Introducción a las técnicas de cultivo celular

1. Introducción a las técnicas de cultivo celular

1. CULTIVO Y BIORREACTOR UNIDAD 1

2. 1. Introducción a las técnicas de cultivo celular   1.1. Cinemática del crecimiento celular 1.1.1. Bacterias de uso humano 1.1.2. Dinámica del crecimiento celular 1.1.3. Modelos de crecimiento celular: estructurado y segregado 1.1.4. Cinemática del crecimiento bacteriano   1.2. Manejo de células 1.2.1. Sistemas de fermentación 1.2.2. Medios de cultivo 1.2.3. Cultivo de células animales 1.2.4. Cultivo de células vegetales

3. Cultivo celular Es un modelo de estudio in vitro constituido por células que pueden crecer y mantenerse en suspensión o en monocapa por más de 24 horas en condiciones controladas. Se define como el conjunto de técnicas de aislamiento de células y obtención de poblaciones celulares in vitro , manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Célula .- unidad anatómica fundamental de todos los organismos vivos, generalmente microscópica, formada por citoplasma, uno o más núcleos y una membrana que la rodea.

4. INTRODUCCIÓN Se remontan al año 1902, cuando Haberlandt intentó cultivar células aisladas de plantas, postulando así el principio de la totipotencia vegetal, que es la base teórica sobre la que se sustentan todas las técnicas de cultivo in vitro. En la década del 50 estuvieron disponibles los conocimientos sobre los reguladores de crecimiento y los medios de cultivo que hicieron posible el rápido desarrollo de estas herramientas

5. Breve introducción histórica En 1907 el Dr. Harrison cultivó células del tubo neural de embrión de rana En 1910 el Dr. Burrows cultivó explantos de tejido de embrión de pollo y junto con el Dr.Carrel fueron los primeros investigadores en intentar cultivo de células de mamíferos. Entre 1940-1945 se logran replicar virus sobre células cultivadas. En 1952 se establece la línea celular HeLa (primera línea celular de origen humano)

6. Durante la década del 70 los cultivos celulares se incorporan a la ingeniería genética. En 1975 los Drs . Koehler y Milstein establecen la primera línea celular productora de anticuerpos monoclonales. En los últimos años la aplicación de la tecnología del cultivo celular a permitido grandes avances en la comprensión de los mecanismos implicados en procesos intra e intercelulares.

7. ¿Para qué cultivar células in vitro ? ESTUDIOS DE INVESTIGACIÓN : comprender la fisiología celular, toxicología, y virología. INGENIERIA DE TEJIDOS : transplantes , injertos (piel, hígado, hueso, cartílago). PRODUCCIÓN DE BIOLOGICOS : anticuerpos monoclonales, hormonas, enzimas, vacunas virales (polio, aftosa, moquillo etc.) CITOGENÉTICA : estudios cromosómicos. TRANSGENICOS : organismos genéticamente modificados.

8. Diferentes tipos de cultivos de tejidos: Cultivo de órganos: mantenimiento de órganos o parte de órganos in vitro (por ejemplo corazón). Cultivo de tejidos y explantes : mantenimiento de tejidos in vitro. Cultivo de células

9. Existen 3 formas principales de iniciar un cultivo celular:

10. Puede definirse como el conjunto de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, Tejidos, células y protoplastos. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

11. Es una herramienta de gran utilidad en la biotecnología Está técnica se basa en la " totipotencialidad celular"; capacidad de una célula vegetal de formar una planta completa bajo ciertas condiciones químicas y físicas, dadas en el cultivo in vitro Se obtiene la propagación rápida y masiva de plantas idénticas a la original a partir de cualquier parte aislada de la planta, sean estos trozos de tejidos, ápices meristemáticos o incluso células aisladas. Inicialmente se usó esta técnica para la multiplicación masiva de plantas élites o micro propagación y también en la obtención de clones libres de virus. C A R A C T E R I S T I C A S

12. Ventajas de los cultivos celulares

13. VENTAJAS Virología: Cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas, etc. Biotecnología: producción industrial de fármacos en biorreactores (interferón, insulina, hormona de crecimiento, etc.) Inmunología: Producción de anticuerpos monoclonales, señalización, fenómenos de inflamación. Farmacología: Efecto de diversos fármacos, interacciones con el receptor, fenómenos de resistencia, etc. Ingeniería de tejidos: Producción de tejidos artificiales (piel, cartílagos) para el tratamiento de grandes quemados, injertos o autotransplantes, desdiferenciación y diferenciación inducida, etc. Toxicología: citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, etc.

14. ANALISIS DE CASO En base al caso descrito, analiza ¿qué técnicas o donde se aplico el cultivo de tejidos? Discute Propón en equipo un caso donde claramente se utilice el cultivo de tejidos y elabora un mapa mental. Fecha de entrega lunes 18 febrero 2019. Entrega en Schoology https://www.youtube.com/watch?v=Hm-KgGsCzWk&t=10s

15. Diferentes tipos de cultivos celulares Primario: iniciado a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente de un organismo. Líneas celulares: se origina del cultivo primario, a partir del primer subcultivo exitoso. Línea celular continua: células que han logrado sobrevivir a muchos subcultivos. Expectativa de vida “infinita”.

16. Cultivo primario: Pasos: Aislamiento del tejido de interés. Disociación mecánica y enzimática del tejido Obtención de la suspensión celular. Siembra en soporte adecuado para la proliferación en monocapa o en suspensión.

17. Subcultivos Una vez que el cultivo alcanza la confluencia (máxima proliferación posible en el soporte en que se encuentra), es necesario tomar una porción células y transferirlas a un nuevo soporte (repique o pasaje).

18. Crecimiento celular: En monocapa Las células crecen En suspensión

19. Células en monocapa Los cultivos cuyas células son dependiente de anclaje crecen formando monocapas de células adheridas al plástico o vidrio. Para despegar las células se utilizan enzimas que disgregan la matriz extracelular como la tripsina y la colagenasa.

20. Células en monocapa

21. Células en suspensión Las células que proliferan sin necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje (característico de células hematopoyéticas) crecen en suspendidas en el medio de cultivo correspondiente. El repique se realiza mediante una dilución de la suspensión celular.

22. Líneas celulares continuas BHK: fibroblastos de riñón hámster cirio dorado. CrFK: fibroblasto de riñón gato doméstico. MDCK: epitelio de riñón canino. CHO: epitelio de ovario de hámster chino. HeLa: epitelio tumoral de cuello uterino humano. MDBK: epitelio de riñón adulto. HUVEC: endotelio de vena umbilical humana

23. Línea celular LM3 Línea celular establecida a partir de pasajes sucesivos in vitro de un cultivo primario del adenocarcinoma mamario murino M3. El adenocarcinoma mamario M3 surgió espontáneamente en una ratona BALB/c endocriada en el bioterio del Instituto de Oncología “Ángel H. Roffo”. Las células LM3 presentan un fenotipo altamente invasivo y metastásico al ser inoculadas en ratones singeneicos y en cultivo muestran una morfología epitelial poliédrica

24. ABAC Asociación Banco Argentino de Células Desde 1987 mantiene y administra líneas celulares en distintos centros de investigación, proveyendo células congeladas o en cultivo a cambio de un arancel.

25. Mantenimiento de líneas celulares Repique o pasaje: para mantener las células en cultivo. Congelación ( criopreservación ): para preservar las células a lo largo del tiempo (años) y mantener un stock para los próximos usos.

26. Criopreservación Técnica: Se levanta la monocapa por tripsinización Se obtiene una suspensión celular. Se centrifuga 800-900 rpm durante 10 min, para separar la fracción celular del medio de cultivo. El pellet celular se resuspende en medio de congelación (SFB o medio enriquecido mas DMSO o Glicerol –anticongelantes- )

27. Criopreservación Se fraccionan en criotubos. Colocar en recipiente adecuado 20 minutos en heladera y luego se la lleva a freezer -80°C durante 24-48 hs Se guardan en tanque de nitrógeno líquido

28. Componentes del medioambiente del cultivo: Medio de cultivo :( aporta nutrientes, vitaminas etc.) Suplementos: ( ej suero que aporta factores de crecimiento) pH: ( ej : 7,4 ) Temperatura: (ej. 37° C) Gas: Dióxido de carbono (ej. 5-7%) Soportes: materiales adecuados para el crecimiento ( ej vidrio, plástico, biológicos etc.)

29. Medios de cultivo

30. Suplementos

31. Atmósfera y temperatura Estufa de cultivo con atmósfera de Dióxido de carbono

32. Soportes Estériles Generalmente se utiliza material de plástico:

33. Soportes Biológicos:

34. El laboratorio de cultivo celular Además del equipamiento usual se requiere: Microscopios: invertido con contraste de fase, de fluorescencia, etc.

35. El laboratorio de cultivo celular Flujo Laminar o campana de seguridad biológica: mantienen la esterilidad del área de trabajo.

36. El laboratorio de cultivo celular Espacios fríos: Heladeras (4°C) Freezer (-20, -40,-80 °C) Tanque de Nitrógeno Liquido (- 196°C)

37. El laboratorio de cultivo celular

38. Factores críticos No biológicos : orden, limpieza, vestimenta adecuada para cada sector, etc. Biológicos: CONTAMINACIONES La contaminación puede ser visible o no, destructiva o no, pero en todos los casos tiene efectos adversos

39. Contaminaciones Biológicas Microorganismos: Bacterias Hongos/Levaduras Mycoplasmas Otras células

40. Contaminaciones Biológicas Efectos adversos sobre el metabolismo celular Pobre calidad de resultados experimentales Pérdida de células valiosas Pérdida de productos celulares (por ejemplo producción de antígenos para vacunas, etc.) Pérdida de tiempo, dinero y esfuerzo

41. Bibliografía Alicia Rivelli , s/f. El cultivo celular. Instituto de Oncología “Ángel H. Roffo”. Dpto. Biología Celular