Dương Duy Thanh - THÚ Y 17 - TDU - TÌNH TRẠNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP TRÊN CÁ THỂ RẮN KỲ LÂN TẠI TỈNH LÂM ĐỒNG.pptx

Dương Duy Thanh - THÚ Y 17 - TDU - TÌNH TRẠNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP TRÊN CÁ THỂ RẮN KỲ LÂN TẠI TỈNH LÂM ĐỒNG

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG   TÌNH TRẠNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN CÁ THỂ RẮN TÊ GIÁC – RHYNCHOPHIS BOULENGERI MOCQUARD, 1897 TẠI TỈNH LÂM ĐỒNG   ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

2. I. ĐẶT VẤN ĐỀ: II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: V. DỰ TRÙ KINH PHÍ: IV. KẾT QUẢ DỰ KIẾN: III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

3. I. ĐẶT VẤN ĐỀ: Hiện nay, việc các vi sinh vật gây bệnh đang ngày càng tiến hóa để thích nghi với những nguồn kháng sinh và chúng tiếp tục lan tràn rộng rãi trong các quần thể sinh vật hoang dã và nuôi trong nhà. Ở đây chúng ta nói về nhiễm trùng đường hô hấp ở lớp Reptilia , tác nhân gây bệnh phổ biến nhất được tìm thấy trong môi trường của rắn là  Pseudomonas aeruginosa . Về việc điều trị nhiễm trùng hô hấp do P. aeruginosa thường vấp phải nhiều khó khăn do nhóm vi khuẩn có khả năng kháng thuốc kháng sinh cao và rộng rãi. Ở nghiên cứu của Lukac et al . (2013) trên một con rắn đuôi chuông đen bị áp xe và có dấu hiệu suy hô hấp, tác nhân có sự tham gia của P. aeruginosa thử nghiệm với phác đồ điều trị là sự kết hợp của các kháng sinh marbofloxacin , betamethasone và gentamicin . Liệu trình mang lại kết quả tích cực.

4. I. ĐẶT VẤN ĐỀ: Rắn là vật nuôi phổ biến trên toàn cầu và được coi trọng vì vai trò của chúng trong y học cổ truyền và là một món ăn ngon ở các nước châu Á. Các cuộc khảo sát gần đây chỉ ra rằng có hơn 1,7 triệu con rắn cảnh được nuôi trong các hộ gia đình ở Mỹ. Việt Nam ta là một nước với hệ sinh thái rừng núi đa dạng, sở hữu nhiều loài sinh vật độc đáo, các cá thể rắn cũng đóng góp một phần không nhỏ trong sự đa dạng sinh thái đó. Việc mất đi một quần thể sinh vật sẽ làm mất đi sự đa dạng sinh học trong quần xã tại khu vực. Ngoài ra, rắn còn là động vật quan trọng tham gia trong mắt xích của chuỗi thức ăn. Việc con người hay động vật nuôi khác bị lây bệnh do tiếp xúc trực tiếp với ký chủ. Trên thực tế, báo cáo mới nhất từ ​​Đài Loan minh họa rằng tỷ lệ bị rắn cắn lên tới hơn 1.000 trường hợp mỗi năm; ở Hoa Kỳ mỗi năm có từ 150.000 đến 300.000 động vật bị rắn cắn.

5. I. ĐẶT VẤN ĐỀ: Căn cứ theo những thông tin trên, mục tiêu của đề tài sẽ là dựa trên đặc điểm kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa phân lập được trên cá thể Rhynchophis boulengeri tại khu vực rừng thuộc tỉnh Lâm Đồng. Nhằm cung cấp nguồn thông tin bổ trợ cho các công cuộc nghiên cứu sản xuất thuốc chữa bệnh do P. aeruginosa trên bò sát khác, hay các động vật bị rắn mang mầm bệnh cắn. Việc này sẽ giúp kiểm soát nguồn lây bệnh trong tương lai; bảo vệ sự đa dạng sinh học khu vực,… Ngoài ra, giúp bảo tồn một số cá thể rắn đặc hữu, quý hiếm của Việt Nam. Hình 1.1. Một số loài rắn đặc hữu của Việt Nam.

6. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Pseudomonas aeruginosa  là trực khuẩn Gram (-), hiếu khí. Có thể hoạt động như một tác nhân gây nhiễm trùng kế phát ở người và động vật. Thường có trong hệ vi khuẩn đường ruột và hậu môn của rắn khỏe mạnh. Hình 2.1. Pseudomonas aeruginosa . 2.1. Nhiễm trùng Pseudomonas aeruginosa : 2.1.1. Vi khuẩn gây bệnh: 2.1.1.1. Đặc điểm hình thái:

7. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như  phổi ,  đường tiết niệu , và  thận , sẽ dẫn đến tử vong đối với ký chủ. P. aeruginosa bị tiêu diệt ở 100℃ và bởi các thuốc sát khuẩn thông thường. Khi không ký sinh sẽ sống ở trong đất, nước. Mặc dù được phân loại là một  sinh vật hiếu khí ,  P. aeruginosa  còn được xem như là sinh vật  kị khí tùy tiện , vì có thể tăng sinh  yếm khí  bằng cách sử dụng  nitrat . 2.1. Nhiễm trùng Pseudomonas aeruginosa : 2.1.1. Vi khuẩn gây bệnh: 2.1.1.1. Đặc điểm hình thái:

8. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Trực khuẩn mủ xanh mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí. Nhiệt độ thích hợp 37 ℃ nhưng phát triển được ở nhiệt độ 5 – 42 ℃; pH thích hợp 7,2 – 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 – 9,0. Chúng có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố, bao gồm  pyocyanin  (lam-lục),  pyoverdin  (vàng-lục), và pyorubin (đỏ-nâu). P. aeruginosa  thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngoài của khuẩn lạc  óng ánh như hạt trai  và có mùi thơm (tương tự mùi dầu chuối) khi được nuôi cấy  in vitro . 2.1.1.2. Đặc điểm nuôi cấy:

9. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Tính trạng sinh hóa: Oxydase (+), Catalase (+). Không lên men lactose và saccharose . Sử dụng một số loại đường bằng hình thức oxy hóa có sinh acid như glucose , mannitol , arabinose , galactose , fructose . 2.1.1.2. Đặc điểm nuôi cấy: Hình 2.2. Pseudomonas aeruginosa tiết ra hai loại sắc tố . Hình 2.3. Pseudomonas aeruginosa trên thạch máu .

10. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: L à môi trường cơ bản và thông dụng nhất cho nhiều loại vi khuẩn, bao gồm  Pseudomonas aeruginosa . Nó cung cấp các dưỡng chất cần thiết cho vi khuẩn phát triển nhưng không đặc hiệu cho Pseudomonas . Dùng để nuôi cấy ban đầu hoặc nuôi cấy tổng quát. Khuẩn lạc thường có màu xanh dương hoặc xanh lá. 2.1.1.3. Đề xuất môi trường nuôi cấy: Hình 2.4. Khuẩn lạc xanh lục trên môi trường NA . a. Môi trường Nutrient Agar (NA):

11. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Là môi trường giúp kích thích sản xuất sắc tố pyocyanin , một sắc tố xanh dương đặc trưng của Pseudomonas aeruginosa . Dùng để phát hiện và phân lập các dòng vi khuẩn sản xuất pyocyanin . Khuẩn lạc có màu xanh dương đậm, dễ nhận biết. 2.1.1.3. Đề xuất môi trường nuôi cấy: Hình 2.5. Khuẩn lạc xanh lam trên môi trường King A . b. Môi trường Pseudomonas Agar P ( King A Medium ):

12. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Là một môi trường giàu dinh dưỡng, không chọn lọc, được sử dụng phổ biến trong nhiều thí nghiệm nuôi cấy. Dùng để nuôi cấy vi khuẩn tổng quát và lưu trữ mẫu Pseudomonas aeruginosa . Khuẩn lạc có thể xuất hiện xanh do sản xuất pyocyanin hoặc pyoverdine . 2.1.1.3. Đề xuất môi trường nuôi cấy: Hình 2.6. Khuẩn lạc trên môi trường TSA . c. Môi trường Tryptic Soy Agar (TSA):

13. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Môi trường được dùng để thử nghiệm kháng sinh (kháng sinh đồ). Đặc biệt sử dụng trong kiểm tra độ nhạy kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa . Khuẩn lạc không có đặc điểm riêng biệt về màu sắc trên môi trường này, nhưng quan trọng trong việc xác định tính kháng kháng sinh. 2.1.1.3. Đề xuất môi trường nuôi cấy: Hình 2.7. Khuẩn lạc trên đĩa MHA . d. Môi trường Mueller – Hinton Agar (MHA):

14. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Độc tố của  P. aeruginosa chỉ có tác động gây chết khi chúng được tạo ra với số lượng lớn . Về cơ chế gây bệnh, có giả thiết cho rằng các sản phẩm ngoại tiết như ngoại độc tố, yếu tố tan máu, sắc tố, độc tố ruột có vai trò chủ yếu. 2.1.1.4. Yếu tố độc lực: Hình 2.8. Các yếu tố độc lực của vi khuẩn .

15. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Tại chỗ vi khuẩn gây viêm có mủ. Nếu cơ thể giảm sức đề kháng hoặc do bệnh toàn thân, vi khuẩn xâm nhập và gây viêm các cơ quan như viêm bàng quang, tai giữa, màng não, màng bụng, … Có thể vi khuẩn vào máu gây nhiễm trùng huyết. 2.1.1.5. Triệu chứng lâm sàng: Hình 2. 9. Vết thương bị nhiễm Pseudomonas aeruginosa .

16. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Ở nghiên cứu của Roushan et al . (2021), một con trăn Miến Điện đang hấp hối. Ban đầu là các triệu chứng bồn chồn, chán ăn và da sẫm màu. Sau đó xuất hiện các dấu hiệu thở há miệng, da bong tróc một cách bất thường.  2.1.1.5. Triệu chứng lâm sàng: Hình 2.10. Sự bong tróc trên da rắn .

17. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: Ngoài ra còn có một số triệu chứng liên quan mật thiết đến hệ hô hấp như có nhiều dịch ở khoang miệng, chảy dịch mũi hoặc thanh quản và khó thở.  2.1.2. Triệu chứng lâm sàng: Hình 2.11. Khoang miệng của rắn nhiễm bệnh .

18. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.2. Triệu chứng lâm sàng: Hình 2.12. Niêm mạc rắn bệnh và niêm mạc rắn khỏe mạnh . Vào năm 2015, tại phòng khám động vật hoang dã ở Thụy Sĩ, một ca điều trị cá thể trăn Argentine về vấn đề hô hấp và nôn trớ kéo dài 3 tuần. Xuất hiện chứng loạn sản da được chứng minh là có vảy da còn sót lại trên cơ thể và xung quanh cả hai lỗ mũi sau khi lột. Khoang miệng chứa đầy chất nhầy và niêm mạc nhợt nhạt với một số điểm xuất huyết.

19. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.3. Bệnh tích: Hình 2.13. Dịch nhầy vàng đục trong miệng rắn . Roushan et al . (2021) khi điều tra cá thể trăn Miến Điện nhiễm bệnh đã tử vong, quan sát được có nhiều dịch tiết nhầy mủ màu vàng được thấy ở các phế quản phân đoạn giãn nở cao. Khám nghiệm tử thi thấy viêm miệng nghiêm trọng, viêm phổi, viêm gan và viêm thận, kèm theo viêm da khu trú lan rộng.

20. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.3. Bệnh tích: Tudor et al . (2015) khám nghiệm tử thi các cá thể rắn lục sừng Vipera ammodytes cho thấy cổ trướng chứa đầy chất lỏng màu vàng trong; gan to, cứng, màu vàng hồng; lá lách phình nhẹ và viêm ruột xuất huyết với thành ruột dày lên; phát hiện viêm ruột xuất huyết không rõ ràng vì niêm mạc ruột bị sung huyết và được bao phủ bởi một lớp dày chất nhầy chứa máu. Tháng 11 năm 1986, Jooris và cộng sự đã tìm thấy một cá thể Vipera Lebetina schweizeri trưởng thành đã chết trong hồ cạn. Miệng của nó đầy chất nhầy có mùi hôi nồng nặc lẫn máu, cơ thể thối rữa diễn ra nhanh chóng, xuất hiện viêm phổi, viêm ruột có mủ và có máu .

21. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.3. Bệnh tích: Hình 2.14. Phổi bị tắc nghẽn do chất nhầy màu vàng . Hình 2.15. Những phần bị phân hủy bất thường .

22. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.3. Bệnh tích: Hình 2.16. (A) Mô phổi bình thường của rắn khỏe mạnh và (B) Mô phổi bị tổn thương của rắn nhiễm bệnh .

23. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.4. Phòng bệnh và điều trị: 2.1.4.1. Phòng bệnh: Phòng không đặc hiệu: giữ gìn vệ sinh môi trường trong và ngoài chuồng nuôi, thực hiện nghiêm túc các qui trình khử trùng, tiệt trùng. Phòng đặc hiệu: một số nước trên thế giới đã chế vaccine phòng bệnh đặc hiệu nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của Pseudomonas aeruginosa .

24. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.4. Phòng bệnh và điều trị: 2.1.4.2. Điều trị: Một số phương pháp điều trị được các bác sĩ thú y nước ngoài đề cập đến như: Liệu pháp phun khí dung bằng kháng sinh pha loãng trong nước muối, kết hợp với acetylcysteine , đã được sử dụng cùng với kháng sinh tiêm. Đối với bệnh tích là các ổ áp xe: cần cắt bỏ hoàn toàn để tránh tái phát ở áp xe nhỏ. Các ổ áp xe lớn hơn nên được tạo túi, sau đó điều trị vết thương tại chỗ tích cực. Các vết áp xe ở khoang miệng, có thể sử dụng fluoroquinolone . Sử dụng dung dịch nhỏ Ciloxin ® và kem diệt khuẩn Silvadene ®. Bò sát bị bệnh nên được duy trì ở mức giữa đến cao của vùng nhiệt độ tối ưu ưa thích của chúng. T ích cực bổ sung các vitamin , đặc biệt là vitamin A và C.

25. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.1.4. Phòng bệnh và điều trị: 2.1.4.2. Điều trị: Hình 2.17. Ciloxan ® và Silvadene ® .

26. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.2. Rắn tê giác – Rhynchophis boulengeri : Là loài rắn vô hại. Mõm nhọn, có vảy sừng nhô lên trên. Sọc dưới vảy môi trên màu trắng. Mặt lưng màu xanh lá đậm, vảy có viền trắng hoặc đen hoặc đốm trắng. Mặt bên thân màu xanh lam, có một số vảy màu đen. Mặt bụng màu xanh lá nhạt, có sọc trắng men theo hai dãy vảy sừng hai bên thân đến đuôi. 2.2.1. Đặc điểm nhận dạng: Hình 2.18. Rhynchophis boulengeri .

27. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.2. Rắn tê giác – Rhynchophis boulengeri : Sinh sống trong  các khu rừng mưa cận nhiệt đới . Chúng thường  sống trên cây hoặc trong suối, chủ yếu  hoạt động vào ban đêm, săn chuột  nhỏ và  các loài gặm nhấm  khác .  Theo các tài liệu chưa được bình duyệt của những người nuôi tư nhân, R. boulengeri nuôi nhốt được báo cáo là dành nhiều thời gian ở dưới nước , đặc biệt là khi còn nhỏ điều này tạo điều kiện cho vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phát triển và gây bệnh bên trong cơ thể rắn. 2.2.2. Đặc điểm sinh thái: Hình 2. 19. Thói quen ngâm nước của rắn .

28. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.2. Rắn tê giác – Rhynchophis boulengeri : 2.2.2. Đặc điểm sinh thái: Hình 2.20. Rắn đẻ trứng. Là loài đẻ trứng. Khi trưởng thành, rắn tê giác chuyển sang màu xám thép vào khoảng 12 – 14 tháng, sau đó chuyển sang màu xanh lục lam hoặc xanh lục khi trưởng thành vào khoảng 24 tháng. Hình 2.21. Rắn tê giác con.

29. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.2.3. Tình trạng Rhynchophis boulengeri nuôi nhốt và hoang dã: Hình 2.22. Chuồng nuôi. Từ một nghiên cứu trên Hệ thống quản lý thông tin động vật học (ZIMS) và một số hội nhóm ưa thích bò sát, R. boulengeri được đánh giá là tương đối phổ biến trong điều kiện nuôi nhốt, cả trong khu vực tư nhân và chuyên nghiệp. 2.2.3.1. Tình trạng rắn nuôi nhốt:

30. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.2.3. Tình trạng Rhynchophis boulengeri nuôi nhốt và hoang dã: Có khá ít thông tin về tình trạng của loài này ngoài tự nhiên. Một số thông tin đề cập loài này có ít mối đe dọa trực tiếp từ việc thu thập hoang dã. Theo đánh giá của IUCN, R. boulengeri xếp vào nhóm mức độ ít quan tâm. 2.2.3.1. Tình trạng rắn hoang dã:

31. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.3. Tầm quan trọng của rắn đối với hệ sinh thái và đời sống con người: Nhìn chung, mỗi loài vật trong tự nhiên đều tồn tại với các mục đích nhất định. Ở loài rắn, sự xuất hiện của chúng đóng vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người và động vật:  Rắn đuôi chuông gỗ làm giảm các bệnh do ve truyền ở người. Rắn chuông gỗ ăn động vật gặm nhấm, là vật chủ của ve. Ve mang theo các bệnh truyền nhiễm có hại cho động vật như bệnh Lyme , sốt phát ban Rocky Mountain ,… Hình 2.23. Timber rattlesnake .

32. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.3. Tầm quan trọng của rắn đối với hệ sinh thái và đời sống con người: Nhìn chung, mỗi loài vật trong tự nhiên đều tồn tại với các mục đích nhất định. Ở loài rắn, sự xuất hiện của chúng đóng vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người:  Rắn độc có giá trị y học đối với sức khỏe con người. Một loại protein gọi là contortrostatin có trong nọc rắn đầu đồng được sử dụng để giúp điều trị ung thư vú. Duy trì đa dạng sinh học. Tạo điều kiện phát tán hạt thứ cấp, hỗ trợ sự phát triển và tồn tại của thực vật thông qua việc ăn các loài gặm nhấm ăn hạt. Là loại dược liệu quý.

33. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.4. Nguy cơ lây lan vi khuẩn từ rắn sang người và các loài động vật khác: Giống như các loài động vật khác, bò sát là vật chủ của các mầm bệnh do vi-rút, vi khuẩn và ký sinh trùng. Hầu hết các nghiên cứu hiện có về ký sinh trùng ở bò sát đều liên quan đến các cuộc điều tra sinh thái của ký chủ và tập trung vào các khía cạnh bảo tồn hơn là khả năng lây truyền dịch bệnh.

34. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.4. Nguy cơ lây lan vi khuẩn từ rắn sang người và các loài động vật khác: Nhiễm ký sinh trùng ở người và động vật thông qua: Tiêu thụ ký chủ. Tiếp xúc trực tiếp với chất thải của ký chủ. Bị lây truyền bằng cái vector (ve, bọ,…). Hình 2.24. Con đường lây nhiễm ký sinh trùng.

35. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.5. Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn dựa trên những nghiên cứu trước đó: Bảng 2.1. Phân bố MIC và thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh đối với  P. aeruginosa . Nguồn: Po-Yu et al . (2017).

36. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.5. Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn dựa trên những nghiên cứu trước đó: Bảng 2.2. Tỷ lệ các chủng P. aeruginosa kháng với các loại kháng sinh khác nhau.

37. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.5. Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn dựa trên những nghiên cứu trước đó: Bảng 2.3. Cơ chế kháng thuốc của PA .

38. II. CƠ SỞ LÝ LUẬN: 2.5. Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn dựa trên những nghiên cứu trước đó: Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng thuốc kháng khuẩn trước đó thúc đẩy sự xuất hiện của các mầm bệnh kháng thuốc. Điều này xảy ra vì thuốc kháng khuẩn được sử dụng gây ra áp lực chọn lọc ở tất cả các vi khuẩn nhạy cảm bị tiêu diệt hoặc ức chế, trong khi những vi khuẩn kháng thuốc vẫn sống sót. Kết quả là thành phần hệ vi sinh vật của vật chủ bị thay đổi và tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc có thể tăng lên và trở thành phần lớn trong vật chủ.

39. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.1. Thời điểm và địa điểm nghiên cứu: Đề cương được hoàn thành từ 10/2/2025 đến 10/3/2025 . Bệnh nhiễm trùng Pseudomonas aeruginosa trên rắn ở khu vực miền Nam Việt Nam thường xuất hiện vào mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 11), việc độ ẩm trong không khí tăng cao, vi khuẩn có thể xâm nhiễm và phát triển trong cơ thể ký chủ. Dựa theo lý do trên để xác định thời gian phù hợp để thực hiện thí nghiệm , có thể là từ tháng 6 , khi mùa mưa bắt đầu được 1 tháng, đến tháng 11 . 3.1.1. Thời điểm nghiên cứu:

40. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.1. Thời điểm và địa điểm nghiên cứu: T hực hiện tại phòng thí nghiệm chẩn đoán thú y của trường ĐH Tây Đô sau khi được trường cấp phép. 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu:

41. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2. Bố trí thí nghiệm: 10 cá thể Rhynchophis boulengiri thuộc khu vực rừng tỉnh Lâm Đồng. Lấy tổng cộng 1 mẫu tăm bông hậu môn và 1 mẫu tăm bông khoang miệng trên mỗi cá thể sau khi nuôi nhốt được 3 ngày. Tuy là loài rắn không độc nhưng cấu trúc răng của chúng là dạng móc câu, vết cắn sẽ đau và khó để tách ra. Thêm vào đó, việc các cá thể này có mang bệnh là không thể lường trước, cần hạn chế việc bị rắn cắn . Ghi lại những triệu chứng xuất hiện trên chúng (nếu có) để có thể xác định được hướng thí nghiệm. 3.2.1. Mẫu vật:

42. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: Như trên đã đề xuất một số môi trường nuôi cấy. Cần chuẩn bị: 20 đĩa môi trường NA để nuôi cấy tổng quát, là môi trường đầu tiên. 20 đĩa môi trường Pseudomonas Agar P để phân lập vi khuẩn 20 đĩa MHA để thực hiện kháng sinh đồ. 20 ống nghiệm chứa Glucose Broth để thử sinh hóa. 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.1. Chuẩn bị môi trường phân lập:

43. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: Ở giai đoạn này, ta sẽ dùng 20 đĩa môi trường NA đã chuẩn bị trước đó, 10 đĩa cấy mẫu tăm bông hậu môn và 10 đĩa cấy mẫu tăm bông khoang miệng. Ủ trong tủ ấm từ 24 – 48 giờ. 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.2. Nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu tăm bông: Hình 3.1. Đĩa môi trường NA trước khi cấy.

44. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: Tiếp tục cấy các khuẩn lạc được xác định là P. aeruginosa từ môi trường NA sang môi trường phân lập chuyên dụng là môi trường Pseudomonas Agar P. Sau đó ủ các đĩa trong tủ ấm 24 – 48 giờ. 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.3. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa : Hình 3.2. Đĩa môi trường Pseudomonas Agar P trước khi cấy.

45. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.4. Định danh vi khuẩn: a. Nhuộm Gram : Trực khuẩn Gram (-) quan sát dưới kính hiển vi, khi nhuộm sẽ có màu đỏ. Hình 3.4. P. aeruginosa đã được nhuộm Gram .

46. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.4. Định danh vi khuẩn: b. Thử sinh hóa: Hình 3.5. Thử sinh hóa P.aeruginosa trong môi trường Glucose Broth . Đối với phản ứng oxy hóa glucose , được thực hiện trong môi trường Glucose Broth . Sau 24 giờ ủ ấm, kết quả là ống nghiệm chuyển từ vàng nhạt sang đỏ nhạt-hồng, không sản xuất khí do không có sự lên men glucose .

47. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.4. Định danh vi khuẩn: b. Thử sinh hóa: Hình 3.6. Thử phản ứng Oxidase . Đối với phản ứng Oxidase , chúng ta dùng Oxidrop TM . Đặt mảnh giấy nến vào trong đĩa Petri trống, sau đó nhỏ 1 – 2 giọt Oxidrop TM lên mảnh giấy. Dùng que cấy nhựa lấy vi khuẩn và quét lên chỗ giấy đã được nhỏ chỉ thị. Vết bôi chuyển sang màu tím sẫm. Đây được xem là kết quả dương tính.

48. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: Ứng dụng RT-PCR: Thao tác này có thể giúp phát hiện nhanh chóng mã gen kháng kháng sinh của vi khuẩn, từ đó giúp lựa chọn được kháng sinh phù hợp để bắt đầu thực hiện kháng sinh đồ. Một số gen phổ biến: gen ampC , OXA – 48 – like , tetA ,…

49. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.5. Kháng sinh đồ: Độ nhạy cảm kháng sinh của P. aeruginosa được đánh giá bằng phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch. T iến hành thử nghiệm với các loại kháng sinh được cho là có tác dụng trong việc điều trị P. aeruginosa : Cefepime (CPM) , ciprofloxacin (CIP), levofloxacin (LVX), finafloxacin (FNX), mezlocillin (MEZ), doripenem (DPM), tobramycin (TM), gentamicin (GM), marbofloxacin (MBF), aztreonam (AZM).

50. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.5. Kháng sinh đồ: Hình 3.6. Diễn biến trên đĩa kháng sinh đồ.

51. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.6. Chỉ tiêu nghiên cứu: Quan sát đĩa kháng sinh đồ sau khi ủ 24 – 48 giờ để lập nên chỉ tiêu bao gồm: kích thước của vòng kháng sinh, tỷ lệ kháng kháng sinh, sau đó kết hợp với bảng tiêu chuẩn M100 của CLSI từ đó đưa ra kết quả tính kháng kháng sinh của P. aeruginosa . So sánh với các nghiên cứu trước đó. T ỷ lệ kháng thuốc cerepime là 19,6%, CIP là 1%, LVX là 16,9%, MEZ là 46%, DPM là 16,2%, TM là 9%, GM là 35%, MBF là 1%, AZM 2 – 5%. Bảng 3.1. Quy định đặt khoanh giấy kháng sinh dựa theo tiêu chuẩn M100 của CLSI.

52. III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm: 3.2.2.7. Xử lý số liệu: Các số liệu thu được từ thí nghiệm trên sẽ được thống kê và phân tích bằng phần mềm SPSS 22.0.

53. IV. KẾT QUẢ DỰ KIẾN: 4.1. Sự phổ biến của P. aeruginosa trong quần thể R. boulengeri : Với 10 cá thể được thí nghiệm, sau công đoạn nuôi cấy ban đầu trên môi trường thạch dinh dưỡng NA, ta có thể đánh giá được số lượng đĩa xuất hiện khuẩn lạc P. aeruginosa và từ đó đưa ra được tỷ lệ vi khuẩn có mặt trên cá thể R. boulengeri ngoài tự nhiên. Bảng 4.1. Tỷ lệ P. aeruginosa phân lập trên 10 cá thể R. boulengeri.

54. IV. KẾT QUẢ DỰ KIẾN: 4.2. Tình trạng kháng kháng sinh của P. aeruginosa phân lập trên R. boulengeri : Khi bài nghiên cứu được thực hiện, ta sẽ có được kết quả về đặc điểm kháng thuốc của vi khuẩn được biểu hiện trên đĩa môi trường MHA với những vùng vi khuẩn không phát triển, vùng phát triển ít và vùng phát triển bình thường. Bảng 4.2. Tính kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa .

55. V. DỰ TRÙ KINH PHÍ: Bảng 5.1. Bảng dự trù kinh phí .

56. TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1. Lyczak JB, Cannon CL, Pier GB. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection : lessons from a versatile opportunist . Microbes Infect . Tháng Bảy 2000;2(9):1051–60. 2. Rubin J, Walker RD, Blickenstaff K, Bodeis-Jones S, Zhao S. Antimicrobial resistance and genetic characterization of fluoroquinolone resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from canine infections . Vet Microbiol . 18 Tháng Chín 2008;131(1–2):164–72. 3. Blaylock RS. Normal oral bacterial flora from some southern African snakes . Onderstepoort J Vet Res . Tháng Chín 2001;68(3):175–82. 4. Draper CS, Walker RD, Lawler HE. Patterns of oral bacterial infection in captive snakes . J Am Vet Med Assoc . 1 Tháng Chạp 1981;179(11):1223–6. 5. Hancock REW, Speert DP. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa : mechanisms and impact on treatment . Drug Resist Updat Rev Comment Antimicrob Anticancer Chemother . Tháng Tám 2000;3(4):247–55. 6. Lukac M, Matanovic K, Barbic L, Seol B. Combination treatment of a pseudomonad abscess in a western black-tailed rattlesnake Crotalus molossus molossus . Veterinární Medicína . 31 Tháng Chạp 2013;58(12):637–40. 7. van den Bogaard AE, Stobberingh EE. Epidemiology of resistance to antibiotics . Links between animals and humans . Int J Antimicrob Agents . Tháng Năm 2000;14(4):327–35. 8. Alvarez-Ortega C, Wiegand I, Olivares J, Hancock REW, Martínez JL. The intrinsic resistome of Pseudomonas aeruginosa to β- lactams . Virulence . 2011;2(2):144–6.

57. Cảm ơn cô đã theo dõi bài báo cáo đề cương NCKH