Epiblast Stem Cells Methods and Protocols 1st Edition Daniel C. Factor

Visit https://ebookultra.com to download the full version and
explore more ebooks or textbooks
Epiblast Stem Cells Methods and Protocols 1st
Edition Daniel C. Factor
_____ Click the link below to download _____
https://ebookultra.com/download/epiblast-stem-cells-methods-
and-protocols-1st-edition-daniel-c-factor/
Explore and download more ebooks or textbooks at ebookultra.com

Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Pluripotent Stem Cells Methods and Protocols 1st Edition
Michal Amit (Auth.)
https://ebookultra.com/download/pluripotent-stem-cells-methods-and-
protocols-1st-edition-michal-amit-auth/
Biomimetics and Stem Cells Methods and Protocols 1st
Edition Gordana Vunjak-Novakovic
https://ebookultra.com/download/biomimetics-and-stem-cells-methods-
and-protocols-1st-edition-gordana-vunjak-novakovic/
Human Pluripotent Stem Cells Methods and Protocols 1st
Edition Robin L. Wesselschmidt
https://ebookultra.com/download/human-pluripotent-stem-cells-methods-
and-protocols-1st-edition-robin-l-wesselschmidt/
Genetic modification of hematopoietic stem cells methods
and protocols 1st Edition Guillermo Guenechea
https://ebookultra.com/download/genetic-modification-of-hematopoietic-
stem-cells-methods-and-protocols-1st-edition-guillermo-guenechea/

Stem Cells in Ophthalmology 1st Edition Daniel H.
Scorsetti
https://ebookultra.com/download/stem-cells-in-ophthalmology-1st-
edition-daniel-h-scorsetti/
Stem Cells And Regenerative Medicine 1st Edition Walter C.
Low
https://ebookultra.com/download/stem-cells-and-regenerative-
medicine-1st-edition-walter-c-low/
Epidermal Growth Factor Methods and Protocols 1st Edition
Francis Edwin
https://ebookultra.com/download/epidermal-growth-factor-methods-and-
protocols-1st-edition-francis-edwin/
Mast Cells Methods and Protocols 1st Edition Harsha Vyas
https://ebookultra.com/download/mast-cells-methods-and-protocols-1st-
edition-harsha-vyas/
Stem Cell Niche Methods and Protocols 1st Edition Lichao
Luo
https://ebookultra.com/download/stem-cell-niche-methods-and-
protocols-1st-edition-lichao-luo/

Epiblast Stem Cells Methods and Protocols 1st Edition
Daniel C. Factor Digital Instant Download
Author(s): Daniel C. Factor, Fadi J. Najm, Paul J. Tesar (auth.), Ramiro
Alberio (eds.)
ISBN(s): 9781627036283, 1627036288
Edition: 1
File Details: PDF, 6.26 MB
Year: 2013
Language: english

Epiblast
Stem Cells
Ramiro Alberio Editor
Methods and Protocols
Methods in
Molecular Biology 1074

METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY™
Series Editor
John M. Walker
School of Life Sciences
University of Hertfordshire
Hat ﬁ eld, Hertfordshire, AL10 9AB, UK
For further volumes:
http://www.springer.com/series/7651

Epiblast Stem Cells
Methods and Protocols
Edited by
Ramiro Alberio
School of Biosciences, University of Nottingham, Loughborough, UK

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)
ISBN 978-1-62703-627-6 ISBN 978-1-62703-628-3 (eBook)
DOI 10.1007/978-1-62703-628-3
Springer New York Heidelberg Dordrecht London
Library of Congress Control Number: 2013945871
© Springer Science+Business Media New York 2013
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, speciﬁ cally the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microﬁ lms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed. Exempted from this
legal reservation are brief excerpts in connection with reviews or scholarly analysis or material supplied speciﬁ cally for
the purpose of being entered and executed on a computer system, for exclusive use by the purchaser of the work.
Duplication of this publication or parts thereof is permitted only under the provisions of the Copyright Law of the
Publisher’s location, in its current version, and permission for use must always be obtained from Springer. Permissions
for use may be obtained through RightsLink at the Copyright Clearance Center. Violations are liable to prosecution
under the respective Copyright Law.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not
imply, even in the absence of a speciﬁ c statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and
regulations and therefore free for general use.
While the advice and information in this book are believed to be true and accurate at the date of publication, neither
the authors nor the editors nor the publisher can accept any legal responsibility for any errors or omissions that may be
made. The publisher makes no warranty, express or implied, with respect to the material contained herein.
Printed on acid-free paper
Humana Press is a brand of Springer
Springer is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)
Editor
Ramiro Alberio
School of Biosciences
University of Nottingham
Loughborough , UK

The cells of the epiblast give rise to all the tissues of the embryo proper. How epiblast cells
acquire pluripotent features and how they transition to form the trilaminar embryo are cur-
rent topics of intense investigation. A more detailed understanding of these in vivo events
will lead to improved strategies for in vitro cellular differentiation protocols and genetic
modiﬁ cation. In Epiblast Stem Cells : Methods and Protocols , leading researchers provide a
detailed collection of techniques and protocols useful to the study of the biology of the
pluripotent epiblast. As embryo development varies in model organisms, this volume
includes chapters describing techniques used to study epiblast development in different
amniotes. This collection brings contributions from the ﬁ elds of embryology, stem cell
biology and developmental biology together, such that readers can ﬁ nd in a single volume
detailed procedures for the isolation and culture of epiblasts at different stages of develop-
ment and techniques for the study of differentiation into speciﬁ c lineages. Over the past ﬁ ve
years, advances in the molecular characterization of pluripotent cells have led to a new
understanding of how metastable states of pluripotency develop during the transition
between the early inner cell mass to the late epiblast stage. Exploiting this new knowledge
has enabled researchers to develop protocols that capture these novel pluripotent interme-
diates. These intermediate stages of pluripotency are important for modelling the transi-
tions that these cells undergo in vivo and will contribute to improving the development of
robust in vitro differentiation protocols.
Written in the highly successful Methods in Molecular Biology ™ series format, chapters
include introductions to their respective topics, a complete list of the necessary materials
and reagents, detailed laboratory protocols, and extensive notes providing suggestions on
troubleshooting and how to overcome common difﬁ culties.
I hope the chapters presented in this volume will serve as an up-to-date source of novel
protocols developed as a result of the new understanding in pluripotency and will contrib-
ute to the incremental use of stem cell technologies in different species.
Comprehensive and cutting-edge Epiblast Stem Cells : Methods and Protocols serves as a
resource to individuals interested in studying the biology of pluripotent cells.
Loughborough , UK Ramiro Alberio Pref ace

Contents
Preface ............................................................................................................................. v
Contributors .................................................................................................................... ix
1 Generation and Characterization of Epiblast Stem Cells
from Blastocyst-Stage Mouse Embryos ............................................................. 1
Daniel C. Factor, Fadi J. Najm, and Paul J. Tesar
2 Reversion of Mouse Postimplantation Epiblast Stem Cells
to a Naïve Pluripotent State by Modulation of Signalling Pathways ................... 15
Astrid Gillich, Siqin Bao, and M. Azim Surani
3 Converting Mouse Epiblast Stem Cells into Mouse Embryonic Stem Cells
by Using Small Molecules ................................................................................. 31
Wenlin Li and Sheng Ding
4 Isolation and Culture of Rabbit Embryonic Stem Cells ..................................... 39
Arata Honda
5 Goat Embryonic Stem-Like Cell Derivation and Characterization ..................... 51
Esmail Behboodi, Louise Lam, William G. Gavin, Alla Bondareva,
and Ina Dobrinski
6 Derivation and Culture of Canine Embryonic Stem Cells .................................. 69
Ian C. Tobias, Courtney R. Brooks, Jonathan H. Teichroeb,
and Dean H. Betts
7 Isolation and Culture of Porcine Embryonic Stem Cells .................................... 85
Ivan Vassiliev and Mark B. Nottle
8 Isolation and Culture of Pig Epiblast Stem Cells ............................................... 97
Aida Rodriguez, David A. Contreras, and Ramiro Alberio
9 Isolation and Culture of Bovine Embryonic Stem Cells ..................................... 111
Shanbo Cao, Fang Wang, and Lin Liu
10 Analysis of Molecular Markers for Staging Peri- gastrulating
Bovine Embryos ................................................................................................. 125
Isabelle Hue, Severine A. Degrelle, and Christoph Viebahn
11 Chicken Embryonic Stem Cells: Establishment and Characterization ................. 137
Pauline Aubel and Bertrand Pain
12 Manipulating the Avian Epiblast and Epiblast-Derived Stem Cells ..................... 151
Cantas Alev, Mikiharu Nakano, Yuping Wu, Hiroyuki Horiuchi,
and Guojun Sheng

viii
13 Stepwise Differentiation from Naïve State Pluripotent Stem Cells
to Functional Primordial Germ Cells Through an Epiblast-Like State ................ 175
Katsuhiko Hayashi and Mitinori Saitou
14 Isolation and Culture of Porcine Neural Progenitor Cells
from Embryos and Pluripotent Stem Cells ........................................................ 185
Mikkel A. Rasmussen, Vanessa J. Hall, and Poul Hyttel
15 Derivation of Neural Precursors from Bovine Preimplantation Embryos ............ 199
Giovanna Lazzari, Silvia Colleoni, and Cesare Galli
Index ............................................................................................................................... 209
Contents

RAMIRO ALBERIO • Division of Animal Sciences ,  School of Biosciences, University of
Nottingham   ,  Loughborough ,  UK
C
ANTAS ALEV • Laboratory for Early Embryogenesis, RIKEN Center for Developmental
Biology   ,  Chuo-Ku, Kobe ,  Japan
P
AULINE AUBEL • Inserm, U846, Stem Cell and Brain Research Institute   ,  Bron ,  France   ;
   Université de Lyon   ,  Lyon ,  France
S
IQIN BAO • Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of
Cambridge   ,  Cambridge ,  UK
E
SMAIL BEHBOODI • Department of Comparative Biology and Experimental Medicine,
Faculty of Veterinary Medicine ,  University of Calgary   ,  Calgary ,  AB ,  Canada
D
EAN H. B ETTS • Department of Physiology and Pharmacology ,  Schulich School of Medicine
and Dentistry, University of Western Ontario   ,  London ,  ON ,  Canada   ;    Children’s Health
Research Institute, Lawson Health Research Institute   ,  London ,  ON ,  Canada
A
LLA BONDAREVA • Department of Comparative Biology and Experimental Medicine,
Faculty of Veterinary Medicine ,  University of Calgary   ,  Calgary ,  AB ,  Canada
C
OURTNEY R. B ROOKS • Department of Physiology and Pharmacology ,  Schulich School of
Medicine and Dentistry, University of Western Ontario   ,  London ,  ON ,  Canada
S
HANBO CAO • The Third Afﬁ liated Hospital of Guangzhou Medical University   ,
Guangzhou ,  China
S
ILVIA COLLEONI • Avantea, Laboratory of Reproductive Technologies   ,  Cremona ,  Italy
D
AVID A. C ONTRERAS • Division of Animal Sciences ,  School of Biosciences, University of
Nottingham   ,  Loughborough ,  UK
S
EVERINE A. D EGRELLE • INRA, UMR1198 Biologie du Développement et Reproduction   ,
Jouy-en-Josas ,  France   ;    ENVA   ,  Maisons Alfort ,  France   ;    Department of Immunology ,
INSERM, Institut Cochin   ,  Paris ,  France
S
HENG DING • Department of Pharmaceutical Chemistry ,  Gladstone Institute of
Cardiovascular Disease, University of California   ,  San Francisco ,  CA ,  USA
I
NA DOBRINSKI • Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty
of Veterinary Medicine ,  University of Calgary   ,  Calgary ,  AB ,  Canada
D
ANIEL C. F ACTOR • Department of Genetics and Genome Sciences ,  Case Western Reserve
University School of Medicine   ,  Cleveland ,  OH ,  USA
C
ESARE GALLI • Avantea, Laboratory of Reproductive Technologies   ,  Cremona ,  Italy   ;
   Department of Veterinary Medical Sciences ,  University of Bologna   ,  Bologna ,  Italy   ;
   Fondazione Avantea   ,  Cremona ,  Italy
W
ILLIAM G. G AVIN • rEVO Biologics   ,  Framingham ,  MA ,  USA
A
STRID GILLICH • Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of
Cambridge   ,  Cambridge ,  UK
V
ANESSA J. H ALL • Department of Veterinary Clinical and Animal Sciences, Faculty of
Health and Medical Sciences ,  University of Copenhagen   ,  Frederiksberg C ,  Denmark
Contributors

x
KATSUHIKO HAYASHI • Department of Anatomy and Cell Biology, Graduate School of
Medicine, Kyoto University   ,  Kyoto ,  Japan
A
RATA HONDA • OPTT, University of Miyazaki   ,  Miyazaki ,  Japan   ;    RIKEN BioResource
Center   ,  Ibaraki ,  Japan   ;    Japan Science and Technology Agency   ,  Saitama ,  Japan
H
IROYUKI HORIUCHI • Laboratory for Immunobiology, Department of Molecular
and Applied Bioscience ,  Hiroshima University   ,  Higashi-Hiroshima ,  Japan
I
SABELLE HUE • UMR Biologie du Développement et Reproduction, INRA   ,  Jouy-en-Josas ,
France
P
OUL HYTTEL • Department of Veterinary Clinical and Animal Sciences, Faculty of Health
and Medical Sciences ,  University of Copenhagen   ,  Frederiksberg C ,  Denmark
L
OUISE LAM • Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of
Veterinary Medicine ,  University of Calgary   ,  Calgary ,  AB ,  Canada
G
IOVANNA LAZZARI • Avantea, Laboratory of Reproductive Technologies   ,  Cremona ,  Italy   ;
   Fondazione Avantea   ,  Cremona ,  Italy
W
ENLIN LI • Department of Cell Biology ,  Second Military Medical University   ,
Shanghai ,  China
L
IN LIU • College of Life Sciences ,  Nankai University   ,  Tianjin ,  China
F
ADI J. N AJM • Department of Genetics and Genome Sciences, Case Western Reserve ,
University School of Medicine   ,  Cleveland ,  OH ,  USA
M
IKIHARU NAKANO • Laboratory for Immunobiology, Department of Molecular
and Applied Bioscience ,  Hiroshima University   ,  Higashi-Hiroshima ,  Japan
M
ARK B. N OTTLE • Reproductive Biotechnology Group, School of Paediatrics and
Reproductive Health and Centre for Stem Cell Research ,  Robinson Institute,
The University of Adelaide   ,  Adelaide ,  SA ,  Australia
B
ERTRAND PAIN • U846 INSERM, USC7367 INRA, Stem Cell and Brain Research
Institute   ,  Bron ,  France   ;    Université de Lyon, UMR S   ,  Lyon ,  France
A
IDA RODRIGUEZ • Division of Animal Sciences ,  School of Biosciences, University of
Nottingham   ,  Loughborough ,  UK
M
IKKEL A. R ASMUSSEN • Department of Veterinary Clinical and Animal Sciences,
Faculty of Health and Medical Sciences ,  University of Copenhagen   ,  Frederiksberg C ,
Denmark
M
ITINORI SAITOU • Department of Anatomy and Cell biology, Graduate School of Medicine,
Kyoto University   ,  Kyoto ,  Japan
G
UOJUN SHENG • Laboratory for Early Embryogenesis, RIKEN Center for Developmental
Biology   ,  Chuo-Ku, Kobe, Hyogo ,  Japan
M. A
ZIM SURANI • Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, University of
Cambridge   ,  Cambridge ,  UK
J
ONATHAN H. T EICHROEB • Department of Physiology and Pharmacology ,  Schulich School of
Medicine and Dentistry, University of Western Ontario   ,  London ,  ON ,  Canada   ;
   Children’s Health Research Institute, Lawson Health Research Institute   ,  London ,
ON ,  Canada
P
AUL J. T ESAR • Department of Genetics and Genome Sciences ,  Case Western Reserve
University School of Medicine   ,  Cleveland ,  OH ,  USA   ;    Department of Neurosciences ,
Case Western Reserve University School of Medicine   ,  Cleveland ,  OH ,  USA
I
AN C. T OBIAS • Department of Physiology and Pharmacology ,  Schulich School of Medicine
and Dentistry, University of Western Ontario   ,  London ,  ON ,  Canada
Contributors

xi
IVAN VASSILIEV • Reproductive Biotechnology Group ,  School of Paediatrics and Reproductive
Health and Centre for Stem Cell Research, Robinson Institute, The University of
Adelaide   ,  Adelaide ,  SA ,  Australia
C
HRISTOPH VIEBAHN • Department of Anatomy and Embryology, Centre of Anatomy ,
University of Göttingen   ,  Göttingen ,  Germany
F
ANG WANG • State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology ,  College of Life Sciences,
Nankai University   ,  Tianjin ,  China   ;    Department of Cell Biology and Genetics ,  College of
Life Sciences, Nankai University   ,  Tianjin ,  China
Y
UPING WU • Laboratory for Early Embryogenesis, RIKEN Center for Developmental
Biology   ,  Chuo-Ku, Kobe, Hyogo ,  Japan
Contributors

1
Ramiro Alberio (ed.), Epiblast Stem Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1074,
DOI 10.1007/978-1-62703-628-3_1, © Springer Science+Business Media New York 2013
Chapter 1
Generation and Characterization of Epiblast
Stem Cells from Blastocyst-Stage Mouse Embryos
Daniel C. Factor , Fadi J. Najm , and Paul J. Tesar
Abstract
   Mouse epiblast stem cells (EpiSCs) are pluripotent embryonic cells that can be used to interrogate
developmental transitions that occur during gastrulation. EpiSCs can also be robustly differentiated into
functional somatic and germ cell derivatives making them a useful tool for studying development and
regenerative medicine. Typically, mouse EpiSCs are isolated from the early postimplantation epiblast
around 5.5 days post coitum (dpc). This chapter describes the methods for isolation of mouse EpiSCs from
preimplantation blastocyst−stage mouse embryos (3.5 dpc). This technique enables the routine ability to
derive EpiSC lines as it is much less labor intensive than isolation of EpiSCs from the postimplantation
epiblast. We also detail relevant assays used to characterize new EpiSC lines and distinguish them from
mouse embryonic stem cells.
Key words     Epiblast  ,   Pluripotency  ,   Stem cell  ,   Immunostaining  ,   RNA−seq  ,   Differentiation
1 Introduction
Pluripotent stem cells are widely utilized to study development and
disease [ 1 ]. These cells can be expanded in the laboratory indeﬁ −
nitely while retaining the unique capacity to form any cell type of
the body. Genetically normal pluripotent stem cells have been
derived in vitro from multiple sources including (1) preimplanta−
tion embryos, (2) early postimplantation epiblast, (3) germ cells,
and (4) mature somatic cells after exogenous modulation of gene
expression (most typically by induction of Oct4, Sox2, Klf4, and
c−myc) [ 2 – 12 ]. However, it is clear that not all pluripotent stem cell
lines are equivalent. In fact, recent work has shown that irrespective
of their origin, pluripotent stem cells can exist in one of the two
developmental states referred to as “naïve” and “primed” [ 13 ].
Each pluripotent state provides unique properties that can be
harnessed in the laboratory. Naïve pluripotent cells, typiﬁ ed by
mouse embryonic stem cells (mESCs) and mouse induced plu−
ripotent stem cells (iPSCs), have the advantage of being readily

2
amenable to genetic engineering by homologous recombination,
contributing efﬁ ciently to all somatic and germ cell derivatives in
chimeras, and being easily passaged by single−cell dissociation.
Primed pluripotent cells such as mouse EpiSCs, human ESCs, and
human iPSCs directly recapitulate developmental signaling pro−
cesses that function during gastrulation. While naïve mouse plu−
ripotent stem cells can be readily derived, isolation of primed
mouse EpiSCs is a laborious process requiring isolation and man−
ual dissection of the early postimplantation mouse embryo. We
have recently shown that mouse EpiSCs can also be isolated from
preimplantation blastocyst−stage embryos [ 12 ]. As blastocysts can
be readily isolated, this technique should greatly enhance the abil−
ity of laboratories to derive their own mouse EpiSC lines in−house.
This chapter provides detailed instructions for this procedure.
2 Materials
       1.    Timed−pregnant female mouse at 3.5 days post coitum (dpc)
( see   Note 1 ).
   2.    Dissection scissors and forceps.
   3.    PBS: Phosphate−buffered saline without calcium and magne−
sium. PBS is stored at room temperature.
   4.    Dissection medium: FHM Hepes−buffered medium
(Millipore). Dissection medium is stored in aliquots at −20 °C
for up to 6 months. Once thawed, dissection medium can be
used for up to 2 weeks.
   5.    26−Gauge needle with 2 ml syringe ( see   Note 2 ).
      1.    Nunc culture plates with the Nunclon Δ−treated surface
(24−well).
   2.    Irradiated MEFs (iMEFs) can be purchased or derived in−
house [ 14 ].
   3.    MEF culture medium: Dulbecco’s modiﬁ ed Eagle medium
supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS), 2 mM glu−
tamax, 1× nonessential amino acids, and 0.1 mM
2− mercaptoethanol. Media components are combined and ﬁ l−
tered through a 0.22 μm polyethersulfone ﬁ ltration unit and
stored at 4 °C for up to 4 weeks.
   4.    K15F5 culture medium: Knockout DMEM supplemented
with 15 % knockout serum replacement (KSR), 5 % ES
cell−qualiﬁ ed FBS, 2 mM glutamax, 1× nonessential amino
acids, and 0.1 mM 2−mercaptoethanol. Media components are
combined and ﬁ ltered through a 0.22 μm polyethersulfone
ﬁ ltration unit and stored at 4 °C for up to 2 weeks.
   5.    Finely pulled glass pipette.
   6.    0.25 % Trypsin–EDTA for blastocyst dissociation.
2.1 Preimplantation
EpiSC Isolation
2.1.1 Harvesting
the Blastocyst
2.1.2 Blastocyst
Outgrowth
Daniel C. Factor et al.

3
     1.     EpiSC culture medium: Knockout DMEM supplemented with
20 % KSR, 2 mM glutamax, 1× nonessential amino acids, and
0.1 mM 2−mercaptoethanol. Media components are combined
and ﬁ ltered through a 0.22 μm polyethersulfone ﬁ ltration unit
and stored at 4 °C for up to 2 weeks. Recombinant human
FGF2 (10 ng/ml) and activin A (5 ng/ml) are freshly added
to the media before use. FGF2 is dissolved in 0.1 % bovine
serum albumin fraction V in PBS to a concentration of 10 ng/μl.
FGF2 aliquots are stored at −80 °C and used within 6 months.
Once thawed, FGF2 aliquots are stored at 4 °C and used
within 2 weeks. Activin A is dissolved in 0.1 % bovine serum
albumin fraction V in PBS to a concentration of 50 ng/μl,
stored at −80 °C, and used within 6 months. Aliquots are
thawed and diluted to 5 ng/μl in 0.1 % bovine serum albumin
fraction V in PBS, stored at 4 °C, and used within 2 weeks.
   2.     Pulled glass pipette or 30−gauge needle.

      1.     EpiSC passaging medium: 1.5 mg/ml collagenase type IV dis−
solved in EpiSC culture medium (without FGF2 or activin A)
and ﬁ lter sterilized with a 50 ml steriﬂ ip (Millipore). EpiSC
passaging medium is stored at 4 °C and used within 2 weeks.
   2.     96−Well round−bottom plate.
     1.     2× Freezing medium: 60 % Knockout DMEM, 20 % DMSO,
and 20 % FBS. Filter sterilize the solution with a 0.22 μm
syringe ﬁ lter. Excess 2× freezing medium can be stored at 4 °C
and used for up to 1 week.
   2.     1.8 ml Cryotubes.
   3.     Cryo−freezing container: Nalgene “Mr. Frosty.” Container is
ﬁ lled with 250 ml of isopropanol and changed after four uses.
Store at room temperature between uses.
     1.     9.5 ml of EpiSC culture medium (without FGF2 or activin A)
warmed in 37 °C water bath.
   2.     5 ml of EpiSC culture medium with 10 ng/ml FGF2 and
5 ng/ml activin A, warmed in 37 °C water bath.

      1.     4 % Paraformaldehyde in PBS: In fume hood combine 10 ml
of 16 % paraformaldehyde solution, 4 ml 10× PBS, and 26 ml
of sterile water. Store in 4 °C for up to 10 days.
   2.     0.2 % Triton−X in PBS: While stirring 500 ml PBS solution
with a magnetic stir bar, slowly add 1 ml Triton−X solution.
Stir gently for an extra 1 h. Store at room temperature. Solution
is good for up to 1 year.
   3.     Blocking solution: Dilute 1 ml of donkey serum with 9 ml PBS
solution and ﬁ lter through a 0.22 μm Millex−GV ﬁ lter attached
to a Monoject luer lock syringe (Kendall). Store at 4 °C for up to
10 days.
2.1.3 Picking EpiSCs
2.2 Expansion
of EpiSCs
2.2.1 Routine Culture
of EpiSCs
2.2.2 Freezing EpiSCs
2.2.3 Thawing EpiSCs
2.3 Characterization
of EpiSCs
2.3.1 Immunostaining
of Pluripotency Markers
Pre-Implantation EpiSCs

4
   4.     Primary antibodies: Oct4 (Santa Cruz, SC−5279; 200 μg/ml)
and Sox2 (R&D Systems, AF2018; 200 μg/ml). Oct4 anti−
body is stored at 4 °C and good for over a year. Sox2 aliquots
are stored at −80 °C and good for 1 year. Once thawed,  aliquots
are kept for 1 month.
   5.     Secondary antibodies: Donkey anti−mouse 488 (Invitrogen,
A21202) and donkey anti−goat 555 (Invitrogen, A21432).
   6.     DAPI stock solution: Add 1 ml water to 1 mg DAPI powder.
Store at 4 °C and is good for over a year.
     1.     1.7 ml RNase−free microcentrifuge tubes.
   2.     Trizol is aliquoted to prevent contamination and stored at 4 °C.
   3.     Phase lock gel tubes.
   4.     Chloroform.
   5.     Qiagen RNeasy Plus Micro Kit.
   6.     70 % ethanol prepared with RNase−free water: Add 35 ml 200
proof ethanol to 15 ml nuclease−free water. Store at −20 °C so
that solution is prechilled for RNA extraction procedure.
   7.     Illumina Truseq RNA Sample Preparation Kit.
     1.     SB431542 is prepared in DMSO at a stock concentration of
20 mM. Aliquots are stored at −80 °C and good for 6 months.
Tubes are freeze−thawed a maximum of three times.
   2.     Noggin is prepared in 0.1 % bovine serum albumin fraction V
in PBS at 100 ng/μl. Aliquots are stored at −80 °C and good
for 6 months. Tubes are thawed and stored at 4 °C and used
within 2 weeks.
   3.     Dorsomorphin is prepared in DMSO solution at 10 mM.
Aliquots are stored at 4 °C and good for 6 months.
   4.     Neural culture media: DMEM/F12 with 1× N2 Max supple−
ment, 1× B−27 without vitamin A, and 2 mM glutamax. Media
components are combined and ﬁ ltered through a 0.22 μm poly−
ethersulfone ﬁ ltration unit and stored at 4 °C for up to 2 weeks.
3 Methods
      1.     Euthanize female mouse at 3.5 dpc according to local animal
care requirements.
   2.     Cut open abdominal cavity, dissect out the uterus, and transfer
to a 100 mm petri dish ﬁ lled with PBS. Cut away excess fat and
connective tissue from the uterus.
   3.     Transfer the uterus to a 35 mm petri dish ﬁ lled with dissection
medium.
   4.     With a 26−gauge needle ﬂ ush out each horn toward the cervix
to release blastocysts into the culture dish.
2.3.2 Global Gene
Expression Analysis
by RNA Sequencing
2.3.3 Differentiation
to Neuroectoderm
3.1 Isolation and
Maintenance of
Preimplantation
Epiblast
3.1.1 Isolation of 3.5 dpc
Preimplantation Mouse
Embryos
Daniel C. Factor et al.

5
      1.    Using a stereomicroscope collect blastocysts and plate each
into an individual 24−well containing iMEFs prepared the pre−
vious day ( see   Note 3 ). Primary blastocysts are grown in K15F5
culture medium.
   2.    Incubate blastocysts in standard tissue culture incubator for
5–6 days for the blastocyst outgrowth to form. Do not disturb
or change the medium.
   3.    With a ﬁ nely pulled glass pipette, dislodge the blastocyst out−
growth off the plate and place into 10 μl of 0.25 % trypsin–
EDTA for 5 min in an individual well of a round−bottom
96−well plate.
   4.    Partially dissociate the blastocyst with a 10 μl pipette, being
sure not to produce a single−cell suspension.
   5.    In K15F5 culture medium, plate each partial dissociate into an
individual 24−well containing iMEFs prepared the previous day.
   6.    Incubate in tissue culture incubator for 6 days. Medium can be
changed on the third day.
   7.    Passage each well on day 6: Rinse each 24−well with PBS ( see
Note 4 ) and add 250 μl 0.25 % trypsin–EDTA for 2–3 min.
   8.    Inactivate trypsin–EDTA with 250 μl of MEF culture media
and gently triturate the cells being careful not to produce a
single−cell suspension.
   9.    Transfer each well of cells to an individual 6−well with 2.5 ml
EpiSC culture medium containing iMEFs prepared the previ−
ous day.
   10.    Incubate in tissue culture incubator for 4–8 days. During this
time morphologically distinct mESC and EpiSC colonies
become evident (Fig.  1a ). A representative mESC colony can
be seen in Fig.  1b  and a representative EpiSC colony in Fig.  1c .
             1.    Rinse a 24−well containing iMEFs prepared the previous day
with PBS. Add 1 ml EpiSC culture medium and place back
into the incubator to equilibrate.
   2.    Under a stereomicroscope in a sterile hood, use a glass pipette
or a 30−gauge needle to score individual EpiSC colonies into
4–6 equally sized pieces.
   3.    Transfer the pieces to the 24−well with EpiSC culture medium.
Culture for 2–3 days changing the medium daily.
   4.    Under optimal conditions, you can expect 25–40 % of blasto−
cysts to yield an EpiSC line.
          1.    After the ﬁ rst passage, EpiSCs can be passaged enzymatically.
To passage, remove EpiSC culture medium from each well,
add EpiSC passaging medium (250 μl for a 24−well or 1 ml for
a 6−well), and incubate at 37 °C for 8–12 min.
3.1.2 Blastocyst
Outgrowth
3.1.3 Picking EpiSCs
3.2 EpiSC Culture
3.2.1 Routine Passaging
of EpiSCs
Pre-Implantation EpiSCs

6
Fig. 1 Distinct pluripotent stem cell states can be derived from cultured mouse blastocysts. ( a ) After 16 days of
culture, characteristic ﬂ at (EpiSC-like) or domed (mESC-like) colonies begin to emerge. ( b ) Morphology of mouse
embryonic stem cell colonies with the characteristic domed shape. ( c ) Morphology of a blastocyst- derived epi-
blast stem cell colony with the ﬂ at, epithelial characteristics. Representative immunostaining of pluripotency
marker Oct4 in an embryonic stem cell colony ( d ) and a preimplantation epiblast stem cell colony ( e )
2. Add equivalent volume of EpiSC culture medium to each well
and dislodge colonies away from iMEFs by gentle pipetting
with a 5−ml pipette. Combine colony suspensions from each
plate into a 15−ml conical tube.

Daniel C. Factor et al.

7
   3.    Separate colonies away from any remaining MEFs by centrifu−
gation at 200 ×  g  for 30–40 s. The colonies will loosely pellet at
the bottom of the tube while the individual MEFs will remain
in the supernatant.
   4.    Aspirate the supernatant and discard. Gently resuspend the
colony pellet in 5 ml EpiSC culture medium (FGF2 and activin
are omitted from EpiSC culture medium when used for rins−
ing) and perform another 30–40−s spin. Repeat rinse/spin
cycle one more time for a total of three.
   5.    Resuspend colonies in 100 μl of EpiSC culture medium and
transfer to an individual well of a 96−well round−bottom plate.
   6.    Triturate colonies with a P100 pipette set at 80 ml until only
small clusters remain ( see   Note 5 ).
   7.    Add triturated suspension to pre−warmed EpiSC culture
medium and plate 2.5 ml per 6−well with iMEFs. EpiSCs are
typically split 1:4–1:6 every 2–3 days. The density at which
each EpiSC line is grown is very important and must be deter−
mined empirically. We continuously culture EpiSCs in 6−wells.
   8.    EpiSC culture medium is changed daily.
      1.    Isolate colonies of EpiSCs free from MEFs as described in
Subheading  3.2.1 .
   2.    Triturate into small clusters just slightly larger than for passag−
ing and spin down at 200 ×  g  for 4 min.
   3.    Resuspend pellet in MEF culture medium at a concentration
of 0.5 ml for every 35 mm well being frozen. Add an equal
volume of 2× freezing medium, mix gently by inverting the
tube, and distribute 0.5 ml of cell suspension into individual
cryotubes (ﬁ nal volume of 0.5 well/vial). Place tubes in a
room− temperature cryo−freezing container and immediately
place at −80 °C. The following day, transfer vials to a liquid
nitrogen freezer for permanent storage.
      1.    Remove vial from liquid nitrogen storage and thaw in 37 °C
water bath until only a small ice crystal remains. Rinse vial with
1 ml of MEF culture medium and combine with 8.5 ml MEF
culture medium in 15 ml conical (total of 10 ml). Spin down
at 200 ×  g  for 4 min, aspirate supernatant, and gently resuspend
pellet in 5 ml of pre−warmed EpiSC culture medium. Remove
MEF culture medium from iMEFs that were seeded the prior
day, rinse with PBS, and aliquot the suspension equally into
two 35 mm wells. Place in tissue culture incubator.
   2.    If recovery is adequate, colonies are ready to passage in 2–3 days.
3.2.2 Cryopreservation
of EpiSCs
3.2.3 Thawing of EpiSCs
Pre-Implantation EpiSCs

8
       1.    Aspirate cell culture medium from the cells and add 4 %
paraformaldehyde in PBS to ﬁ x cells. Store the plate on a
rocker for 15 min.
   2.    Aspirate the ﬁ xative and rinse 3× with PBS. Aspirate PBS, and
then add 0.2 % Triton−X in PBS for 5 min while rocking.
Repeat the Triton−X step for another 5 min.
   3.    Aspirate Triton−X solution, and then add 10 % donkey serum
diluted in PBS for 2 h rocking at room temperature ( see
Note 6 ).
   4.    Add primary antibodies Oct4 (1:500) and Sox2 (1:100)
diluted in blocking solution for 1 h rocking at room tempera−
ture or overnight at 4 °C.
   5.    Aspirate antibody solution, wash once with PBS, then add
PBS, and incubate for 5 min while rocking. Repeat this step
two more times.
   6.    Add secondary antibodies donkey anti−mouse (1:500) and
donkey anti−goat (1:500) diluted in blocking solution for 1 hr
rocking at room temperature. Keep the plate protected from
light from this point onward by wrapping in aluminum foil.
   7.    Aspirate, wash once with PBS, then add PBS, and incubate for
5 min while rocking. Repeat this step two more times.
   8.    Incubate in 1 μg/ml DAPI solution in PBS (dilute DAPI stock
solution 1:1,000) for 5 min with rocking.
   9.    Rinse with PBS and incubate for 5 min. Repeat this step. Never
let the wells dry out.
   10.    Cells are ready for visualization. Plates can be stored at 4 °C for
over 3 months as long as they are sealed with paraﬁ lm and cov−
ered in foil. EpiSC cell lines will be uniformly positive for Oct4
(Fig.  1d ) and Sox2 with only rare spontaneously differentiated
colonies being negative for these markers ( see   Note 7 ).
      1.    Harvest EpiSCs from MEFs as described in Subheading  3.2.1 ,
steps 1 – 4 .
   2.    Transfer ~1 × 10
6
  cells to a 1.5 ml RNase−free microcentrifuge
tube and centrifuge the sample at 200 ×  g  for 4 min.
   3.    Carefully remove the supernatant and resuspend the sample in
0.5 ml Trizol. Samples may be processed immediately, or
placed at −80 °C for long−term storage.
   4.    Prepare a phase lock gel tube for each sample, by spinning
down at maximum speed for 3 min.
   5.    Add 0.5 ml Trizol to each sample (to bring the total volume to
1 ml) and transfer to the phase lock tubes.
   6.    Add 0.2 ml chloroform to each sample and shake vigorously
for 15–20 s.
3.3 Characterization
of EpiSCs
3.3.1 Immunostaining
of Pluripotency Markers
3.3.2 Global Gene
Expression Analysis
by RNA Sequencing
(See Note 8 )
Daniel C. Factor et al.

Other documents randomly have
different content

väestön lakkaamatta jaloilleen, ja kun Martti Salander ei lyönyt
laimin mitään näistä velvollisuuksistaan, näki hän huomaamattaan
joutuneensa virran keskelle. Paremmin oppiakseen kävi hän
valtiollisissa kokouksissa, alkoi ottaa keskusteluihin osaa ja tehdä
ehdotuksia, ja kun hänen riippumattomuutensa oli tunnettu ja sen
vuoksi tiedettiin, ettei hän omia etujaan tavotellut, valittiin hänet
kaikenlaisiin valiokuntiin, joiden tehtäviin hän kiitettävällä innolla
antausi, vaikkakin niihin kuului maaseuduilla kierteleminen eikä hän
ollut sellaiseen tottunut.
Tällä laajalla uralla joutui hän välittömään kansanjohtoon eli
jonkinmoiseen näkymättömissä toimivaan hallitukseen, joka
kiertäväin opettajain muodossa johti kansaa ja selitti sille sen
itsehallinnon vaikeampia seikkoja.
Tosin oli asioita, jotka eivät hänelle itselleenkään olleet selvillä,
jonka vuoksi hänen edeltäkäsin täytyi niihin kiiruusti tutustua tai
puolustaa painettuja asiakirjoja kuulijain hyvään uskoon luottaen. Ei
hän sentään antanut itseensä nähden sellaista usein tapahtua, jota
vastoin hän sitä toisissa enemmänkin huomasi. Toisinaan oli hänet
vallata synkkä aavistus, että nuo ylempiin, keskus- ja alempiin
virastoihin pyrkivät henkilöt olisivat entisestään ylipäätään hiukan
huonontuneet ja että nämä vaikutukset siirtyivät toisesta ryhmästä
toiseen.
Mutta pian hän jälleen rohkaisi itsensä, luottaen tuohon kansan
muodostamaan terveeseen ja hyötyisään maaperään, josta kyllä
kasvaisi yhä uusi, korkea ja solakka laiho. Ja hän lupasi sitten,
vaikkei hän enää ollutkaan mikään nuorukainen, pitää itseensä
nähden sen varan, ettei hän koskaan tahallaan antautuisi halvaksi

virantavoittelijaksi eikä puolestaan auttaisi tuota puheenalaista
huonontumista.
Mutta uskollisena tuolle kunnioitettavalle päätökselleen joutui hän
kerran vielä kokemaan samanlaista harmia kuin silloin ensimäisellä
kävelyretkellä Brasiliasta paluunsa jälkeen. Sunnuntaina kuten
silloinkin oli hän kerta kotipaikkakunnallaan saapuvilla muutamassa
kokouksessa, jossa keskusteltiin eräästä elinkeinokysymyksestä,
mikä on sama kaikissa sivistysvaltioissa ja osakseen saa samanlaisen
puolueettoman ja puhtaasti asiallisen käsittelyn. Mutta täällä oli
kysymyksessä muuan ei ainoastaan eriskummallinen vaan kokonaan
mieletön laitos, joka oli siinnyt muutaman yksityisen päässä ja
saanut paikkakunnalla osakseen jonkunverran mieltymystä. Martti
Salanderin tuli ystäväinsä kanssa tekemänsä sopimuksen mukaan
esiintyä asian vastustajana. Ensin kuunteli hän ehdotuksen
perustelua sekä edelleen joukon puheita, joissa kouliintumattomat,
paraastaan nuoremmat miehet perusteellisten syiden sijasta yhä vain
toistelivat ja kirkuivat sanoja: tasavalta, tasavaltainen,
tasavaltalaisenarvo j.n.e. Sellainen tasavaltanimen paukuttaminen
jokaisessa sopivassa ja sopimattomassa tilaisuudessa oli häntä jo
kauan suututtanut, vallankin kun hän itse isänmaahansa nähden oli
rehellinen tasavaltalainen. Kun hän nyt otti sananvuoron, tunsi hän
itsessään pakoitusta pitää sen johdosta puhe, vallankin kun
läsnäolijat näyttivät hyvin tarvitsevan sellaista hyvää tarkoittavaa
läksytystä.
"Hyvät kansalaiset!" aloitti hän mahdollisimman tyynesti,
"ennenkuin esitän eroavat mielipiteeni tästä esillä olevasta asiasta,
en voi olla kajoamatta tuohon minullekin kalliiseen sanaan tasavalta,
jonka me tunnin kuluessa olemme varmaankin kolmattakymmentä
kertaa kuulleet. Esi-isämme ovat pian kuusisataa vuotta sitten

kuumissa taisteluissa perustaneet ja lujittaneet tämän tasavallan,
koskaan silti suuhunsa ottamatta tuota sanaa, eivätkä vanhat liitto-
ja maakirjatkaan siitä tiedä. Vasta myöhemmin ovat hallitsevien
kaupunkien ylimykset ja porvarit sen itselleen ottaneet, antaakseen
tuolla kauniilla sanalla antiikkisen loisteen maalliselle herruudelleen.
Meillä on se nyt kielessämme, mutta ei väärinkäytöstä varten.
Minusta melkein tuntuu, että se joka sitä aina suussaan pitää ja
samalla rintoihinsa lyö, on ulkokultaisuuteen yhtä syyllinen kuin mikä
fariseus tai tekopyhä tahansa! Kuitenkaan meillä ei nyt ole tämän
asian kanssa tekemistä; ainoastaan siitä tahtoisin huomauttaa,
arvoisat kansalaiset, että tasavaltalaisenkin täytyy ansaita kaikki
tarpeensa ja ettei hänkään voi niitä pelkillä sanoilla lunastaa;
luonnonlaeista ei tasavalta pysty äänestämään, kaitselmus
suunnittelee maamiehelle hyödylliset vuodenaikojen säät yhtä hyvin
tasavallalle sen hyväksymisestä tai hylkäämisestä huolimatta kuin
kuningastenkin alammaisille ja itse kuninkaillekin, eikä maailmanliike
piittaa niiden maiden eikä maanosien hallitusmuodosta, joiden läpi
se kohisten ryntää. Tätä minä tahdoin huomauttaa, ennenkuin siirryn
mielipiteitäni paljastamaan ja käyn tätä kysymystä asiallisemmin
käsittelemään kuin mitä tähän saakka on ollut laita."
Tuo odottamaton saarna ei tehnyt hyvää. Jo ennemmin oli
kuulunut murinaa ja nyt keskeytti muuan puhujan sekä vaati
sananvuoroa: Näytti muka taasenkin olevan kiiru taantumukseen!
Tuskin oli muuan vuosi kulunut, niin ei eräs oman paikkakunnan
lapsi, eräs entinen kansakoululaitoksen jäsen, herra Martti Salander,
joka nyt tosin riippuu kultaisessa ketjussa, voinut enää sietää sanaa
tasavalta! Älköön asiain niin ollen muka vaadittako niitä, jotka tuota
nimeä vielä tunnustavat, vakavassa kansankokouksessa
kuuntelemaan sille vihamielisiä puheita. Jos muutoin joku haluaisi

vielä puhua, niin ehdotettaisiin keskustelun lopettamista sekä
äänestystä.
Salander, joka oli jäänyt seisomaan, tahtoi korotetulla äänellä
jatkaa. Jotkut, jotka eivät olleet asiasta viisastuneet, kannattivat
häntä, toiset, joille hänen puheensa sisältö oli niinikään ollut liian
vaikeatajuinen, mutta joista se näytti halveksivalta, melusivat
vastaan; syntyi sekamelska, jossa voitolle pääsivät ne, jotka hänet
hyvin ymmärsivät, kuten Martti arveli, mutta jotka juuri olivat
vihoissaan siitä, mitä hän oli tarkoittanut ja jotka eivät tahtoneet sitä
sietää.
Häneltä riistettiin suunvuoro, vasta-ehdotusta ei tehty ja
kysymyksessä oleva asia julistettiin päätetyksi. Tosin se sitten
perästäpäin laajemman käsittelyn alaisena ollessaan hyljättiin. Martti
Salander sitävastoin oli tänään tullut yhtä kokemusta rikkaammaksi.
Hän jätti talon ja tuon arvoisan kylän ketään enää näkemättä ja
huolimatta käyttää rautatietä, jolla hän oli tullut, lähti hän
jalkapatikassa astelemaan muuatta polkua, joka suoraa niittyjen ja
metsien halki vei Münsterburgiin.
Näin yksin kävellessään saattoi hän miettiä, missä määrin ei
ainoastaan ylemmille valtiomiehille, vaan myöskin kansanmiehille oli
tarkoituksenmukaista sortaa ihmisten siveellistä, avomielisyyttä.
Kuitenkin kaikitenkin, ajatteli hän, olen minä iloinen, että tulin sen
sanoneeksi! Jotakin siitä sentään voi seurata; ja jos he oman
mielensä mukaan kirjoittavat minusta sanomalehtiin, niin sitten minä
vasta äänekkäästi tahdonkin saarnata, ettei tasavallan nimi ole
mikään kivi, jota kansalle sopii leipänä tarjota.
Tuo kunnon päätös kirkasti hänen jonkun verran ärtynyttä
mieltään; reippain askelin kiipesi hän ylös niitä kukkuloita, jotka

hänet vielä eroittivat kaupungista, ja pitkä keskikesän päivä teki
hänelle mahdolliseksi ehtiä ennen auringonlaskua korkeimman
kukkulan laelle, jossa häntä odotti harvinainen yllätys. Eräällä vasta
niitetyllä, osaksi puiden ympäröimällä niityllä oli läheisen kartanon
isäntä pannut pikku huvit toimeen. Hän oli asettanut puiden varjoon
muutamia pitkiä pöytiä sekä niitylle suulleen käännetyn suuren
ammeen. Tämän päällä istui kolme vaatimatonta soittoniekkaa, jotka
vetelivät muuatta yksinkertaista tanssinsäveltä. Martti oli tuota
tyynen ilman halki melkein ikävöiden kaikuvaa soittoa jo hetkisen
kuunnellut; nyt huomasi hän joukon nuorta väkeä, jotka höllässä
piirissä ja vapaina ryhminä, ilman melua tanssivat ammeen ympärillä
illan kultaisessa rusotuksessa, niin että tanssijain pitentyneet varjot
keinuilivat mukana kullan vihreällä kentällä.
Salander ilostui tuosta näystä.
"Kas siinä kuva kuin toisesta maailmasta!" ajatteli hän, "kuinka
rauhallista ja perin hupaisaa! Mikähän seurue tämä mahtanee
ollakaan? Useimmat ovat hyvin puettuja, jotkut komeastikin, toiset
yksinkertaisemmin! Nuoria tyttöjä, nuoria poikia!"
Mutta kuinka hän hämmästyikään, kun lähemmäs astuessaan tunsi
omat tyttärensä, jotka nyt, kahdeksan- ja yhdeksäntoista vuotiaina,
solakoina ja somina siinä keinuilivat itseään nuorempain poikain
sivulla, jotka näyttivät yhtä somilta ja olivat jo yhtä pitkäkasvuiset
kuin tytötkin.
Salander ei voinut olla silmin seuraamatta ensimäistä paria, Nettiä
ja hänen poikaansa, sekä lähemmin tarkastelematta noita iloisen
reippaita tanssijoita. Se oli, kuten sanottu, solakan notkea
nuorukainen, jonka vaaleat ja aaltomaiset hiukset illan ruskotuksessa
hulmusivat ja kimmelsivät.

Silmäillessään parin jälkeen kadotti hän sen näkyvistään ja etsi sen
vuoksi toista tytärtään, Settiä, jonka hän myöskin oli etäämpää
huomannut. Ja samassapa tämä keinuikin esiin, mutta, kuten
hänestä tuntui, samallaisen pojan kanssa, sen saman kultakiharaisen
kuin Nettikin.
"Niillä velhottarilla on kauniit taipumukset!" vilahti hänen
mielessään, "nehän osaavat jo koko ovelasti poikia vaihtaa! Tuota
täytyy toki hitusen tarkastaa!"
Hän antoi parin mennä edelleen ja seurasi sitä tarkoin katseellaan,
jolla välin toisaalta tunkihe taas esiin Setti, rinnallaan yhä
samanlainen keruubi, jonka kylkeen hän tällä kertaa kiinteämmin
painausi, kun soitto samalla lakkasi.
"Oo, siinähän on isäkin! Oletko sinä etsinyt meitä ja saanut tietää,
että me olemme täällä?" huudahti tytär riemastuneena.
"Mistäpäs minä sen tiesin? Minä tulin tänne aivan sattumalta!
Mitkä huvit nämä on? Onko Settikin täällä?"
"On luonnollisesti, ja äitikin Arnoldin kanssa, he istuvat tuolla
erään pöydän ääressä! Kun sinä olit sanonut palaavasi kotiin
viimeisellä junalla kymmenen ajoissa, niin kehoitti hän meitä
lähtemään vuorelle."
Salander oli aikeissa kysyä hänen tanssitoveristaan, kuka se nuori
herra oikeastaan oli (joka juuri toista kertaa nosti hattuaan), kun
sisko toverinsa kera tuli paikalle, niin että hän näki molemmat nämä
rinnan seisomassa ja joutui yhä enemmän ihmeisiinsä.

"Nämä ovat Arnoldin koulutovereita, herrat Isidor ja Julian
Weidelich", selitti vanhempi tytär.
"Ahaa, niinkö?" sanoi Salander, voimatta heti muistaa kohtausta
Varpusen kaivolla, josta oli jo voinut kulua seitsemän tai kahdeksan
vuotta. "Myöskinkö gymnasiossa?"
"Mutta ei samalla luokalla, sillä me olemme vähän nuoremmat!"
sanoi
Julian; "me joudumme yksiin ainoastaan laulutunneilla!"
"Siis kaksoiset epäilemättä! Ja mistä kotoisin?"
"Me asumme Varpusessa, ei kaukana Kreuzhaldesta!"
Nyt häämötti Salanderin mielessä kuin joku muisto; hän oli
sielunsa silmillä näkemäisillään pari esiliinoilla varustettua pyöreää
pojanvekaraa, joista todellakaan noissa hänen edessään seisovissa
täyspitkissä nuorukaisissa ei ollut enää jälkeäkään huomattavissa.
"Ja kuinka voi äiti? Elääkö hän vielä?" kyseli hän edelleen.
"Hän on myöskin tuolla pöydässä ja on aivan terve!" kuului
vastaus.
"Sepä hauskaa! Ja te nuoret miehet haluatte myöskin opiskella? Ja
mitä, jos saa kysyä?"
"Sitä emme vielä tiedä! Ehkä lakitiedettä, toinen kenties
lääketiedettä!" sanoi Julian; Isidor lisäsi: "Me voisimme lukea
professoreiksikin, jos tahdomme, niille kun nykyään maksetaan niin
hyvät palkat, sanoo mamma; ainoastaan tulisi meidän pysyä täällä."

"Hyvä on!" vastasi herra Salander; "nyt tulee meidän toki katsella
missä äiti on! Tulkaa lapset!"
Tyttäret näyttivät hänelle tietä ja nuo lainkaan ujostelemattomat
nuorukaiset seurasivat heidän kantapäillään, samalla kuin
soittoniekat virittivät uuden tanssikappaleen.
Maria rouva oli hyvin iloinen, nähdessään odottamatta miehensä
edessään. Hän istui vihreiden puiden siimeksessä yksinkertaisen
porvarisväen seurassa, joka rauhallisesti virkistelihe siinä
yksinkertaisten nautintoaineiden, miedon mutta terveellisen viinin,
hyvänmakuisen maidon, talonpoikaisleivän ja silava- sekä
kaalikukkojen ääressä. Hänen rinnallaan istui rouva Amalia
Weidelich, yhtä pönäkkänä kuin konsanaan lipeäkattilan ääressä
seisoessaan. Ilmeisestikin menestyivät hänen asiansa oivallisesti,
sillä hän oli muhkeasti puettu, hänellä oli kirjavakukkainen hattu ja
kultakello, jonka pitkät ketjut riippuivat rinnoilla. Hänen leveät
kasvonsa loistivat vahvasti päivettyneinä, ja kevyt punoitus
poskipäissä, täyteläisessä leuassa ja nenässä todisti vain muorin
ahkeruudesta, muorin, jolla oli hallittavanaan talon täysi pesijättäriä
ja silittäjiä ja joille runsaasti tarjoamastaan viinistä hän, kuten
kohtuullistakin, otti itse etukäteen naukkuja.
Hän tervehti Martti Salanderia hyvin ystävällisesti ja perin vapaasti.
"Ajatelkaas", huudahti rouva Weidelich, "me emme ole lainkaan
tienneet, että me vuosia sitten olemme kerta olleet naapureina! Nyt
ne ovat meidän pojat koulussa!" Hän silmäsi ylpeydellä poikiaan ja
haki sitten katseellaan hyväntahtoisesti Salanderin poikaa.
"Arnold on mennyt metsään kasveja etsimään", huomautti
Salanderin rouva, "menkää tytöt kutsumaan häntä, jotta voisimme

paluumatkaakin ajatella. Aurinko tuolla laskeutuu pian!"
"Eihän nyt niin kiirutta", vastasi rouva Weidelich, "onhan meillä
miesväkeä tarpeeksi mukana! Niin, niin, herra Salander! Te olette
urheasti yrittänyt ja nyt olette rikas mies, kuten uskon! Mutta eikö
totta, että on ilahduttava asia, kun on hyviä lapsia, joiden hyväksi
rikkauttaan voi käyttää? Hyvin, Jumalan kiitos, ovat meidänkin
asiamme! Mutta kaiken ansiomme uhraamme me kahden poikamme
ja heidän tulevaisuutensa hyväksi. Minä toivon, että he korvaavat
sen ja tulevat niittämään kunniaa; sillä opetukseen ynnä muuhun
tarpeelliseen nähden ei saa mitään puuttua! Me olisimme Varpuseen
mielellämme rakentaneet uuden talon sen vanhan talonpoikaisrähjän
sijalle! Mutta ei! sanoimme me, kyllä se meidän aikamme välttää ja
sehän on vallan tietymätöntä, mihin pojat asettuvat asumaan ja
rakentelemaan. Niinpä säästämme mieluummin rahoja ja tulemme
niine hyvinemme toimeen!"
Hän yritti taas heittämään silmäyksen kaksosiinsa, mutta ei
löytänytkään heitä, jonka vuoksi hänen silmänsä heti alkoivat heitä
etsiä.
Molemmat Salanderin neidit eivät kauankaan etsineet metsästä
Arnold veljeään, vaan pari kertaa häntä huudettuaan palasivat he
etummaisten puiden siimekseen, missä he, kädet toistensa
vyötäisillä, sisarusrakkauden tai tytärystävyyden esikuvina kävelivät
edestakaisin, kaksoisten seuratessa heitä oikealla ja vasemmalla
puolen.
Weidelichin muori huomasi tuon kulkueen.
"Katsokaahan toki!" sanoi hän liikutettuna, "kuinka armaasti
nuoret tuolla käyskelevät! Heitä voisi luulla kahdeksi morsiuspariksi!"

"Niinpä vain, miksei!" arveli Salanderin rouva nauraen, "tytöt
olisivat ainakin tarpeeksi vanhat pojilleen, eikä heidän kasvaakaan
enää tarvitsisi!"
"Se ei mitään merkitse!" huudahti taasen toinen äiti; "minun
vekaroistani tulee poikia kahden edestä!"
Maria rouvaa ei tämä sukkeluus miellyttänyt; kun hän sen vuoksi
katsahti lapsiin ja huomasi heidän aikovan valssin alkaessa keinua
jälleen tanssikentälle, kumpikin nojaten oman kaksosensa
käsivarteen, nousi hän äkkiä ylös ja pidätti heidät.
"Mitä te aattelette, Setti ja Netti!" huusi hän tytöille varmalla
äänellä, "ettäkö uudelleen alatte, vaikka aurinko on laskenut ja me
heti lähdemme? Tulkaa vain heti ja kootkaa kapineenne!"
Tytöt jättivät poikansa kuuliaisesti ja ilman huomattavaa
mielihaikeutta; mutta viimemainitut punastuivat ja kävivät hämilleen,
mikä ei jäänyt rouvalta huomaamatta ja harmitti häntä; sillä hänestä
ei näyttänyt soveliaalta, että poikavekarain tarvitsi punastua. Nämä
nypilöivät hopeisia kellonperiään, seuraten naisiaan pöydän luo.
Äitinsä otti heidät vastaan loistavin katsein.
"Mitäs se nyt on olevinaan, te mokomat, että rupeatte tässä
neitosten kanssa tanssimaan", huudahti hän heille, "ja missä
vainenkin te olette sen taidon oppineet?"
"Ohoo, senhän sinä, mamma, kyllä tiedät, tanssikoulussa!"
"Vaiti! Kyllähän sen tiedän! Kiittäkää Jumalaa, että teillä on
vanhemmat, jotka niin paljon teidän hyväksenne tekevät ja käyttävät
kaiken minkä voivat! Isäkin työskentelee aamuvarhaisesta

iltamyöhään; vuodesta toiseen näkee hän vaivaa, ostaa maata ja
istuttaa ja hikoilee, ja talvisin on hänen tuotettava Ranskasta, jopa
Algieristakin saakka! Hän näet sanoo, että silloin ne vasta
kustannukset alkavat, kun te pääsette ylioppilaiksi, jolloin täytyy
tuhansia olla varalla. Herra Salander, minä olen kuullut, että te
voisitte milloin hyvänsä päästä neuvosherraksi, jos vain tahdotte.
Niinpä niin, te olette kauppaherra, sehän on jotain sekin, ja
jonkunlainen vapaa neuvosherra vielä lisäksi! Mutta pari niin
lukenutta neuvosta, asianajajaa tai kirkkoherraa kuin nuo nulkit
tuossa, ei toki sekään ole pois laidalta?"
Onnesta säteillen iski hän silmää pojilleen, jotka olivat pulloon
jääneen viinin kaataneet laseihinsa, sammuttaen perusteellisesti
janonsa.
"Juokaa ja syökää", kehoitti äiti, "ja olkoon se hyväksenne!
Tilaanko vielä puolikkaan?"
Pojat kielsivät, he kun eivät vielä olleet siinä ijässä, jolloin on
totuttu juomaan yli janontarpeen.
"No niinpä lähtekäämme sitten, soppa taitaa pian olla valmista ja
maidostakin lienee isä pitänyt huolen. Sitten menee hän vielä
ottamaan sunnuntainaukkunsa, ja se olkoon kernaasti hänelle
suotuna! Tulkaa, liikkeelle, te vekarat! Lyönpä vetoa, ettette aio
puolille öin tulla kotiin, kun kerran valkoista lakkia kannatte! Mutta
odottakaas, odottakaashan vain! Kyllä teistä sellaiset etanankujeet
karkoitetaan! Nyt sulkeudun minä kohteliaimmin herrasväen
suosioon, arvoisa tuttavuutenne minua ilahduttaa, toivottavasti
emme viime kertaa tapaa, ja neitien — hoi, pojat, ettekö aio
kiittääkään hyvästä seurasta, siinäkö vain seisotte kuin puujumalat?"

Pojat vetäytyivät esille ujommin ja kömpelömmin kuin mitä heidän
reippaan tanssinsa jälkeen olisi voinut odottaa, ojensivat tytöille
kätensä ja toivottivat hyvää yötä. Vihdoinkin lähti sitten tuo
onnellinen äiti poikineen tiehensä ja seurassa kävi nyt
hiljaisemmaksi.
Martti Salander halusi vielä vähän levähtää, hänellä kun oli kolmen
tunnin marssi takanaan; Arnold poika, joka juuri tuli saapuville
kädessään aika pensas metsäkasveja, heitti ne pöydälle ruvetakseen
niitä järjestämään, huomaten samalla jääneensä liian vähälle
syönnille, jonka vuoksi hän sai isän kanssa syödä ylimääräisen
sopan, kun äiti ja siskot sen sijaan olivat syöneet vain maitoa ja
leipämurennusta.
Salander kysyi, kuinka he olivat joutuneet tuon Weidelichin
perheen seuraan.
"Sitä tuskin itsekään tiedän!" sanoi Maria rouva, "me olimme juuri
asettuneet tähän, kun samalla huomasimme olevamme heidän
keskellään. Arnold näyttää tuntevan ne nuoret herrat!"
"Minä olen heiltä kerran leikilläni kysynyt", kertoi nyt Arnold,
"tokko he vielä muistivat, kuinka he pikku poikina Varpusen kaivolla
vesittivät erästä toista, kun tämä ei sanonut äitiään mammaksi.
Tämä tuntui heistä kovin hauskalta ja epäilemättä ovat he sen
kertoneet kotonaan, jossa luultavasti tuo tapaus on muistettu.
Tänään ovat he, kuten huomasin, kuiskanneet äidilleen, että minä
olen juuri sama poika ja että me kaikki olemme niitä samoja
kreuzhaldelaisia, joista myöhemmin on niin paljon puhetta ollut."
"Sitten tuli rouva luoksemme", jatkoi äiti, "liittyi minuun eikä
musikantti parkojen aljettua soittonsa saanut mitään rauhaa,

ennenkuin hänen poikansa saivat tanssitaitoaan näyttää, mikä
tietystikin oli kovin mieluinen asia noille meidän heilakoillemme
tuossa!"
"Mutta he tanssivatkin jo aika hyvin!" huudahtivat Setti ja Netti,
"ja ottavat nytkin vielä tanssitunteja!"
"Jumalan kiitos!" vastasi Maria rouva, "minä näen sentäänkin vielä,
kuinka he silloin, kun me olimme nälissämme, ammottivat kitansa ja
nielivät ne jäännökset, joita me niin hartaasti odotimme!"
"Oh, olivathan he lapsia silloin! Kyllä kai mekin olisimme hotkineet,
jos vain suuhumme olisi pistetty voileipäsiä ja hunajaa!" arvelivat
tytöt.
"Sellaiset kaksoset ovat kovin hankalat", sanoi isä, "minä en voi
näitä lainkaan toisistaan eroittaa!"
"Oo, heilläpä on sentään tunnusmerkkinsä!" kiiruhti Netti lähes
maltittomasti sanomaan; "Julianin vasen korvalehti on hiukkasen
poimukas, noin niinkuin tippaleivän palanen, semmoinen hyvin
maukas! Huomasin sen, kun hänen aallokas tukkansa leyhähteli."
"Sepä merkillistä!" innostui Setti, "toisen, Isidor hänen nimensä
on, oikea korvalehti taasen on luullakseni aivankuin munakokkeli!"
"Tieteellisesti kovin ihmeellistä!" selitti veli veitikkamaisen kuivasti,
"se on yksinkertaisesti joko jäännös jostakin hävinneestä muodosta
tai sitten uuden, tulevan muodon alkio. Tutkituttakaa korvalehtenne,
tytöt! Jos niistä samanlaista löytyy, niin pitäkää varanne, muutoin
nuo kaksoset valitsevat teidät vaimoikseen, perustaakseen

valikoimisteoriian mukaan uuden poimukorvaisten lajin! Tahi menkää
mieluummin heti vapaehtoisesti naimisiin!"
Äiti, joka istui hänen rinnallaan, pisti kätensä hänen suunsa eteen,
lausuen: "Vaiti, sinä kelvoton, jollet koulussa opi muuta kuin
tuollaisia tyhmyyksiä lörpöttelemään!" Mutta isä sanoi nauraen: "Se
oli oikein, Arnold! Ja nyt pitää meidänkin lähteä kotiin päin, muutoin
tulee pimeä; nyt on näet uusikuu, mutta tähdet pilkkivät kauniisti,
katsokaas toki, yksi toisensa jälkeen niitä syttyy!"

VIII
Weidelichin pojat kasvoivat edelleen ja varttuivat ruumiillisesti; he
kulkivat hyvin ryhdikkäinä ja olivat nähtävästi kovin tyytyväisiä
huomioon, minkä he yhdessä ollessaan herättivät. Eikä heillä ollut
puutetta henkisistäkään lahjoista, muuta kuin ehkä kestävyyteen
nähden, kun oli kysymyksessä aljettujen opintojen päättäminen.
Ylemmille luokille päästyään, kun opintie päivä päivältä kävi yhä
vaivaloisemmaksi, oli Julian ensimäinen, joka ei enää "tahtonut".
Hän erosi ja meni muutaman notariuksen konttoriin. Isidor ponnisteli
loppuun saakka, mutta ei ottanut enää osaa ylioppilastutkinnoihin,
vaan kävi puolen vuoden ajan niin sanottuna kuuntelijana
muutamilla lakitieteellisillä hienoilla ja siirtyi sitten hänkin erääseen
notariaattikansliaan.
Kummallakin heistä oli säännöllisen kaunis käsiala, mikä muutoin
ei ole tavallista sillä alalla oleville, joilla on muitakin toimia, ja
kumpikin harrasti samalla tavoin kalligraafisen taituruuden oppimista.
He osoittausivat hyvin kelvollisiksi toimissaan ja jokapäiväisen
kokemuksen avulla omaksuivat he melkein kuin leikkiä lyöden tässä
virastossa tarvittavan taidon.

Isä Weidelichiä ei sellainen asiainpäätös tahtonut miellyttää; hän
kysyi, että tässäkö se nyt oli kaikki se loisto, jota muka oli tahdottu
saavuttaa. Mamma sitävastoin oli perin tyytyväinen. "Poika-vekarat
ovat viisaampia kuin me", hän sanoi, "he tietävät jo, minne he
tähtäävät! Eivätkö he pysty kaikkeen mitä heidän tehtäväkseen
annetaan? Miksi heidän pitäisi nuoret päänsä murtaa, kuten toiset
narrit?"
Ja koska he nyt, sen sijaan että edelleenkin olisivat aiheuttaneet
arvaamattomia kustannuksia, itsekin jo ansaitsivat rahaa, tyytyi
isäkin ja pysyi edelleenkin hyvin tyytyväisenä, kun heidän
esimiehensä koroittivat heidät, nuo tuskin parikymmenvuotiaat
kaksoset, viransijaisikseen ja heillä siten oli lailliset todistukset
vaalikelpoisuudestaan notariuksen virkoihin.
Tähän aikaan suunnilleen tuli eräs harvinainen lemmen ilmiö
puheen alaiseksi Salanderin puolisoiden kesken.
Martti Salander luuli huomaavansa, että hänen kaksi tytärtään ja
heidän äitinsä eivät enää olleet tuttavallisessa ja avomielisessä
suhteessa toisiinsa, että tyttäret elivät omaa elämäänsä ja
salakähmäisesti vetivät yhtä köyttä ja että äiti sitävastoin näytti
kovin vakavalta, jollei huolestuneeltakin, jota hän ei aina osannut
salata, vallankaan sen jälkeen kun hän ei enää puuhaillut
kaupassaan. Sillä Salander, jonka pääliike yhä edelleen ilman erityisiä
ponnistuksia oivallisesti menestyi, kenties juuri sen vuoksi, ettei hän
konstaillut eikä keinotellut, ollen enemmän kansallisiin
harrastuksiinsa ja velvollisuuksiinsa kiintyneenä: Salander ei voinut
kauemmin nähdä Maria rouvan ilman tarvetta kauppatoimessa
itseään vaivaavan. Hän oli sen vuoksi tuon haarakaupan luovuttanut
hyvästä rahasummasta muutamalle toimeliaalle nuorelle kauppiaalle

sekä päästänyt kunnon puolisonsa lepoon, mihin tämä pitemmittä
puheitta suostuikin. Koko voiton, minkä hänen sievonen pääomansa
tuotti, oli hän vastaväitteitä kuulematta muodostanut aikoja sitten
lupaamakseen perinnöksi vaimolleen, jotta tämä hänestä ja hänen
onnestaan sekä onnettomuudestaan riippumatta ynnä hänen
kuoltuaan lapsistakin riippumatta saattaisi elää epävarmoinakin
aikoina. Kun hän siis mietteineen ja huolineen, jotka häntä
painostivat, ei enää voinut kauppapulpetin taa sukeltautua, olivat
hänen kasvonsa paremmin miehensä huomattavissa ja tämä kysyi
syytä hänen huoliinsa.
Jos tuo kunnon vaimo puhua aikoi, niin olisihan hän sen
itsestäänkin tehnyt. Hän loi silmänsä alas, hieroi käsiään aivankuin
niitä olisi palellut ja sanoi sitten: "Meille on pudonnut tiili päähän!"
"Tiili? Miltä katolta sitten?" kysyi Martti hämmästyneenä, koska
hänen täytyi puolisonsa vakavuudesta päätellä jotain arveluttavaa,
jopa vaarallistakin olevan kysymyksessä.
"Enhän minä kuitenkaan voi sitä kauemmin omana tietonani pitää!
Tyttärillämme on mielitietty!"
"Yhteensäkö sama mielitietty?" kysyi mies hymyillen, hiukan
keventyneenä, kun ei siitä sen kauheampaa tullutkaan.
Rouva pysyi järkkymättömän vakavana.
"Ei, erikseen, lyhyesti sanoen: he ovat kihloissa niiden
kaksoskirjurien kanssa Varpusesta!"
"Niitä velhottaria! Kuinka se on tapahtunut, milloin, missä ja millä
tavoin sitten? Pääsenpä todellakin myöhään asian perille! Onpa se

kylläkin uutinen melkein kuin kattotiili, joskaan se ei samalla tavoin
reikää päähän puhkaise!"
"Minun pääni se on tarpeeksi asti puhkaissut! Ajattelehan toki,
kaksi tyttöä kahdenkymmenenviiden ja -kuuden vuoden ijässä
tahtovat mennä naimisiin kaksikymmenvuotiasten kaksosten kanssa!
Sehän on kuulumaton tapaus, molemmat, sekä ikä- että kaksosjuttu!
Jos tässä edes olisi ikänaisia, jotka ottavat nuoria miehiä, useinhan
sellaista tapahtuu, niin sille naurettaisiin, ja sillä hyvä! Mutta että
tytöt, ikänsä kukoistuksessa ja toki nuoruutensa rajalla ollen tekevät
sellaisen valinnan, untuvapeitteisille teikkareille, kaksi sisarusta
kaksosille!"
"No, jonkunlainen romaanihan on sekin eikä juuri minullekaan
mieluinen; mutta rakkaushan aina saa sellaisia kepposia aikaan; eikö
sadastikin sanota, että se mitä todellisuudessa kokee on usein
räikeämpää kuin kaikki se mitä mielessään kuvittelee?"
"Niinpä niin! Sitähän minäkin usein ajattelen! Ah, ukko kultani,
varmaankin me olemme tehneet väärin, ettemme ole koskaan
lähettäneet lapsia maailmalle emmekä antaneet niiden mitään
ammatin tapaista oppia! Sinä sanoit, että kuka voi tyttärensä pitää
kotona, sen tulee se tehdä ja kasvatuslaitoksista sinä et tahtonut
mitään tietää, vielä vähemmän ammateista. Sitä sinä nimitit leivän
riistämiseksi köyhempien suusta sekä nälistelemiseksi, jollei
kysymyksessä olisi varmat kyvyt, joita tulisi käyttää. Sinä haaveilit
vapaista kodin tyttäristä ja vapaista perheen emännistä, joiden ei
tarvitsisi palveluksessa kuihtua, ja minä menestyksestämme
hurmaantuneena olin kanssasi samaa mieltä, vaikka tiesinkin, kuinka
hyvä se minullekin olisi ollut jos olisin joskus oppinut jotakin

ammattia! Sinä et saa tästä pahastua, tarkoitukseni ei ole lainkaan
soimata!"
"En minä sitä niin ymmärräkään, kultaseni, koska kyllä tiedän,
kuinka hyvin sinä maailmassa tulet toimeen! Että he Kreuzhaldessa
hakkasivat sinulta ne puut, ei ollut sinun paremmin kuin minunkaan
syyni!"
"Jättäkäämme se; minä vain tahdon sanoa, että jollei tytöillä olisi
ollut niin täydellistä joutilaisuutta ja vapautta, niin tuskinpa he
olisivat yhdessä ehtineet kehittelemään tuota vastenmielistä
seikkailua! Ja nyt, mihin meidän on ryhdyttävä tuohon
kaksoskeitokseen nähden? Ja se pöyhkeä pesumuija sitten!"
"Oo, mitä häneen tulee, niin on hän kaikesta päättäen raaka
möhkö; mutta hänessäkin löytyy äidinhyvyyden helmiä! Kuitenkaan
kaikitenkaan en ole perillä, miten asiat oikeastaan ovat. Ovatko he
sinulle mitään ilmaisseet?"
"Herra varjelkoon, hehän ovat täysi-ikäisiä! Muutoin he ehkä
kylläkin olisivat ajoissa kääntyneet vanhempainsa puoleen, eikä,
kuten uskon, kumpikaan heistä yksinään olisikaan meitä kohtaan
ollut niin viekas ja piittaamaton, jollei tuo harmillinen
kaksivaljakkoisuus olisi sitä surkeata juttua saanut ihan salaliitoksi
muuttumaan —"
"Maria kulta", keskeytti Martti, "jättäkäämme tuo kysymys asian
luvallisuudesta toistaiseksi rauhaan! Ethän sinä toki voi vakavasti
väittää, etteivät kaksoset saisi naida, ja yhtä vähän, että kahdelta
sisarukselta, joita nämä miellyttävät, olisi kielletty heitä ottamasta."

"Sitä minä en lainkaan väitä, minä vain sanon, että se ei minua
tässä tapauksessa miellytä, että se ei ole sopivaa, että se minua
huolestuttaa, syystä että se on vain sairaloinen oikku! Ajattelehan,
että pari poika nulikkaa ovat tähystimiinsä saaneet meidän
täysikasvuiset tyttäremme ja muodollisesti ne meiltä ryöstäneet,
samalla kuin tyttö hupakot, tiedossaan tuo kaunis salaisuus, ovat
luotaan torjuneet mitä parhaimpia naimatarjouksia! Ja me milloin
iloitsimme heidän vaatimattomuudestaan, kun he elelivät kuin
nunnat ja käyskelivät tummiin puettuina ja hunnutettuina, milloin
sureksimme sitä, etteivät he tahtoneet iloisemmin nuoruudestaan
nauttia! Todellakin, he ovat siitä tavallaan nauttineet — niin, mitäpä
siitä salaisin, että nuoret tapaavat toisiaan milloin haluavat:
kuutamoyöt, auringonnousut kesällä, pitkät kävelyretket keväällä,
talvella luistinrata — vanha palveliattaremme on minulle kaiken
tämän kertonut, vuosikausia vaiettuaan. Ja minkätähden? Sentähden
että hän oli torilla riitaantunut Weidelichin muorin kanssa, joka oli
häntä jo yliolkainsa kohdellut. Hän oli nimittäin lörpötellyt, että
meidän tyttäremme olisivat ainakin puolen, miljoonan arvoisia
kappale, että sitä kuulee kaikkialla sanottavan! Tämä lörpötys ja
tunkeilu ei ollut Leenaa sentään miellyttänyt, hän antoi kaihtavan
vastauksen, ettei hänellä ole tapana urkkia mitä herrasväki omistaa
ja niin toisin, johon toinen vastasi, että palveliana hän kenties olikin
oikeassa siinä, mutta hän, rouva Weidelich, oli muka siinä asemassa,
että saattoi paremmin huolehtia, mimmoinen omaisuus noilla tai
näillä ihmisillä oli. Hänen ei pitäisi olla kovin utelias, sanoi
palvelijattaremme taas, sillä eivät kaikki päivät olleet vielä illassa. Jos
joku pesumuija tahtoisi kylmää pesuvettä, niin voisi hän aina asettaa
saaveja sateeseen, silloin kyllä saisi oivallista virutusvettä; mutta jos
hän tahtoi miljoonan omaisuuden siepata, niin ei siihen aina
riittäisikään, että tekaiseisi kaksoset sitä pyydystämään! Tämän

jälkeen he olivat haukuskelleet toisiaan riittämiin asti ja Leena juoksi
kotiin kovin tulistuneena sekä kertasi ja tunnusti minulle kaikki. Kun
minä luonnollisesti luin hänelle lakia ja uhkasin panna hänet pois,
kun hän niin kauan oli häpeällisesti meitä pettänyt, ilmaisi hän
samalla, kuinka lapset olivat hänelle pyhästi luvanneet itse
ensimäisen tilaisuuden sattuessa ilmaista asian vanhemmilleen, joten
hän siis kokonaan pääsisi pelistä. Mutta minä olen tuosta torilla
sattuneesta riidasta tullut siihen vakaumukseen, että se on noiden
kaksosten äiti, joka on koko tämän viheliäisyyden alku ja juuri.
Vaiennut olen minä näihin asti, koska minä häpesin, nähdessäni
omien lasteni minua sillä tavoin vierovan!"
"Voitpa olla oikeassa siinä, Maria parka", vastasi miehensä synkin
ilmein, "vaan olenhan minäkin saman kohtalon alainen. Mutta
väittäisin minä sentään, ettei se ole mielenlaatu eikä huono luonne,
joka tytöt on saanut noin omituisesti menettelemään, vaan tietoisuus
koko sen asiaintilan omituisuudesta ja mahdottomuudesta, joksi
heidän tuhma rakkausjuttunsa on muodostunut. Ennenkuin otan
heidät puheisille, haluaisin vain tietää, minkälaatuista se tuon
hauskan nelikön intiiminen seurustelu oikeastaan on; kai sinä
ymmärrät minua?"
"Leena on minulle vannonut sen olevan aivan kunniallista laatua.
Hän sanoo heidän näkevän toisiaan korkeintaan kerran kuukaudessa
ja tyttöjen pitävän nuoria miehiään ankarasti säädyllisen, jopa ihan
turhantarkan seurustelutavan rajoissa. Jollei, sanoo hän,
varpushaukkana iskisi paikalle, niin tuskin huomaisikaan siinä kahden
rakastavaisen parin olevan yhdessä. Tuo palvelevainen olento on
näet useammat kerrat seurannut lapsia heidän yöllisillä retkillään
sekä vartioinut heitä sillä aikaa kuin me mistään tietämättä
nukuimme."

"Minun täytyy saada huomaamatta olla sellaisessa kohtauksessa
saapuvilla ja luulen parhaaksi sitten asianhaarain mukaan astua
heidän keskelleen ja saattaa asia päätökseen, kaikissa tapauksissa
lähettää ne poikajunkkarit tiehensä ja ottaa tytöt heti mukaani
kotiin."
"Jospa se olisi sillä tehty!" sanoi rouva Salander; "mutta minusta
on kuitenkin mieluinen asia, että sinä niin reippaasti ryhdyt asiaan
sekä pidät sitä sen arvoisena. Minä en kykene toimimaan; minun
sydäntäni likistää puhua täysi-ikäisten tytärten kanssa asioista,
joiden ei pitäisi tulla kysymykseenkään. Jos Arnoldimme olisi täällä,
niin tietäisinpä mitä minulla olisi!"
"No, mitä niin?"
"Huimapäisenä ylioppilaana, jollainen hän on, antaisi hän varmasti
minun puolestani kyytiä noille kirjureille ja karkottaisi sisartensa
päästä kaikki hullut haaveet!"
"Ah, hyväseni, siinä sinä et ole oikeassa! Hullut mielijohteet ovat
valitettavasti enemmän sydämen itsepintaisuutta kuin intohimon
tulisuutta. Sitäpaitsihan hän ei tule takaisin enää ylioppilaana, vaan
lakitieteen tohtorina, ja pelkäänpä, ettei hänellä sen lisäksi ole enää
taipumusta sellaiseen."
Muutamien päivien mentyä ilmaantui Salanderille tilaisuus olemaan
saapuvilla noiden kavalluksen uhriksi joutuneiden kuhertelijain
lemmenkohtauksessa. Joku aika sitten oli Martti Salander pakoittanut
tyttärensä luopumaan nunnamaisesta käytöksestään ja liittymään
muutamaan laulukööriin, joka ajoittaisin harjoitti suurempia
sävellyksiä, ja yhdessä erään suuren orkesterin kanssa antoi
konsertteja muutamassa kaupungin kirkoista. Heillä oli hyvä ääni ja

saattoivat oivallisesti laulaa. Olisi barbarimaista, sanoi hän, olla
ottamatta osaa sellaisiin harjoituksiin, joiden kautta saattoi olla
avullisena valmistamassa muille iloa sekä hankkia itselleen
vanhuuden varalta kyvyn ymmärryksellä kuuntelemaan ja
nauttimaan kun ei enää itse pystyisi osaa ottamaan.
Samaan aikaan liittyivät veljekset Isidor ja Juliankin kööriin.
Nyt oli Leena kuiskannut rouva Salanderille, että huomisessa
konserttiharjoituksessa, joka kestäisi myöhään yöhön, saisivat neidit
tehtävänsä melkoista aikaisemmin suoritetuksi ja että he olivat
rakastettujensa kanssa sopineet kohtauksesta.
"Arvaapas, minne he menevät!" sanoi Maria miehelleen,
ilmaistessaan hänelle tuon tiedon. "Sinä et arvaa sitä, ja kuitenkin he
ovat siellä usein olleet: suuressa puutarhassa, joka on sinun
liikehuoneustosi takana!"
"Niitä velhottaria! Kuinka he pääsevät sisään? Eivät kai he toki
minulta kähmine talon ja konttorin avaimia ja päästäne niitä vieraita
poika junkkareita joka paikkaan?"
"Varjelkoon! He ovat löytäneet sen vanhan ruostuneen avaimen,
joka kuuluu pieneen takaporttiin siinä puutarhanmuurissa, mikä
puistoa rajoittaa syrjäkadun puolelta. Tytöt menevät sinne ensin,
kymmenen minuuttia myöhemmin lähtevät kaksoset harjotuksista."
Kysymyksessä olevana päivänä pysyivät tytöt hiljaa kotona aina
iltaan saakka, käärivät sitten nuottivihkonsa kokoon ja aivan oikein
lähtivät konserttikokeeseen. Isä oli päivällispöydässä tarkastellut
heitä, käyden vähän hämilleen, sillä he eivät olleet enää mitään
lapsia, vaan muhkeita ja ryhdikkäitä naisia. Eikä hän ollut

huomannut heissä mitään erinomaista, kuin että he vaikean tehtävän
takia vain jonkunlaisella jännityksellä odottivat tuota musikaalista
iltaa.
Talo, josta hän oli vuokrannut liikehuoneensa, oli siihen aikaan
muuten asumaton, ja Salander oli välistä aikonut ostaa tuon vanhan
rakennuksen sekä uusia sen, mutta oli aina vaatimattomasti siitä
luopunut. Sillä välin oli hän sinne sijoittanut asumaan yhden
kirjanpitäjän sekä puotirengin, mutta he asuivat toisella puolen kuin
missä puutarha oli. Salander lähti puheen alaisena iltana kenenkään
huomaamatta konttoriinsa, sytytti sulettujen luukkujen takana
valkean ja odotti niin kauan kuin arveli hetken tulleen. Sitten veti
hän jalkaansa kummikengät ja kulki hiljaa kuutamoisen pihan yli
puutarhan rautaristikkoportille. Varovasti kurkisteli hän tovin aikaa
tuon sekavan rautaverkon läpi, kuitenkaan näkemättä tai kuulematta
jälkeäkään ihmisistä. Niinpä avasi hän hiljaa ristikon ja astui
puutarhaan, jossa kaikkialla kasvoi entisaikaan istutettuja hoikkia ja
korkeita puita.
Suunnilleen keskikohdalla liritti niukkoja vesivarojaan hiekkakivestä
tehty, delfiinein ja tritoonein koristama, rapistunut kaivolaitos. Kaivon
edessä oli aukeampi, tuuheiden akasiain ympäröimä pyöreä kenttä,
ja kun puut olivat vielä lehdettöminä, loisti täysikuu vapaasti kentälle
samoinkuin siihen johtaville käytävillekin. Heti kaivon takana oli
nuorten havupuiden muodostama tiheikkö. Martti Salander pujahti
keskelle sitä; se kätki hänet täydellisesti. Siinä päätti hän odottaa,
sillä siihen vuoden aikaan oli puistossa vain yksi lepopenkki, nimittäin
puolipyöreä kivilaatta vastapäätä kaivoa.
Olikin jo aika vakoiluretkellä olevan isän ottaa itselleen paikka.
Lyhyen hetken kuluttua kuuli hän häädettyjä mutta nopeita askelia ja

hänen tyttäriensä tummat haahmot liukuivat kuin öiset varjot kaivon
ohitse ja kävelivät rinnakkain, sanaakaan puhumatta, kaksi tai kolme
kertaa kentän ympäri, kunnes he äkkiä pysähtyivät kaivosäiliön
eteen. Salander ei voinut heitä tuntea, heillä kun oli harsot vedettynä
syvälle kasvojen, kaulan ja leuan ylitse. He vetivät hansikkaat
käsistään, täyttivät delfiinien alla kouransa vedellä ja ryyppäsivät sen
ahnaasti suuhunsa. Värelihän ilmassa tosin huhtikuisen yön lenseys,
mikä melkein läheni toukokuun lämmintä, joten tuo neitosten jano
oli selitettävissä.
"Taivas, kun se polttaa, että noin täytyy sammuttaa!" ajatteli
Martti Salander piilossaan; "luonnollisesti, onhan kummallakin
kokonainen tulipalo sydämessään!"
He ottivat uudelleen vettä ja viillyttivät otsaansa, siirrettyään
harsoa vähän syrjään.
"Niitä raukkoja!" ajatteli isä jälleen, "se on kylläkin tukala juttu!"
Nyt hän tunsikin äänestä nuoremman, Nettin, kun tämä hiljaa,
mutta sentään kuuluvasti sanoi: "Oi, minä pelkään, Setti, että
meidän onnemme aika on lopussa!"
"Minkätähden? Tuon ilkeän Leenanko takia?" vastasi vanhempi
sisar, huoaten pakotetusti.
"Elä häntä sen vuoksi soimaa, onhan hänellä toki joitakin
velvollisuuksia äitiämmekin kohtaan! Ja kerranhan sen kumminkin
täytyi tapahtua ja nyt se on selvillä!"
"Nyt se todellakin on tai pian tulee, niin! Nyt juuri on
kysymyksessä taisteleminen ja kärsiminen! Vai pitääkö meidän

kevytmielisesti jättää rakastettumme, nuo taivaan ihmelahjat!"
"Ja voitko sinä niin keveästi erota noista maailman parhaista
vanhemmista? Jospa vain äiti voisi pitää niistä poika poloisista! Mutta
tiedänhän, että hän ei sitä tee, ei, ei!"
"Hänen on hyvä sanoa, hän kun kaikkia vertaa isään, joka kylläkin
on miesten malli, jolle ei ken hyvänsä vertoja vedä! Ja sittenkin on
hänkin ehkä ollut samassa määrin pikku hulivili kuin nuo meidänkin
keltakiharaiset kultasemme! Ja eivätkö he nyt jo ole ahkeroita kuin
mehiläiset, ennenkuin elämisen huoliakaan tuntevat? Minä luotan
äidin hyvyyteen, joka ei koskaan tyyten sammu, ja vieläkin
enemmän isän suurempaan vapaamielisyyteen! Olen äsken lukenut
erään todellakin paikkansa pitävän totuuden, että ainoastaan mies
voi sanan täydessä merkityksessä olla humaani, olla sitä kaikissa
elämän tiloissa! Minä ainakin tunnen, että minä naisena en siihen
kykene, enempää en tahdo sanoakaan!"
Salanderia tuo vanhimman lapsensa odottamaton puhe
hämmästytti siihen määrään, että hänen täytyi tarttua muutamaan
nuoreen kuuseen ja sai siten tiheikössä aikaan pientä rapinaa.
Sisarukset vaikenivat hiirenhiljaisiksi, tirkistellen säikähtyneinä
pimentoon. Kun ei mitään enempää seurannut, sanoi Setti: "Se oli
tuuli tai lintu, jonka unestaan herätimme. Istukaamme!"
He kääntyivät kivipenkkiä kohti, mutta eivät ehtineet vielä sen luo,
kun portti puiston perällä alkoi narista. Tytöt seisoivat kuin
lumottuina ja näkivät kaksosherrain varpaillaan ja kuiskien lähenevän
pitkin kuun valaisemaa käytävää. Kaivokentälle saavuttuaan levittivät
he empimättä käsivartensa lemmittyjään syleilläkseen, mutta tulivat
pysäytetyiksi.

"Seis, herrasemme!" torui Setti pidätetyllä, mutta käskevällä
äänellä, "on sovittu, että teillä tällaisissa tilaisuuksissa tulee olla
erilaiset hatut, jotta jokainen daami voi tuntea oman ritarinsa! Nyt te
tulette päässänne hatut, jotka ovat aivan samanlaiset kuin kaksi
munaa! Kumpi nyt on Isidor?"
"Ja kumpi Julian?" lisäsi Netti.
"Minä!" huusivat molemmat yhtaikaa, ilmeisestikin piloillaan.
"Katsokaammepas!" komensi Setti suuttuneena, "korvalehdet
esiin!" Hän astui toisen luo ja tarttui tämän oikeaan korvaan, sillä
aikaa kuin Netti samalla tavoin tunnusteli toisen vasenta korvaa.
"Ahaa!" sanoi Salander itsekseen, "munakokkeli ja tippaleipä!" ja
jälleen täytyi hänen hillitä itseään, estyäkseen äänekkäällä naurulla
itseään ilmaisemasta. "Eiköhän minun olisikin maksusta näyteltävä
näitä kahta mestariteostani yhdessä armastelijainsa kanssa?"
Sillä välin olivat sisarukset onnellisesti löytäneet omansa,
kohtaamatta sen enempää kiusantekoa noiden veitikkain puolelta.
Kumpikin sai juhlallisen suukon ja sitten paikan lemmittynsä rinnalla
siinä puolipyöreällä penkillä, jonka jälkeen kuuluivat tuikeat
komentosanat: "Ei syleilyjä, eli me menemme tiehemme!"
Ensi alussa näkyi tuo pieni seurue parittaisin keskustelevan, jonka
vuoksi Salander ei saanut yhdestäkään sanasta selkoa. Hän näki
tyttöjen istuvan suorina ja liikkumattomina kuin kivikuvat, samalla
kuin Isidorin ja Julianin täytyi, kummankin kiltisti omansa puoleen
kumartuneena, tyytyä pelkästään silmillään hyväilemään heidän
kuun valaisemia kasvojaan.

Herra Salander kummasteli uudelleen tyttöjä; he tuntuivat hänestä
yhden ja saman mielettömyyden kahdelta ruumiillistuneelta
ilmaukselta, mielettömyyden, joka nuo onnettomat oli vallannut. Jos
nyt toisen kaksosista täytyisi kuolla tai hän muuten häviäisi, niin
jakautuisivatkohan he ehkä silloin pelkästään kahtia vai
riippuisivatkohan lopulta molemmat tuossa jälelle jääneessä osassa
niinkuin äidit Salomonin tuomiossa, jolloin tuo heidän luulotellun
intohimonsa kummitus heidät turmioon saattaisi?
Häntä hirvitti ajatellessaan, että sellaiset sielulliset häiriöt olivat
tulleet noiden niin kukoistavien tyttöjen osaksi. Ja yhä he siinä vielä
istuivat ja kuiskailivat hiljaa nuorukaistensa kanssa, jotka juuri nyt
hypähtivät ylös, hämmästyneinä jostakin sanasta.
Setti yksin jatkoi puhetta ja niin kuuluvasti, että isä pensaikossa
saattoi sen ymmärtää: "Niin, te kauniit veljekset! On tapahtunut
sellaista, mikä meihin koskee kipeästi! Teidän rouva äitinne on, kuten
varmasti tiedämme, julkisella torilla puhunut sellaista, josta meidän
täytyy päättää, että meitä sisaruksia pidetään rikkaina tai sellaisina,
joista tulee rikkaita ja siis kaikki rakkaus ja uskollisuus koskeekin
vanhempaimme luultua varallisuutta!"
Veljekset kavahtivat taapäin ja seisoivat hämmästyneinä noiden
ankaroiden tyttöjen edessä; sillä Nettikin kääntyi synkkänä, vaikkakin
vienommin äänin, kaksospuoliskonsa puoleen, tosin enää tarkoin
tietämättä oliko se oikea, heidän paikkansa kun olivat vaihtuneet.
Sisaruksetkin olivat nimittäin nousseet ylös ja astuneet noiden
häiriölle joutuneiden kaksosten keskelle, jotka sanoja tavotellen
astelivat edestakaisin.
"Jaa, niin se on, me emme ole mitään markkinatavaraa!" sanoi
Netti ja pyyhkäisi silmiään, koettaen katseillaan tavoittaa tuon

sekaannuksen kautta hukkaan pujahtanutta Juliania. Tuo mieluisa
korvalehtien kopeloiminen oli hetken vakavuuden takia käynyt
mahdottomaksi.
Setti oli samassa asemassa, pysyen kuitenkin maltillisempana.
"Puhu sinä, Isidor, jos teillä on jotakin sanottavaa!" huudahti hän
intohimoisessa unheessaan kovemmin kuin olisi tahtonutkaan. Ja
heti itsensä rohkaisten sai tämä viimeinkin sanoiksi.
"Minkä me sille voimme, jos kunnon mammamme siitä iloitsee,
että hänen pojillaan on rikkaat morsiamet? Onko se hänelle synniksi?
Ja olisiko se meille itsellemmekään synniksi tietää lemmittyjemme
olevan turvatut elämisen huolilta? Vaikka me toivomme ja luotamme
siihen, että omin voiminkin kykenemme heidät niiltä suojaamaan! Ei,
kallis Settini! Ei minulle ole välttämätöntä sinun perintöäsi rakastaa;
mutta sinua rakastaa on minulle välttämätöntä, sen vannon sinulle!
Jätä rahat ja hyvyydet, vanhemmat, koti, isänmaa, kaikki ja tule
minun kanssani! Minäkään en halveksi tulla köyhyyden tai oman
itseni tähden rakastetuksi, minäkin tahdon jättää siihen paikkaan
kaikki kauniit toiveet ja kaiken mitä vanhemmiltani saanen ja vaeltaa
sinun kanssasi aina maailman ääriin!"
Näin puhuessaan oli hän heittäytynyt vanhemman Salanderin
neidin jalkoihin, jota näiden neljän henkilön kesken ei ennen ollut
tapahtunut ja joka muutoinkaan ei ollut maassa tavallista. Samoin
teki Julian ja piti Nettille vielä tulisemman puheen, jossa hän lupasi
tahtovansa tulla, ei köyhäksi, vaan rikkaaksi, todistaakseen, ettei
hänen tarvitse morsiamensa rikkautta katsella.
He pusersivat lujasti sisarusten käsiä ja peittivät ne suudelmilla,
omista sanoistaan kyyneliin saakka liikutettuina. Kun nyt kumpikin

Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
ebookultra.com

Epiblast Stem Cells Methods and Protocols 1st Edition Daniel C. Factor

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Epiblast Stem Cells Methods and Protocols 1st Edition Daniel C. Factor

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

TLE-9-Prepare-Salad-and-Dressing.pptxkkk

LESSON 1 ABOUT MEDIA AND INFORMATION.pptx

GRADE-8-AQUACULTURE-WEEKQ1.pdfdfawgwyrsewru

Feelings PP Game FOR CHILDREN IN ELEMENTARY SCHOOL.pptx

Jeopardy_Figures_of_Speech_Template.pptx [Autosaved].pptx

Jeopardy_Figures_of_Speech.pptxvdsvdsvsdvsd