihasteli.
Mutta de Guiche ja Raoul eivät olleet ainoat valveilla. Eräässä
rakennuksessa aukion laidalla oli ikkuna avoinna, ja siitä
tunkeutuvan valon häämyssä kuvastui selvin varjopiirtein
Buckinghamin herttua, joka mukavasti nojautuen veistoksilla
koristeltuun ja sametilla verhottuun poikkipienaan lähetti hänkin
prinsessan ulokkeelle kuumia toivotuksia ja rakkautensa
hullaannuksen näkyjä.

31. Bragelonne ei voinut olla hymyilemättä.
— Onpa siinä sydänparka pahoin piirityksessä, — tuumi hän
prinsessaa ajatellen. — Ja ylkäpoloinen on kovasti uhattuna, — lisäsi
hän itsekseen kruununprinssiä säälitellen, — vaikka onkin suuri
valtias ja voi kokonaisella armeijalla varjella omaisuuttansa.
Bragelonne tähysti jonkun aikaa noiden kahden huokailijan
hupsutusta, kuunteli Manicampin kaikuvan epäkohteliasta
kuorsausta, kun hienosteleva aatelismies jyristeli niin korskeasti kuin
hänellä olisi jo ollut se sininen pukunsa sinipunaisen vaateparren
sijasta, — kääntyi tuulenhenkeen päin, joka toi hänen korviinsa
satakielen etäistä säveltenhoa, ja huomasi sitten saavansa
osuudekseen toisen taudin, kaihomielisyyden, niin että hän läksikin
levolle, ajatellen omasta kohdastaan, että kenties neljä tai kuusi
silmää yhtä kiihkeinä vartioitsi hänen epäjumalaansa Bloisin linnassa
kuin de Guiche ja Buckingham täällä.
"Ja neiti de Montalais ei ole mikään vankka varjelus", huoahti hän
itsekseen.
87.
Havresta Pariisiin.
Seuraavana päivänä vietettiin varsinaiset vastaanottojuhlat niin
prameasti ja riemukkaasti kuin kaupungin apuneuvot ja asukkaiden
innostus kykeni saamaan aikaan. Viimeiset tunnit omistettiin samalla
lähtövalmistuksiin.

32. Hyvästeltyään englantilaista laivastoa ja viimeisen kerran
tervehdittyään isänmaatansa kumarruksella sen lipulle prinsessa
nousi kaleeseihin loistavan saattueen keskellä.
De Guiche oli toivonut Buckinghamin herttuan palaavan Englantiin
amiraalin mukana; mutta herttuan onnistui johtaa leskikuningatar
siihen käsitykseen, että olisi ollut sopimatonta antaa prinsessan
saapua Pariisiin melkein hylättynä omien kansalaistensa taholta.
Kun tuli sovituksi, että Buckingham saattaisi prinsessaa, valitsi
nuori herttua omaksi seurueekseen joukon aatelismiehiä ja
upseereja, niin että pääkaupunkia kohti taivalsikin kokonainen
armeija, kylväen kultaa ja näytellen hämmästyttävää muhkeutta
kaupungeissa ja kylissä, joiden kautta tämä uhkea parvi kulki.
Oli herttaiset ilmat. Ranska oli ihana katsella olletikin niillä
seuduin, joiden halki kulkue riensi. Kevät esitti värikkäimpiä kukkiaan
ja vehmainta lehvistöään tälle ylhäiselle nuorisolle. Koko Normandia
myhäili kuninkaan kälylle kuin paratiisin puutarha, levittäessään
hänen eteensä reheviä niittyjä, sinisiä näköpiirejä, hopeisia jokia.
Matka kului keskeytymättömässä juhlimisessa ja hurmiossa. Se
vaikutti de Guicheen ja herttuaankin: edellinen ei enää niin kiivaasti
pannut pahakseen englantilaisen uutta lähentelyä, ja jälkimmäinen
pääasiallisesti tyytyi herättelemään prinsessan sydämessä isänmaan
eloisampaa muistelua, johon liittyi onnellisten päivien ajattelua.
Mutta herttuaparan täytyi havaita, että hänen rakkaan Englantinsa
kuva himmentyi päivä päivältä prinsessan mielestä, sitä mukaa kun
siihen yhä syvemmälle painui Ranskan rakkaus. Hän huomasi, että
hänen pikku yrityksensä eivät saaneet osakseen minkäänlaista
kiitollisuutta, ja vain sattumalta osuivatkaan prinsessan katseet
häneen, niin uljaasti kuin hän ratsastikin mitä tulisimman

33. yorkshireläisen juoksijan selässä. Kohdistaakseen puoleensa
jonkunkaan noista avaruudessa harhailevista tai muuanne
kiintyneistä katseista hän turhaan yllytti ratsuansa osoittamaan
kaikkein suurinta voimaansa, reippauttansa ja vauhtiaan; vimmatusti
kiihdyttäen raisua elukkaa lukemattomat kerrat täyteen karkuun
esteiden yli, ja jyrkkiä rinteitä pitkin hän alituiseen oli vähällä suistaa
sen ruhjoutumaan puita vasten tai kaivantoihin kierimään, — mutta
se oli hyödytömtä tavoittelua: melu sai prinsessan hetkiseksi
kääntämään päätänsä, muta sitten hän hienosti hymyillen palautti
huomionsa uskollisiin suojelijoihinsa Raouliin ja de Guicheen, jotka
tasaisesti ratsastivat hänen kaleesiensa oviverhojen rinnalla.
Silloin Buckingham tunsi mustasukkaisuuden kaikkia kidutuksia;
repivä tuska kiehui hänen suonissaan ja kouri hänen sydäntään, —
ja sitten hän osoittaakseen käsittävänsä hupsuutensa ja tahtovansa
mitä nöyrimmällä alistuvaisuudella hyvittää sopimattomat
ajattelemattomuutensa taltutti ratsun ja pakotti sen hiestä märkänä
ja vaahdosta valkotäpläisenä pureskelemaan kuolaimiansa kaleesien
lähellä, hovilaisten joukossa. Tällöin hän toisinaan sai palkkiokseen
prinsessalta sanasen, joka sekin tuntui hänestä nuhteelta. "Hyvä!"
saattoi madame Henriette virkkaa; "nythän te olette järkevä, herra
Buckingham!"
Joskus taasen Raoul säveästi huomautti:
"Te surmaatte hevosenne, herttua."
Ja Buckingham kuunteli kärsivällisesti Raoulia, sillä hän tunsi
vaistomaisesti, että Raoul oli saanut de Guichen tunteet malttumaan
ja että ilman nuoren varakreivin vaikutusta olisi joku hillitön purkaus
jommankumman kilpailijan taholta aiheuttanut pahan häiriön, josta
olisi karkoitus voinut olla seurauksena. Siitä merkillisestä

34. keskustelusta asti, jossa Raoul oli Havren telttojen edustalla niin
suorasukaisesti huomautellut herttualle hänen käyttäytymisensä
pahennuksesta, oli Buckingham ikäänkuin vastoin tahtoansa
mieltynyt Raouliin. Hän antausi usein puheisiin tämän kanssa, ja
melkein aina hän silloin jutteli hänen isästään tai d'Artagnanista,
heidän yhteisestä ystävästään, jota Buckingham arvosteli miltei yhtä
innostuneesti kuin Bragelonnekin.
Raoul oli halukas haastelemaan tästä aiheesta olletikin de
Wardesin kuullen, joka oli koko matkalla tuntenut lisääntyvää äkää
Bragelonnen ylemmyydestä ja etenkin hänen vaikutuksestaan de
Guichen mielialaan. De Wardesilla oli häijyn luonteen tiukka ja
tutkisteleva katse, ja hän oli heti päässyt selville de Guichen
tunteista prinsessaa kohtaan. Noudattamatta tässä asiassa Raoulin
varovaa pidättyväisyyttä ja antamatta arvoa soveliaisuuden ja oikean
ystävyyden vaatimuksille de Wardes tahallaan soinnutteli
kovakouraisesti tätä kreivin sielun jännettä, joka muutenkin on aina
herkkä nuoruuden rivakkamielisyydessä ja itsekkäässä ylpeydessä.
Oli eräänä iltana pysähdytty Nantesissa. De Guiche ja de Wardes
puhelivat kaksistaan nojautuneina katukaiteeseen, Buckingham ja
Raoul kävelivät lähellä niinikään pakisten ja Manicamp hauskutteli
kuninkaallisia naisia, jotka jo kohtelivat häntä aivan tuttavallisesti
hänen joustavan mielenlaatunsa, säveän esiintymisensä ja leppoisan
olemuksensa johdosta.
"Tunnusta pois", virkkoi de Wardes kreiville, "että olet pahoin
sairaana etkä saa parannusta koulumestariltasi."
"En käsitä sitä puhetta", väitteli kreivi.
"Seikkahan on selvä: sinä riudut rakkauteen."

35. "Hupsuutta, de Wardes, hupsuutta!"
"Se olisi hupsuutta, myönnän, jos madame olisi välinpitämätön
kärsimyksistäsi; mutta hän on tunteillesi siinä määrin huomaavainen,
että hänen sävynsä voi herättää arveluita, ja ihan minä pelkään, että
opettajasi herra de Bragelonne paljastaa teidät molemmat Pariisiin
tullessamme."
"Taaskin hyökkäys Bragelonnea vastaan, de Wardes!"
"Kuulehan, jätä jo sikseen kaikki lapsellisuus", haastoi kreivin paha
henki puoliääneen. "Tiedät yhtä hyvin kuin minäkin, mitä tahdon
sanoa; näet sitäpaitsi selkeästi, että prinsessan katsanto heltyy
lempeäksi hänen puhutellessaan sinua. Oivallat hänen äänensä
soinnusta, että hän mielellään kuuntelee sinua; tunnet hänen
tajuavan kaikki kauniit säkeet, joita hänelle lausuilet, etkä voine
kieltää, että hän joka aamu sanoo sinulle nukkuneensa huonosti?"
"Se on totta, de Wardes, se on totta; mutta miksi puhut minulle
tätä?"
"Eikö ole tärkeätä nähdä selvästi asema?"
"Ei, kun se näkeminen voi viedä ihmiseltä järjen."
Ja hän käännähti levottomasti prinsessaan päin ikäänkuin olisi de
Wardesin vihjauksia vastustaessaankin tahtonut etsiä niille
vahvistusta hänen silmistään.
"Kas, maltahan!" virkkoi de Wardes; "etkö näe, että hän kutsuu
sinua luokseen? Hei, käytä tilaisuutta, kun koulumestari ei ole
estämässä."

36. De Guiche ei kyennyt pidättymään; vastustamaton vetovoima
pakotti hänet lähestymään prinsessaa. De Wardes katseli hänen
lähtöään hymyhuulin.
"Te erehdytte, monsieur", sanoi Raoul yhtäkkiä kavuten kaiteen
yli, johon nuoret miehet olivat vastikään nojailleet selin;
"koulumestari oli saapuvilla ja kuulemassa."
De Wardesin ei tarvinnut vilkaistakaan Raouliin, tunteakseen hänet
äänestä, ja hän veti kalpansa heti puoliväliin huotrasta.
"Työntäkää miekkanne takaisin", lausui Raoul; "tiedätte hyvin, että
tällaisella matkalla kaikki tuommoiset mielenilmaukset ovat
hyödyttömiä. Pidättäkää säilänne, mutta hillitkää myös kielenne.
Miksi yritätte istuttaa oman sydämenne myrkkysappea mieheen, jota
sanotte ystäväksenne? Minua te tahdotte johdattaa vihaamaan
kunnon kansalaista, joka on isäni ja omaisteni ystävä, ja kreiviä
koetatte houkutella rakastamaan herrallenne määrättyä naista.
Totisesti, monsieur, te olisitte minun silmissäni kavaltaja ja kunniaton
roisto, ellen katsoisi paljon todennäköisemmäksi, että järjessänne on
vikaa!"
"Sattuvasti sanoinkin teitä koulumestariksi, monsieur!" kuohahti de
Wardes. "Teidän omaksumanne äänilaji ja esiintyminen on ruoskaa
pitelevän jesuiitin eikä aatelismiehen käyttäytymistä. Pyydän teitä
ehdottomasti luopumaan siitä minun edessäni. Minä vihaan herra
d'Artagnania siitä syystä, että hän on menetellyt kurjasti isääni
kohtaan."
"Te valehtelette, monsieur", sanoi Raoul kylmäkiskoisesti.

37. "Haa, te väitätte minun puhuvan perättömiä, monsieur!" huudahti
de
Wardes.
"Miksen sitä sanoisi, kun lausumanne on mahdoton?"
"Syytätte minua vääristelystä, ettekä samalla ole valmis
puolustamaan väitettänne miekalla?"
"Olen tehnyt päätöksen, monsieur, etten surmaa teitä ennen kuin
olemme toimittaneet prinsessan hänen sulhasensa luo."
"Tekö surmaisitte minut! Oh, teidän vitsakimppunne ei niin vain
suomi minua hengiltä, herra koulumestari."
"Ei", vastasi Raoul järkkymättömästi, "mutta herra d'Artagnanin
säilä pystyy siihen, ja minulla ei ainoastaan ole sitä asetta, monsieur,
vaan hän on opettanut minut sitä käyttämäänkin, ja sillä miekalla
minä ajan tullen kostan hänen nimensä häväistyksen."
"Varokaa, varokaa, monsieur!" karjaisi de Wardes. "Ellette heti
paikalla anna minulle hyvitystä, niin kaikki keinot kelpaavat
kostolleni!"
"Ohoo, monsieur", virkahti Buckingham äkkiä ilmestyen
näyttämölle, "siinäpä uhkaus, joka haiskahtaa salamurhalta ja
osoittaa kovin huonoa aistia aatelismiehessä."
"Mitä sanotte, herttua?" tiukkasi de Wardes kääntyen häneen päin.
"Pahoittelen äskeisen huomautuksenne loukkaavan englantilaisia
korviani."

38. "No, jos niin on asia, monsieur, niin sitä parempi!" huudahti de
Wardes vimmastuksissaan; "siispä tapaan ainakin teissä miehen,
joka ei livahda sormieni lomitse. Käsittäkää sanani niinkuin vain
haluatte."
"Käsitän niinkuin ne on käsitettävä, monsieur", vastasi
Buckingham luonteenomaisen korskeaan tapaansa, joka
tavallisessakin keskustelussa antoi hänen haastelulleen erityistä
uhmaa. "Herra de Bragelonne on ystäväni, te loukkaatte häntä, ja
niinpä vaadin teiltä hyvitystä siitä."
De Wardes vilkaisi Bragelonneen, joka uskollisesti esittäen osaansa
pysyi kylmäverisenä herttuan uhmankin edessä.
"Mutta näyttäähän siltä", hän sanoi, "että minä en loukkaa herra
de
Bragelonnea, koska hän ei katso kannattavan tarttua miekkaansa."
"Ketä siis loukkasitte?"
"Minä vain arvostelin kehnoksi mieheksi herra d'Artagnania",
vastasi de Wardes, joka oli pannut merkille, että hän ainoastaan
tuon nimen polkemisella kykeni härnäämään Raoulia raivostuksiin.
"No, se on toista", sanoi Buckingham.
"Eikö olekin?" vahvisti de Wardes. "Herra d'Artagnanin ystäville siis
kuuluu hänen puolustamisensa."
"Olen täydellisesti yhtä mieltä teidän kanssanne, monsieur",
vastasi englantilainen, joka oli saanut takaisin tyyneytensä. "Herra
de Bragelonnen loukkaamisesta en olisi oikeammiten voinut esiintyä

39. hänen sijassaan, koska hän on itse paikalla; kun asia taasen koskee
herra d'Artagnania…"
"Niin jätätte meidät sitä selvittelemään, monsieur, vai miten?"
täydensi de Wardes.
"En, vaan päinvastoin annan teille haasteen", oikaisi Buckingham
sivaltaen miekan huotrastaan, "sillä jos herra d'Artagnan on
tuottanut haittaa teidän isällenne, on hän tehnyt tai ainakin yrittänyt
tehdä suuren palveluksen minun isälleni." De Wardes liikahti
hämmästyneenä. "Herra d'Artagnan", pitkitti Buckingham, "on uljain
aatelismies, mitä tunnen. Mitä suurimmalla mielihyvällä senvuoksi
maksan teille miekallani, mitä kiitollisuudessani olen hänelle velkaa."
Ja Raoulille kumartaen Buckingham soreasti heittäytyi
taisteluasentoon.
De Wardes siirrähti askeleen, heidän iskeäkseen aseensa ristiin.
"Hei, hei, hyvät herrat", sanoi Raoul astuen eteenpäin ja asettaen
vuorostaan oman säilänsä paljastettuna kiistakumppanuksien väliin,
"tämän asian vuoksi ei teidän kannata käydä verenvuodatukseen
prinsessan nähden. Herra de Wardes kyllä puhuu pahaa herra
d'Artagnanista, mutta hän ei edes tunne sitä miestä."
"Ohoo, enkö muka tunne d'Artagnania?" tiuskaisi de Wardes
hammasta purren ja laskien miekkansa kärjen maata kohti.
"Ette ollenkaan, ettekä edes tiedä, missä hän oleskelee", vastasi
Raoul levollisesti, "koska kerran hänen tähtensä haastatte riitaa
vieraitten kanssa, sen sijaan että tavoittaisitte hänet itsensä."
De Wardes kalpeni.

40. "Mutta voin kyllä ilmoittaa teille, missä hän oleskelee, monsieur",
jatkoi Raoul. "Herra d'Artagnan on Pariisissa; palvelusvuorollaan hän
asuu Louvressa, mutta vapaina hetkinään Rue des Lombardsin
varrella. Hän on aivan helposti tavattavissa jommastakummasta
paikasta, ja kun teillä on niin paljon valittamista hänestä, niin ette
menettele uljaan miehen tavoin, jättäessänne vaatimatta häneltä
hyvitystä, jota tunnutte tahtovan kaikilta muilta paitsi juuri
asianomaiselta."
De Wardes pyyhki hikeä otsaltaan.
"Hyi, herra de Wardes", morkkasi Raoul; "ei ole sopivaa rettelöidä
tuolla tavoin, kun kaksintaisteluista on julkaistu ankaria kieltoja.
Ajatelkaa toki: kuningas panisi tottelemattomuutemme kovin
pahakseen, varsinkin tällaisena aikana, ja hänellä olisi siihen täysi
syy."
"Välttelyä!" mutisi de Wardes; "verukkeita!"
"Jopa jotakin!" vastasi Raoul; "miksi puhutte tuollaisia
päättömyyksiä, hyvä herra de Wardes? Tiedätte hyvin, että
Buckinghamin herttua on kymmenenkin kertaa kunnostautunut
miekkasilla eikä suinkaan karttele yhdettätoista. Hiisi vieköön,
hänellä on nimi, joka velvoittaa! Ja tiedätte kyllä, että minäkin
tappelen. Olen taistellut Sensin luona, Bléneaussa, Flandrian
rannikolla, — tykkimiesten edellä, sata askelta edenneenä
rintamasta, teidän muuten jättäytyessänne sata askelta rintaman
taakse. Tosin siellä oli liian paljon väkeä, jotta urheutenne olisi voinut
pistää silmään, niin että te ette sitä halunnutkaan näytellä; mutta
täällä se kykenee aiheuttamaan häväistysjutun, ja te tahdotte
saavuttaa huomiota millä tavoin hyvänsä. Älkää sentään luulko, että

41. minä ryhdyn auttamaan teitä suunnitelmassanne, herra de Wardes.
Sitä mielihyvää en teille suo."
"Tuo on silkkaa järkeä", arvosteli Buckingham pistäen miekkansa
takaisin huotraan, "ja pyydän teitä suomaan anteeksi, herra de
Bragelonne, että annoin ensi hetkenä houkutella itseäni
maltittomuuteen."
Mutta de Wardes päinvastoin hypähti raivostuneena eteenpäin ja
miekka koholla uhkasi Raoulia, joka hädin ehti turvautua
neljännesväistöön.
"Varovammin, monsieur, — olitte puhkaista silmäni!" virkkoi
Bragelonne rauhallisesti.
"Mutta ettekö siis tahdo taistella?" raivosi de Wardes.
"En tällä hetkellä; mutta minä lupaan heti Pariisiin tultuamme
viedä teidät herra d'Artagnanin luo, jolle sitten esitätte valituksenne.
Herra d'Artagnan pyytää kuninkaalta lupaa käydä miekkasille
kanssanne, kuningas suostuu siihen, ja saatuanne maistaa hänen
säiläänsä te varmasti ajattelette alistuvammalla mielellä raamatun
opetuksia vääryyksien unohtamisesta, hyvä herra de Wardes!"
"Haa!" kiljaisi de Wardes moisen kylmäverisyyden
tuskaannuttamana: "kyllä näkee, että te olette puolittain lehtolapsi,
herra de Bragelonne!"
Raoul kävi kasvoiltaan vaaleaksi kuin palttina; hänen silmistään
leimahti salama, joka sai de Wardesin hätkähtämään taaksepäin. Se
kauhistutti Buckinghamiakin, ja herttua heittäysi kiistaajain väliin,
joiden hän odotti näkevänsä karkaavan käsiksi toisiinsa. De Wardes

42. oli säästänyt tämän solvaisunsa viimeiseksi; hän kouraisi kiivaasti
miekkansa kahvaa ja valmistausi otteluun.
"Olette oikeassa, monsieur", lausui Raoul, rajulla ponnistuksella
malttaen mielensä; "tiedän ainoastaan isäni nimen. Mutta minä
tunnen kreivi de la Fèren kunnon ja kunniallisuuden liian hyvin,
hetkeäkään pelätäkseni, että syntymääni liittyy mitään tahraa, kuten
te näytte vihjaavan. Äitini tuntemattomuus on minulle niin ollen vain
murhe eikä häpeä. Mutta teiltä puuttuu säädyllistä inhimillisyyttä,
monsieur, kun soimaatte minua seikasta, josta tunnen vain murhetta.
Loukkaus on joka tapauksessa nyt lausuttu, ja tällä kertaa katson
itseni loukatuksi! Olkoon siis sovittuna, että te välienne selviydyttyä
herra d'Artagnanin kanssa hyvitätte minun asiani."
"Ohoh", vastasi de Wardes karvaasti hymyillen, "sitä tavatonta
varovaisuutta, monsieur! Vastikään takasitte minun saavan herra
d'Artagnanin miekasta iskun, ja vasta sen tapahduttua te tarjoudutte
taistelemaan kanssani."
"Älkää olko siitä huolissanne", sanoi Raoul jäykän vimman
vallassa; "herra d'Artagnan on taitava miekkamies, ja minä pyydän
häneltä sitä suosiollisuutta, että hän menettelee teidän suhteenne
kuten isällennekin kävi, — että hän ei suorastaat surmaa teitä,
suodakseen minun nautinnokseni lopettaa teidät parannuttuanne,
sillä te olette ilkimys, jonka juonia kävisi vastedes vaikeaksi varoa,
herra de Wardes."
"Varomaan minäkin ryhdyn kaikkien teidän verukkeittenne osalle,
monsieur", vastasi de Wardes.
"Sallikaa minun, monsieur", puuttui puheeseen Buckingham,
"tulkita sananne herra de Bragelonnelle neuvona, että hänen on

43. paras hankkia rintahaarniska."
De Wardes puristi kätensä nyrkkiin. "Ahaa, minä ymmärrän!"
kähisi hän; "nämä herrat aikovatkin ensin varustautua sillä tavoin,
sitten mitelläkseen miekkaa kanssani."
"No, monsieur", virkkoi Raoul, "koska ehdottomasti tahdotte, niin
lopettakaamme tämä." Ja miekkansa ojentaen hän astahti de
Wardesia kohti.
"Mitä teettekään?" hämmästyi Buckingham.
"Olkaa huoletta", rauhoitti Raoul; "tämä päättyy pian."
De Wardes otti asentonsa, ja säilät kalskahtivat ristikkäin.
Riidanrakentaja syöksähti niin hillittömästi Raoulia vastaan, että
Buckingham jo ensimmäisistä liikkeistä havaitsi Raoulin säästävän
vastustajaansa. Herttua peräytyi pari askelta ja tarkkasi ottelua.
Raoul oli levollinen niinkuin hän olisi vain harjoitussalissa käytellyt
nuppikärkistä kalpaa. Hiukan peräytymällä hän vapautti miekkansa,
jonka toinen oli saanut kytketyksi kahvaa myöten, ja torjui
vastaiskuilla kolme tai neljä de Wardesin huitaisua; sitten hän
survaisi alhaalta neljännespiston, jonka de Wardes väisti
rannepyöräytyksellä, mutta silloin Raoul sai hänen säilänsä
kammitsaan ja sinkautti sen kiivaalla nykäisyllä kahdenkymmenen
askeleen päähän kaiteen taakse. Vastustajan siten jäädessä
seisomaan aseettomana ja neuvottomana Raoul pisti miekkansa
huotraan, tarttui vihamiestänsä kauluksesta ja vyöstä ja paiskasi
hänet kaiteen yli tiepuoleen sätkivänä ja raivosta karjahtelevana.
"Näkemiin! näkemiin!" jupisi de Wardes kömpien jaloilleen ja
siepaten säilänsä takaisin.

44. "Ka, pardieu", vastasi Raoul, "minä olen teitä jo tunnin ajan
hyvästellyt." Buckinghamiin kääntyen hän sitten jatkoi: "Ei
sanaakaan tästä, herttua, minä pyydän; minua hävettää, että
johduin tähän äärimmäisyyteen, mutta kiivastus voitti malttini.
Pyydän teitä suomaan anteeksi ja unohtamaan."
"Voi, hyvä varakreivi", sanoi herttua puristaen kovakouraisen ja
voimakkuudessaan säyseän nuoren miehen kättä, "sallittehan minun
toki päin vastoin muistella tätä mieleenpainuvaa kohtausta ja ajatella
tulevaisuuttanne? Tuo mies on vaarallinen, hän voi surmata teidät."
"Isäni on elänyt kaksikymmentä vuotta paljon pelättävämmän
vihollisen uhkaamana", vastasi Raoul, "ja hän on säilynyt. Jumala
suosii sukuamme, herttua."
"Isällänne oli hyviä ystäviä, varakreivi."
"Ah, niitä ystäviä ei hänellä enää olekaan", huokasi Raoul.
"Sitä älkää sanoko, minä pyydän, juuri nyt tarjotessani teille
ystävyyttäni."
Ja Buckingham avasi sylinsä Raoulille, joka ilomielin vastaanotti
esitetyn liiton.
"Minun suvussani", lisäsi Buckingham, "kuollaan niiden puolesta,
joita rakastetaan, senhän tiedätte, herra de Bragelonne."
"Kyllä, herttua, tiedän sen", vastasi Raoul.
88.

45. Mitä Lotringin junkkari ajatteli Madamesta.
Mikään ei enää häirinnyt matkueen rauhaa. Keksien tekosyyn de
Wardes pujahti edelle kenenkään kummastelematta. Hän otti
mukaansa Manicampin, jonka tasainen ja mietiskelevä luonnonlaatu
soveltui pitämään hänen mieltänsä tasapainossa. On huomattava
seikka, että riidanhaluiset ja rauhattomat sielut aina helposti liittyvät
säveihin ja arkoihin luonteisiin, ikäänkuin toinen etsisi
vastakohdastaan lepoa kiihtymykselleen ja toinen turvaa
heikkoudelleen.
Buckingham ja Bragelonne ottivat de Guichen kumppanuuteensa
ja viettivät lopun matkaa yksimielisessä prinsessan ylistelyssä.
Tällainen Bragelonnen ansiosta ääneen päässyt julkinen ihailukuoro
sai aikaan hyvää sopusointua seurueessa sen yksinäisen
jumaloimisen jälkeen, jonka herttua ja de Guiche olivat ensimmältä
omaksuneet vaaralliseksi tavakseen. Tänä muutos miellytti suuresti
leskikuningatarta, mutta ei näköjään ollut niin tervetullut nuorelle
prinsessalle, joka oli hillittömin keimaileva ja maineensa puolesta
pelkäämättä etsi kaikkinaisia mielistelyn vaaroja. Hänellä oli
tuollainen rohkea ja huima sydän, joka tuntee mielihyvää
äärimmäisen arkaluontoisista tilanteista ja leikkii täpäräin
kommellusten taidokkaalla väistelyllä. Katseillaan, hymyilyllään,
puvuillaan, ehtymättömillä viehättelyilmeillään hän nyt entistä
innokkaammin ahdisteli noita kolmea nuorta miestä, ja samalla
häneltä riitti salavihkaisia silmäyksiä, sormisuukkosia ja muita
tenhottaren eleitä etäämmäksikin seurueen aatelismiesten
keskuuteen, — ja vieläpä saivat osansa kaupunkien porvarit ja
virkailijat, kansa, paashit, lakeijat: se oli yleistä pommitusta, ja tuho
tuntui kaikkialla koko taipaleella. Pariisiin saapuessaan prinsessa oli

46. matkansa varrella saanut satatuhatta rakastajaa ja toi mukanaan
pääkaupunkiin puolikymmentä narria ja kaksi aivan hullaantunutta
palvojaa.
Ainoastaan Raoul tajusi selvästi tämän kaunottaren lumouskiihkon,
ja kun hänellä ei ollut tilaakaan sydämessään, kykeni hän sitä
paremmalla onnella torjumaan tenhovasamat, päätyen perille
kylmäkiskoisena ja epäluuloisen arvostelevana. Toisinaan hän oli
taipaleella puhellut leskikuningattaren kanssa tästä prinsessan
huumaavasta loihtuvoimasta, joka valloitti koko hänen ympäristönsä,
ja kerran oli monista onnettomuuksista ja pettymyksistä
elämänkokemusta saanut äiti virkkanut: "Henriettestä tulisi kuuluisa
nainen, vaikka hän olisi syntynyt aivan huomaamattomissakin
oloissa, sillä hänellä on harvinaisessa määrin mielikuvitusta, oikullista
omapäisyyttä ja tahdonvoimaa."
De Wardes ja Manicamp olivat pikaläheteiksi tekeytyneinä
ennättäneet viestiä prinsessan lähestymisestä. Niinpä tulikin
matkuetta vastaan Nanterressa peräti loistava jono ratsastajia ja
kaleeseja. Kruununprinssi siinä tuli tervehtimään kuninkaallista
kihlattuaan Lotringin junkkarin ja muiden suosikkiensa saattamana,
ja kulkueen jatkoksi oli liittynyt osa kuninkaan seurueeseen kuuluvia
upseereja.
Jo Saint-Germainissa olivat prinsessa ja hänen äitinsä vaihtaneet
hieman raskaat ja taipaleella vikaantuneet kaleesinsa siroihin ja
keveämpiin matkavaunuihin, joita kuusi valkoista hevosta veti
kullatuissa valjaissa. Näissä uhkeissa ajopeleissä näyttäysi nuori ja
kaunis prinsessa kuin valtaistuimella, ja pitkillä sulkaripsillä
reunustettu kirjailtu silkkinen päivänvarjo loi herttaista
ruusunpunaista heijastusta hänen säteilevälle helmiäishipiälleen, kun

47. kruununprinssi lähestyi. Saadessaan vastaansa tämän hurmaavan
säihkyn hän ilmaisikin ihastustaan niin selvin sanoin, että Lotringin
junkkari kohautteli olkapäitänsä hovilaisten ryhmässä ja kreivi de
Guiche ja Buckinghamin herttua tunsivat vihlaisun sydämessään.
Kohteliaisuuksista ja muista muodollisuuksista suoriuduttua lähti
koko joukkue verkkaisemmin taivaltamaan Pariisia kohti. Ohimennen
tapahtuneessa esittelyssä oli Buckinghamin herttua tervehtinyt
kruununprinssiä muiden englantilaisten aatelismiesten keralla. Mutta
matkalla sitten nähdessään herttuan hyörivän innokkaana prinsessan
vaunujen vierellä Filip tiedusti Lotringin junkkarilta, eriämättömältä
kumppaniltaan:
"Kuka tuo herrasmies onkaan?"
"Hänet esiteltiin vastikään teidän kuninkaalliselle korkeudellenne",
vastasi junkkari; "hän on pulska Buckinghamin herttua."
"Niin, aivan oikein!"
"Madamen ritari", lisäsi suosikki, sovittaen näköjään yksinkertaisen
huomautuksen niin omituisesti sanoiksi ja lausuen sen min
merkitsevällä äänenpainolla kuin ainoastaan kateelliset sielut
kykenevät vihjailemaan.
"Kuinka? Mitä sanotkaan?" kysäisi prinssi ratsastaen yhä edelleen.
"Ritari, sanoin."
"Onko madamella muka erityinen ritari?"
"Dame, kai te sen näette kuten minäkin; katsokaahan vain kuinka
he nauravat ja ilakoivat kaksistaan."

48. "Kolmisin: onhan de Guichekin mukana."
"Niin, tosiaankin… Mutta mitäpä se osoittaa muuta kuin että
madamella onkin kaksi ritaria."
"Sinä valat myrkkyä kaikkeen, senkin kyy!"
"Minussa ei ole mitään myrkkyä… tehän nyt olette kummallisella
päällä, monseigneur: naisenne saa osakseen mitä suurinta
huomaavaisuutta, mutta te ette vain ole tyytyväinen."
Kruununprinssi pelkäsi junkkarin ivanhenkeä, tuntiessaan sen
alkavan päästä vauhtiin, ja keskeytti puheenaineen. "Prinsessa on
sievä", virkkoi hän huolettomasti kuin vierasta arvostellen.
"Kyllä", vastasi junkkari samaan tapaan. "Lausut myönnytyksesi
ihan kuin epäyksenä. Hänellä on kuitenkin mielestäni hyvin kauniit
mustat silmät."
"Pienet."
"Totta kyllä, mutta säihkyvät. Hän on myös siro varreltaan."
"Hiukan liiankin hoikka, monseigneur."
"Saattaapa olla. Hänellä on ylväs katsanto."
"Mutta laihat kasvot."
"Hampaat näyttivät lumoavilta."
"Niitä saakin katsella — suu on siksi suuri, Jumala paratkoon! Olin
ehdottomasti väärässä, monseigneur: te olette kauniimpi kuin
morsiamenne."

49. "Ja olenko mielestäsi Buckinghamiakin kauniimpi? Sanoppas."
"Oh, olettehan toki, ja näkyypä hänkin sen tuntevan: katsokaa,
kuinka hän nyt yhä innokkaampana liehittelee Madamen parissa,
jotta te ette riistäisi häneltä tehoa!"
Filip liikahti kärsimättömästi, mutta huomatessaan voitonriemuisen
hymynhäiveen junkkarin huulilla hän pidätti ratsunsa käyntiin ja
sanoi:
"Miksi muuten nyt puhuisinkaan yhä serkustani? Enkö tunne häntä
ennestään? Emmekö ole yhdessä saaneet kasvatustamme, joka
päivä seurustelleet keskenämme Louvressa?"
"Suokaa anteeksi, monseigneur, onhan hän siitä asti muuttunut
aivan toiseksi ihmiseksi", huomautti junkkari. "Mainitsemaanne
aikaan hän oli vähemmän säihkyvä ja olletikin paljon vähäisemmässä
määrin ylpeä. Muistanette senkin illan, jolloin nuori kuningas ei
tahtonut tanssia hänen kanssaan, sanoen prinsessaa rumaksi ja
huonosti puetuksi?"
Se muistutus sai kruununprinssin rypistämään silmäkulmiansa.
Hänelle ei tosiaan ollut imartelevaa mennä naimisiin prinsessan
kanssa, jota kuningas oli menneinä päivinä hylkinyt. Hän olisi kenties
vastannut jotakin, mutta samassa de Guiche loittoni hovivaunujen
äärestä, karauttaen Filipiä kohti. Kreivi oli tarkkaillut kruununprinssiä
ja junkkaria ja näytti levottomalta aavistelemaan, mihin suuntaan
heidän keskustelunsa kävi. Häijyydessään tai
häpeämättömyydessään ei jälkimmäinen yrittänytkään sitä salata.
"Teillä, kreivi, on hyvä aisti", aloitti hän.

50. "Kiitän kohteliaisuudesta", vastasi de Guiche, "mutta miksi niin
sanotte?"
"No, te olette oleskellut kahdeksan vuorokautta madamen
seurassa, eikö niin?"
"Kyllähän", myönsi de Guiche väkisinkin punastuen.
"Sanokaakin siis meille suoraan, mitä ajattelette hänen
olennostaan."
"Hänen olennostaan?" kertasi de Guiche hämillään.
"Niin, — ulkonaisesta ja sisällisestä puolesta… kaikesta."
Kysymyksen yllättämänä kreivi ei tiennyt mitä vastata.
"No, no, tietysti teillä on mielipiteenne hänestä, ja ilmoittakaa
käsityksenne vain avoimesti: hänen kuninkaallinen korkeutensa
käskee", kiusasi junkkari nauraen.
"Niin, puhu vapaasti", virkkoi prinssi.
De Guiche sopersi muutamia käsittämättömiä sanoja.
"Tiedän kyllä, että aihe on arkaluontoinen", rohkaisi sulhanen,
"mutta ainahan voit minulle huoletta ilmaista ajatuksesi. Miltä hän
sinusta tuntuu?"
Salatakseen, mitä hänen mielessään liikkui, de Guiche turvautui
ainoaan kiireisesti käytettävään puolustuskeinoon: hän sovitti
arvostelmansa keskiteitse.

51. "En ole saanut madamesta hyvää enkä huonoa käsitystä", hän
sanoi, "mutta paremminkin hän on sentään tehnyt edullisen
vaikutuksen."
"Mutta, hyvä kreivi", huudahti junkkari, "teidäthän hurmasi hänen
pelkkä muotokuvansa!"
De Guiche karahti punaiseksi hiusmartoa myöten. Onneksi hänen
hiukan vauhko ratsunsa auttoi sivuhyppäyksellään häntä peittämään
hämmennystään.
"Muotokuva?" änkkäsi hän jälleen lähestyessään.
"Niin, se pienoiskuva", tiukkasi junkkari, hellittämättömästi
tähystäen häntä; "eikö se siis vastannutkaan mielestänne
todellisuutta?"
"Enpä tiedä, — se ei niin jäänyt mieleeni."
"Se vaikutti teihin kuitenkin hyvin voimakkaasti."
"Mahdollista kyllä."
"Onko hänellä edes henkevyyttä?" tiedusti prinssi.
"On paljonkin, luullakseni", vastasi de Guiche.
"Entä Buckinghamin herttualla?" kysyi junkkari.
"Sitä en osaa sanoa."
"Minä kyllä luulisin olevan", jatkoi junkkari, "sillä hän pitää
Madamea naurutuulella ja näkyy esiintyvän mieluisana seuralaisena;
älykäs nainen ei milloinkaan viihdy typerän miehen parissa."

52. Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
ebookultra.com