Methods Of Biochemical Analysis Vol 19 David Glick

Methods Of Biochemical Analysis Vol 19 David
Glick download
https://ebookbell.com/product/methods-of-biochemical-analysis-
vol-19-david-glick-4655352
Explore and download more ebooks at ebookbell.com

Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Methods Of Biochemical Analysis D Glick Ed
https://ebookbell.com/product/methods-of-biochemical-analysis-d-glick-
ed-4655346
Protein Purification Principles High Resolution Methods And
Applications Methods Of Biochemical Analysis 3rd Edition Janchrister
Janson
https://ebookbell.com/product/protein-purification-principles-high-
resolution-methods-and-applications-methods-of-biochemical-
analysis-3rd-edition-janchrister-janson-2116744
Methods Of Soil Analysis Part 2 Microbiological And Biochemical
Properties 12 Sssa Book Series 1st Edition Peter J Bottomley Editor
https://ebookbell.com/product/methods-of-soil-analysis-
part-2-microbiological-and-biochemical-properties-12-sssa-book-
series-1st-edition-peter-j-bottomley-editor-33633282
Methods Of It Project Management 4th Edition Jeffrey L Brewer
https://ebookbell.com/product/methods-of-it-project-management-4th-
edition-jeffrey-l-brewer-46805496

Methods Of Partial Deafness Treatment Henryk Skaryski Piotr H Skaryski
https://ebookbell.com/product/methods-of-partial-deafness-treatment-
henryk-skaryski-piotr-h-skaryski-47202830
Methods Of The Policy Process Taylor Francis Group
https://ebookbell.com/product/methods-of-the-policy-process-taylor-
francis-group-47203084
Methods Of Mathematical Physics Classical And Modern Alexey N
Karapetyants
https://ebookbell.com/product/methods-of-mathematical-physics-
classical-and-modern-alexey-n-karapetyants-47277812
Methods Of Molecular Quantum Mechanics An Introduction To Electronic
Molecular Structure Valerio Magnasco
https://ebookbell.com/product/methods-of-molecular-quantum-mechanics-
an-introduction-to-electronic-molecular-structure-valerio-
magnasco-47605688
Methods Of Strategic Trade Analysis Christopher Nelson
https://ebookbell.com/product/methods-of-strategic-trade-analysis-
christopher-nelson-48703628

METHODS OF
BIOCHEMICAL ANALYSIS
Edited by DAVID GLICK
Slanford Universily Medical School
Slanford, California
VOLUME 19
INTERSCIENCE PUBLISHERS a division of
John Wiley & Sons, Inc., New York 0 London 0 Sydney Toronto

METHODS OF BIOCHEMICAL ANALYSIS
Volume 19

Advisory Board
W. E. COHN, Oak Ridge National Laboratory, Tennessee
R. CONSDEN, The Canadian Red Cross Memorial Hospital, Taplow, Maidenhead,
Berkshire, England
J. GROSS, Department of Experimental Medicine and Cancer Research, Hebrew
University Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel
H. HOLTER, Carlsberg Laboratory, Copenhagen, Denmark
J. K. N. JONES, Department of Organic Chemistry, Queen’s University, Kingston,
C. G. KING, Institute of Nutrition Sciences, Columbia University, New York,
H. A. LARDY, Department of Biochemistry, University of Wisconsin, Madison
H. C. LICHSTEIN, Department of Microbiology, University of Cincinnati, Cin-
B. G. MALMSTRUM, Department of Biochemistry, University of Goteberg, Sweden
A. MEISTER, Department of Biochemistry, Cornell University Medical College,
0. MICKELSEN, Department of Food and Nutrition, Michigan State University,
J. ROC HE, Biochimie Gdndrale et Comparde, Collbge de France, Paris, France
A. TISELIUS, Institute of Biochemistry, University of Uppsala, Sweden
B. L. VALLEE, Biophysics Research Laboratory, Department of Biological Chemis-
D. D. VAN SLYKE, Brookhaven National Laboratory, Upton, Long Island, New
Ontario, Canada
New York
cinnati, Ohio
New York, New York
East Lansing, Michigan
try, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts,
York

METHODS OF
BIOCHEMICAL ANALYSIS
Edited by DAVID GLICK
Slanford Universily Medical School
Slanford, California
VOLUME 19
INTERSCIENCE PUBLISHERS a division of
John Wiley & Sons, Inc., New York 0 London 0 Sydney Toronto

The paper used in this book has a pH of 6.5 or higher. It has been used because the best
information now available indicates that this will contribute to its longevity.
Copyright
@ 1971, by John Wiley & Sons, Inc.
All Rights Reserved.
No part of this book may be reproduced by any means, nor
transmitted,
nor translated into a machine language without the written permission
of the publisher.
12 3 4 5 6 7 8 9 10
Library of Congress Catalog Card Number 547232
ISBN 0-471-307548
PRINTED IN THE UNITED STATES OF AMERICA

METHODS OF BIOCHEMICAL ANALYSIS VOLUME 19
PREFACE
Annual review volumes dealing with many different fields of science
have proved their value repeatedly and are now widely used and well
established. These reviews have been concerned primarily with the
results of the developing fields, rather than with the techniques and
methods employed, and they have served to keep the ever-expanding
scene within the view of the investigator, the applier, the teacher, and the
student.
It is particularly important that review services of this nature should
now be extended to cover methods and techniques, because it is becoming
increasingly difficult to keep abreast of the manifold experimental innova-
tions and improvements which constitute the limiting factor in many cases
for the growth of the experimental sciences. Concepts and vision of crea-
tive scientists far outrun that which can actually be attained in present
practice. Therefore an emphasis
on methodology and instrumentation
is a fundamental need in order for material achievement to keep in sight
of the advance of useful ideas.
The current volume is another in this series which is designed to try to
meet the need in the field of biochemical analysis. The topics to be
included are chemical, physical, microbiological, and if necessary, animal
assays, as well
as basic techniques and instrumentation for the determina-
tion of enzymes, vitamins, hormones, lipids, carbohydrates, proteins and
their products, minerals, antimetabolites, etc.
Certain chapters will deal with well-established methods or techniques
which have undergone sufficient improvement to merit recapitulation,
reappraisal, and new recommendations. Other chapters will be con-
cerned with essentially new approaches which bear promise of great use-
fulness. Relatively few subjects can be included in any single volume,
but
as they accumulate these volumes should comprise a self-modernizing
encyclopedia of methods of biochemical analysis. By judicious selection
of topics it is planned that most subjects of current importance will
receive treatment in these volumes.
The general plan followed in the organization of the individual chapters
is a discussion of the background and previous work, a critical evaluation
of the various approaches, and a presentation of the procedural details of
the method or methods recommended by the author. The presentation
V

vi PREFACE
of the experimental details is to be given in a manner that will furnish the
laboratory worker with the complete information required
to carry out
the analyses.
Within this comprehensive scheme the reader may note that the treat-
ments vary widely with respect to taste, style, and point of view.
It is
the Editor's policy to encourage individual expression in these presenta-
tions because it is stifling to originality and justifiably annoying to many
authors to submerge themselves in a standard mold. Scientific writing
need not be as dull and uniform
&s it too often is. In certain technical
details, a consistent pattern is followed
for the sake of convenience, as in
the form used for reference citations and indexing.
The success of the treatment of any topic will depend primarily on the
experience, critical ability, and capacity to communicate
of the author.
Those invited to prepare the respective chapters are scientists who either
have originated the methods they discuss
or have had intimate personal
experience with them.
It is the wish of the Advisory Board and the Editor to make this series
of volumes as useful
as possible and to this end suggestions will always be
welcome.
DAVID GLICK

METHODS OF BIOCHEMICAL ANALYSIS VOLUME 19
CONTENTS
Isoelectric Focusing in pH Gradients-A Technique
for Fractiona-
tion and Characterization
of Ampholytes. By Herman
Haglund, LKB-Produkter AB, Stockholm, Sweden..
.......
Mass Spectrometry in the Determination of Structure of Certain
Natural Products Containing Sugars.
By Stephen Hanessian,
Department
of Chemistry, University of Montreal, Quebec . .
The Determination of Carbohydrate in Biological Materials by Gas-
Liquid Chromatography.
By John R. Clamp, Tariq Bhatti,
and Robin
E. Chambers, Department of Medicine, University
of Bristol, England.. ............... : ..................
Activation Analysis of the Biological Trace Elements. By George W.
Leddicotte, Nuclear and Biological Sciences Division, Georgia
Institute
of Technology, Atlanta, Georgia. ................
Polarography of Proteins, Analytical Principles and Applications in
Biological and Clinical Chemistry.
By Jdb Homolka, Depart-
ment
of Clinical Biochemistry of the Faculty of Medicine,
Charles University, Prague, Czechoslovakia.
...............
Author Index ...............................................
Subject Index. ..............................................
Cumulative Index, Volumes 1-19 and Supplemental Volume. .
1
105
229
345
435
557
593
613
Vii

METHODS OF BIOCIIEMICAL ANALYSIS VOLUME 19
Isoelectric Focusing in pH Gradients
-A Technique for Fractionation
and Characterization of Ampholytes
HERMAN HAGLUND, LKB-Produkter AB, Stockholm, Sweden
I. Introduction ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
3.
Principle.. . . . .
4. The pH-Gradient ............................................ 6
A. Natural pH-Gradients. . . . .
B. Artificial pH-Gradients.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . 7
11. History ...................................
B. Artificial pH-Gradients.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2. Recent Developments.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B. Gel Electrofocusing.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
C. Zone Convection Electrofocusing. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9
10
10
A. Natural pH-Gradients.. . . ..........
111. The Natural pH-Gradient. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1. Introduction. .
2. Properties of the Natural DH-Gradient. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
K.
L.
M.
N.
0.
P.
Isoelectric and Isoionic Point. . . . .
Isoelectric Point and Isoionic Point of a Focused Zone. . . . . .
Requirements of the Natural pH-Gradient . .
Protolytic Properties of the Ampholytes. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
TheLaw of pH hfonotony ...............................
Water, an Ampholyte in the pH-Gradient ...........
Titration Curve. . . . . . . , . . . . . . . . . . . .
Resolving Power. . . . .
Isoelectric Point Me
Physical Properties of the Ampholytes.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
12
13
14
14
16
16
17
18
19
20
21
21
22
23
24
25

2 HERMAN HAQLUND
Q . pH Ranges Remote from the Neutral Point ................
R . Dialysis and Gel Filtration ...............................
IV . Stabilization Against Convection ..............
1 . Equipment .................................................
V . Density Gradient Electrofocusing .............................
1 . Introduction ................... ..........................
2 . The Ampholine Carrier Ampholytes .................
3 . Density Gradient . . ......................................
4 . The Sample Solutio ......................................
5 . LKB 8100 Ampholine Equipment ..............................
6 . A Typical Experiment ...................................
7 . Polarity of Applied Vo , Conductivity Gradient ..............
8 . Time Needed to Reach Equilibrium, Applied Voltage .............
10 . Emptying the Column ........................................
12 . Measurement of the Result ....................................
VI . Supplementary Instructions for Sucrose Density Electrofocusing .......
1 . Choice of pH-Gradient .......................................
2 . How to Produce Gradients Covering a Narrow pH Range .........
3 . Carrier Ampholytes in Ampholine to Cover the Gap to pH 7 ......
4 . pH-Gradients Below 3 and Above 10 ...........................
5 . Gradient Mixer ..............................................
6 . Solutions for the Density Gradient .............................
A . The Density Gradient Prepared by Gradient Mixer .........
B . Other Types of Density Gradient .........................
8 . Amount of Sample That Can Be Electrofocused .................
9 . Choice of Temperature .......................................
11 . Determination of pH and ..............................
12 . Remixing of Separated Zones During Elution ....................
13 . Restoring a Faulty Density Gradient With Skew Zones ........
14 . Removal of Carrier Ampholytes from Protein Fractions . .
15 . Electrofocusing in Sucrose Gradient with Voltage Applied During
Elution
.......... .......................................
B . Preparing the Column ...................................
C . Running the Apparatus, Elution With Potential On .........
VII . Gel Electrofocusing ...............................................
1 . Introduction ................................................
A . Principle of Gel Electrofocusing ...........................
B . Advantages ............................................
C . Disadvantages ..........................................
D . Summary of Developments ....................
E . Two Main Approaches-Thin Layer and Tube ..............
F . Simple Equipment ......................................
G . Profile of Separation .....................................
H . Recovery of the Fractionated Sample ......................
I . PI-Measurement ........................................
..................
.......
9 . Local Overheating ............................................
11 . Measurement of pH ..........................................
13 . Survey of Auxiliary Equipment ................................
7 . Addition of Sample ........
10 . Voltage-Maximum Powe ..............................
...............................
.......................................
29
30
31
32
33
33
36
37
38
39
39
42
42
43
43
43
44
45
45
45
45
48
48
49
51
52
53
53
54
54
55
56
57
.
58
59
60
60
62
63
64
64
64
64
65
65
65
66
66
67
67

J.
K.
L.
M.
N.
ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 3
Polyacrylamide Gel. .................................... 67
Staining ............................................... 68
Application of Sample.. ................................. 68
Cooling ................................................ 69
Thin Layers and Tubes.. ................................ 69
2. Thin Layer Gel Electrofocusing.. ..............................
B. Method of Leaback and Rutter.. .........................
3. Gel Electrofocusing in Tub
A. Method of Fawcett
. .
C. Method of Riley and
70
75
A. Method of Awdeh, Williamson and Askonas. ....
B. Method of Wrigley.. ..........
4. Immunoelectrofocusing.. .............
5. Gel Electrofocusing Combined With Gel Electrophoresis.. ........ 87
A. Introduction ........................................... 87
94
B. Apparatus and Method of Dale and Latner ...... 88
VIII. Zone Convection Electrofocusina. .................................. -
Introduction ................................................ 94
Description of the Apparatus.. ................................ 94
Operation ................................................... 95
A. Filling the Cell.. ....................................... 95
B. Inserting the Sample .................................... 96
C. Running ............................................... 97
Fractionation-of Carrier Ampholytes in Zone Convection Apparatus 98
IX. Conclusions ...................................................... 99
Acknowledgements .............................................. 100
References ....................................................... 100
I. INTRODUCTION
1. Main Applications in Isoelectric Focusing
Isoelectric focusing has rapidly become an important tool for many
researchers, mainly in biochemistry and related sciences. The two main
applications
of isoelectric focusing are :
1. Analytical or preparative separation of ampholytes, especially pro-
teins, according to isoelectric point.
2. Characterization of ampholytes, especially proteins, by determin-
ing isoelectric point. This can be done simply and exactly in
a single
experiment.
The technique is characterized by very high analytical resolution and
by simplicity of apparatus and method. Electrofocusing
has been applied
to many types
of proteins. Proteins with as small a difference as 0.02 pH
units at the isoelectric point have been successfully separated.
The capabilities
of measuring isoelectric points are outstanding when
compared with the previously available method of free electrophoresis.

4 HERMAN HAGLUND
Limiting aspects of the electrofocusing method are:
1. The technique requires salt-free solutions. This can cause precipi-
tation of sample proteins. However, the carrier ampholytes-Ampholine
is the trade name-a necessity in electrofocusing, contribute to the
ionic properties of the solution in such a way that the lack of salts is
counteracted.
2. The components of a sample are compelled to remain at their iso-
electric point. This feature means that the technique should not be used
with proteins which become insoluble or denatured at the isoelectric point.
2. Simplified Basic Description
Every protein or other ampholyte has a so-called isoelectric point, PI,
which is a pH value at which it may be dissolved to yield a net charge of
zero.
If the protein is added to a solution with a higher pH (more basic)
than the
PI, it loses protons and becomes negatively charged. Con-
versely, if the protein is in surroundings with a lower pH (more acidic)
than the
PI, it will capture protons and become positively charged.
In an electric field, positively charged particles migrate towards the
cathode (the negative pole) and negatively charged particles towards the
anode (the positive pole).
In electrophoresis
a constant pH, achieved by a buffer, is usually used.
If, in contrast to this, one arranges a buffer with a varying pH, that is,
increasing from one end to the other, a pH-gradient is obtained. Such a
gradient has always the lowest pH value at the anode and the highest
pH at the cathode.
When a sample of proteins with isoelectric points within the pH range
of the gradient is added to the pH-gradient, the protein molecules will
obtain different charges. The charge of every individual protein will be
determined by the
PI for that protein and the pH corresponding to the
position where the protein is located. Applying
a voltage across such a
system results in each protein molecule migrating toward the pH value
in the system where it is isoelectric, that is, where its net charge is zero.
The proteins are thus exactly focused at the point where the pH is equal
to the
PI.
For a long time the obstacle to the development of the electrofocusing
technique was the difficulty in obtaining stable pH-gradients. However,
Svensson
(1,2,3,4,5,6) and Vesterberg (7,8) found that when a mixture
of low molecular weight carrier ampholytes, for example, Ampholine
chemicals, are exposed to a voltage in a convection-free water solution,
a pH-gradient is formed, created by the current itself. When large
molecular weight ampholytes such
as proteins are inserted as a sample

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 5
Cathode(-)
II
increasing 9
U
pH-values
Anode (t)
Figure 1. Three proteins, marked PI,, PI*, and pIa, schematically electrofocused
in
a column. Each of the three protein components is negatively charged above its
respective point and positively charged beneath. For that reason it will move in the
electric field until the position in the column is reached where the pH
of the pH-
gradient is the same as the isoelectric point for that particular protein.
in such a pH-gradient, they will concentrate in narrow zones. The focus-
ing will occur at the isoelectric point of the protein. The isoelectric point
is relative and characteristic for each protein.
This process is illustrated in Figure
1, which schematically shows how
three proteins, marked (pII), (pI2) and (pIa), are focused in a column.
Diffusion counteracts the electrofocusing.
As the diffusion coefficient is
inversely proportional to the molecular weight, it
is understandable that
better focusing
is obtained with higher molecular weight proteins.
3. Principle
The situation can be summarized as follows : Isoelectric analysis, focus-
ing, and fractionation are obtained by imposing a d.c. potential
on an
electrolyte system in which the pH steadily increases from the anode to
the cathode. Provided that the pH-gradient is sufficiently stable for the
duration of an experiment, ampholytes, such
as proteins and peptides,
present in the electrolyte system will be repelled by both electrodes.

6 HERMAN HAOLUND
Each ampholyte species Will collect at the place in the gradient where
the pH of the gradient is equal to the isoelectric point of the species.
This collecting
or focusing is caused by the electric field; thus the name
isoelectric focusing.
A necessary prerequisite is that the electrolyte sys-
tem is stabilized against uncontrolled convection and against remixing
of focused ampholytes.
4. The pH-Gradient
For the practical use of electrofocusing it must be possible to arrange
a pH-gradient with suitable properties. The gradient should comprise
the desired pH range and other parameters of importance as slope, and
conductivity. The pH-gradient may be achieved in two different ways.
A. NATURAL PH-GRADIENTS
Natural pH-gradients are located and maintained by the electric cur-
rent itself. The following is a simplified explanation of the natural
pH-gradient.
Suppose that
a large variety of low molecular weight ampholytes are
dissolved in the electrolyte system.
A mixture of peptides can be used as
an example. This mixture represents a variety of isoelectric points dis-
tributed over the pH interval corresponding to the desired pH-gradient.
When the electric current is turned on, the different ampholytes start to
move, the movement depending on the charge of each individual ampho-
lyte. The ampholyte which
is most acidic (i.e., has lowest isoelectric
point, PI) will migrate to the anode. There
it will collect in its isoelectric
(zero net charge) stage and, due to
a certain buffering capacity, give the
surrounding solution a pH corresponding to the
PI. The ampholyte with
the acidity closest to the most acidic one (i.e., with second lowest pIj
also migrates towards the anode. However,
it cannot pass through the
region already occupied by the
first ampholyte because its own isoelectric
point would be passed and its molecules would then become oppositely
charged. The second ampholyte will form
a layer close behind the region
of the
first ampholyte and there define a pH equal to its PI. The third
ampholyte has
a PI slightly higher than those of its predecessors. It mi-
grates close to the second one and remains there. The fourth, fifth and
sixth arrive and queue up in the correct order. Finally the whole interval
between the electrodes
is occupied by a series of ampholytes with PI
ascending from anode to cathode, thus creating a pH-gradient defined in
each point by carrier ampholytes which are
in their isoelectric states.
Each site along the gradient has
its pH determined by the pH of the
ampholyte at that point The profile
of the gradient is determined by

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 7
the number of the ampholytes, their buffering capacity, relative amounts
and isoelectric points. The pH-gradient reaches
a stable equilibrium if
the system is stabilized against convection and other movements of the
liquid which cause remixing. This is usually achieved by means of
a den-
sity gradient technique
or gel stabilization, as will be described later on.
B. ARTIFICAL PH-GRADIENTS
Artificial pH-gradients can be obtained by arranging buffer solutions
of different pH in series so that they can diffuse into each other. This
pH-gradient is not in equilibrium, but changes continuously during an
experiment due to diffusion and electrophoretic migration. Such
a pH-
gradient has been named
artificial (9,lO). However, this article discusses
mainly those systems with natural pH-gradients.
11. HISTORY
“Isoelectric focusing” and “electrofocusing” are names that have been
accepted, and in current use, since
1967. Before that time the technique
was called isoelectric separation, isoelectric fractionation, isoelectric con-
densation, isoelectric analysis and focusing electrophoresis,
as well as
stationary electrolysis. Terms such as “density gradient electrofocusing”
or “gel electrofocusing” indicate the medium in which the experiments
are carried out.
1. Early Achievements
The idea of isoelectric fractionation of ampholytes has been known for
a long time and was described in many articles before
a technique became
available for practical work. The difficulties which delayed development
and application were technical. In particular,
it was difficult to achieve a
stable pH-gradient and prevent convection in the electrolyte system.
In
1920 two Japanese chemists, Ikeda and Suzuki (ll), were granted a
patent on
a method of producing glutamic acid from a hydrolysate of
plant proteins. The mixture of amino acids in the hydrolysate was elec-
trolysed in
a rectangular three-chamber apparatus, the chambers of which
were separated by membrane walls. After the inorganic salts had collected
close to the electrodes it was found that the amino acids had become
coarsely separated in groups. The most acidic, glutamic acid, had be-
come enriched close to the anode. The other amino acids consequently
tended to arrange themselves according
to their isoelectric points. Be-
cause of electro-osmosis and other convective forces, the separated amino
acids could not, in the boxlike apparatus of Ikeda and Suzuki, develop

8 HERMAN HAGLUND
into a stable and well-defined pH-gradient. The inventors, however, were
able to isolate glutamic acid in the form of glutamate bound to the metal
of the anode and thus to separate it from the other acids.
A. MULTICHAMBER DEVICES
Numerous multichamber devices in which the chambers were sepa-
rated by membranes to prevent convection have since been built and
described.
By increasing the number of chambers it became possible to
obtain
a finer separation, as well as to isolate other fractions than the
ones located closest to the electrodes. William and Waterman (12) de-
veloped
a theory for their 14-chamber apparatus and showed “that if the
substance sought
is an ampholyte, it may be concluded that the pH of
that portion of the solution which contains the substance in maximum
concentration approximates the isoelectric point of the substance, though,
at any pH greater
or less than that of the isoelectric point, the substance
will be ionized more strongly
as a base than as an acid, or vice versa,
and will therefore migrate toward the region
at which ionization as acid
and
as base are equal, namely the region of its isoelectric point.” Their
apparatus is sketched in Figure
2.
The principle was later used for separation work, mostly for ampho-
lytes
of low molecular weight. Williams (13) applied it to vitamins and
to growth factors. Du Vigneand
et al. (14) used multichambers to isolate
vasopressin and oxytocin hormones from pituitary gland extract.
”U” SHAPED HARD RUB
PARCHMENT PAPE
SOFT RUBBER
Figure 2. The multichamber apparatus described by Williams and Waterman in
1929 (12). They described their electrofocusing experiments as electrodialyzing in a
multiple compartment cell. After electrolysis the contents
of the compartments were
separately removed and their pH determined. The solutions were aasayed for the
constituents.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 9
Tiselius (15) described the focusing of ampholytes at their respective
isoelectric points
as a dynamic equilibrium between electrophoretic mi-
gration and diffusion. He used the method on a mixture of egg albumin
and hemoglobin. Separation
was poorer than by electrophoresis alone.
Synge
(16) and Sanger and Tuppy (17) used isoelectric focusing for a
rough separation of amino acids. This apparatus had four chambers.
Separation
of proteins and polypeptides in such multichambers has
been more successful than separation of amino acids. The reason for this
is that the former molecules retain enough charge in the neighborhood of
their
PI to become separated. Many amino acids, however, are almost
without charge near their
PI. This means they are unable to migrate by
electrophoresis to a sharply defined
PI. Another limiting factor was the
difficulty of achieving uniform field strength between the electrodes while
using the very high voltages required to give even moderate resolution.
B. ARTIFICAL PH-GRADIENTS
Isoelectric focusing made great progress through Iiolin’s work
(18,19,
20,lO).
He pointed out that uniform field strength depended on the use
of electrolytes with high and uniform conductivity. He also pointed out
the necessity of having
a pH-gradient of sufficient buffering ability.
Kolin
(10) separated proteins. He used columns stabilized with a su-
crose density gradient. This stabilized against remixing and convection.
The method has considerable advantages over the use of a capillary sys-
tem, avoiding electro-osmosis and protein loss by adsorption. Kolin
allowed two buffer solutions of different pH to diffuse into each other.
The pH-gradient arose as the buffers diffused into the intermediate liquid
zone. Such gradients were later called “artificial pH-gradients” by
Svensson
(9). Since buffers are electrolytes, such a pH-gradient is un-
stable in an electric field. This is due to the electrolytic migration of
buffer ions. Thus if substances are to be separated by means of this type
of gradient, they must move more rapidly than the buffer ions. Kolin
(10)
achieved fractionations of considerable sharpness. However, the zones lay
very close together. Thus
it was difficult to fractionate them separately.
Many other publications report the production and use of pH-gradi-
ents. Hoch and Barr
(21) and McDonald and Williamson (22) used such
pH-gradients in electrophoresis using paper strips. They had difficulties
with electro-osmosis and evaporation. Ailaher
et al. (23) also used a
similar method, with limited success. Tuttle (24) described successful
analytical separations
of hemoglobin.
There was one shortcoming in all these methods-poor reproducibility
of the pH-gradient. Kolin
(10) considered in 1958 that the great problem

10 HERMAN HAOLUND
to be solved was how to stabilize the pH-gradient against changes due to
the passage of current.
2. Recent Developments
A. NATURAL PH-GRADIENTS
Svensson’s pioneering work on natural pH-gradients made the develop-
ment of electrofocusing possible. He performed brilliant theoretical and
practical work on these problems in the early
1960’s. This work pro-
vided the necessary foundation for subsequent successful developments.
In
a series of fundamental reports, Svensson unravelled the problems of
natural pH-gradients
(1,2,3). He defined the theoretical requirements of
electrolytes for isoelectric focusing, taking into account the requirements
defined by Kolin
(10). The electrolytes must be ampholytes with certain
properties. They must retain good conductivity at the isoelectric point,
and have sufficient buffering power there. Svensson showed that the two
pK values of the ampholyte, lying on either side of the
PI, should be
close together, not more than one and
a half pH units apart. Svensson
and his collaborators also checked the catalogs of chemical supply houses
in an endeavor to find substances which would meet the criteria he had
drawn up. However he found nothing suitable, least of all in the pH
range
5-8. Svensson then made experiments with peptide mixtures from
the hydrolysis of hemoglobin
(3). These peptide mixtures enabled him to
confirm his theoretical arguments. He also established that the method
allowed separation with
a promising resolution. Svensson used sucrose
density gradients
as a stabilizing medium against convection in his
experiments.
Peptides had obvious disadvantages
as carrier ampholytes. However,
this fact encouraged Vesterberg to conduct
a systematic search for a
synthetic method of producing carrier ampholytes with the desired prop-
erties. He succeeded in synthetizing
a series of aliphatic aminocarboxyl
acids which satisfied the requirements defined by Svensson
(7,25,26). With
this development he found the key to the isoelectric focusing technique
as a practical research tool. Vesterberg’s synthesis has also made possible
the industrial manufacture of the necessary carrier ampholytes. These are
now being produced under the name of ((Ampholine” chemicals.*
B. GEL ELECTROFOCUSINQ
Recently isoelectric focusing has also been applied in gels with great
success. Wrigley
(27,28,29) reported highly resolved separations with
* Marketed by LKB-Produkter AB, Fack S-16125 BROMMA I, Sweden.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 11
polyacrylamide as the stabilizing medium. He employed conventional
disc electrophoresis apparatus
for his experiments. Later, Riley et al. (30)
also successfully used the focusing method in gels. Fawcett (31,32) re-
ported isoelectric focusing with polyacrylamide as the stabilizer against
convection. Dale and Latner
(33,34,35) and Leaback and Ruttcr (36,37,
38)
performed gel isoelectric focusing on thin layers of polyacrylamide in
a specially constructed apparatus. Awdeh, Williamson and Askonas (39)
have published a description of very simple special gel electrofocusing
equipment and have also reported high analytical resolution.
In all electrofocusing, some method must be used to stabilize the liquid
against convection currents. The usual methods employ sucrose (density
gradient) or polyacrylamide (gel). These substances are present in much
larger quantities than the actual substance being tested. This always
involves the risk of disturbances. Sucrose must be removed by dialysis
at the end of the fractionation. It is also difficult to separate the protein
from the polyacrylamide.
C. ZONE CONVECTION ELECTROFOCUSING
A great advance in the equipment for isoelectric focusing has recently
been made by Valmet
(40). He has described a new principle for electro-
focusing called
zone convection electrofocusing. In this technique the sta-
bilizing against convection does not call for any capillary system, density
gradient
or membranes.
One form of Valmet’s apparatus consists of
a trough and a lid which
are both corrugated. The corrugations mate when the lid is lowered onto
the trough, leaving
a continuous gap. The solution of carrier ampholytes
fills the gap, forming
a horizontal convoluted layer. When a voltage is
applied to the ends of the layer, a current passes. Because cooling is
applied from the outside, a temperature gradient arises between the
middle
of the layer of ampholytes and the walls containing it, that is,
the lid above it and the trough beneath it.
A density gradient
is created at first. This is due to “thermal dif-
fusion”-dissolved molecules of proteins and ampholytes tend to migrate
to the cooler walls. This means that a self-stabilizing density gradient is
located in each fold early in the experiment. After a time, each protein
has migrated towards its isoelectric point, and perhaps reached it. Focused
in this way, the proteins thus contribute to the density gradient and re-
inforce it. This self-stabilizing system has turned out very fruitful for
both analytical and preparative focusing. Valmet’s technique has the
following major advantages
:
1. There are no foreign additives, such as sugar or gel, used to sta-
bilize against convection.

12 HERMAN HAGLUND
2. If a protein becomes insoluble at its isoelectric point, the resulting
precipitate does not disturb the separation to the same extent
as during
electrofocusing in a column.
Rose
(41) reported an apparatus based on zone convection electro-
focusing.
Its purpose was preparatory separation or treatment prior to
column electrofocusing.
Stabilization by using rotating tubes has been described by Hjerten
(42). His apparatus for free electrophoresis was used. Too little is known
about the capacity and resolution of his method to make an evaluation
possible. He has, however, reported good results.
Further varieties of apparatus based on the principle of self-stabiliza-
tion may be expected in the near future.
111. THE NATURAL pH-GRADIENT
1. Introduction
The aim of the following sections is to serve as a guide for practical
applications of electrofocusing and for practical understanding of the
method. Those who seek a treatment of the theoretical background are
advised to read the fundamental works of Svensson (Rilbe*) and Vester-
berg
(1-8,25,26). The following pages present mainly a summary of the
conclusions reached in their work and some practical consequences
thereof.
2.
Properties of the Natural pH-Gradient
The natural pH-gradient is created by the current itself, if stabilized
against convections.
It is characterized by complete stability for a very
long time. Every part of the gradient has a specific carrier ampholyte
at its isoelectric state, brought and located there by the action of the
current. They are lined up in order according to isoelectric point. The
pH in every part of the gradient is defined by the buffering properties of
the specific isoelectric carrier ampholyte located in that part.
A. ISOELECTRIC AND ISOIONIC POINT
An ampholyte is characterized by having more than one protolytic
group, and by having protolytic groups of both acidic and basic nature
in each molecule. An ampholyte molecule can be specified in terms of the
pK values of these protolytic groups.
There are two concepts which are intimately related to ampholytes-
* In 1968 H. Svensson changed his surname to Rilbe.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 13
the isoelectric point, PI, and the isoionic point. The isoelectric point is
the pH where the electric mobility is zero. The isoionic point of an
ampholyte is the pH where anions and cations are present in equal con-
centrations, i.e., the ampholyte has zero electric charge
(2,46). The iso-
electric and isoionic points usually lie very close together,
so that the
difference between them is insignificant. However, at the isoelectric point
the concentrations of the cationic and anionic forms of the ampholyte
can be different since the mobilities of the two ions can be different.
The pH of
a dilute solution of a pure ampholyte in pure water is not
exactly but approximately near the isoelectric point. Consider as a practi-
cal example an ampholyte isoelectric at pH
3. The solution is lO-3M
with respect to the hydrogen ion concentration. Since the hydroxyl ion
content is negligible, the only source for negative ions is from the ampho-
lyte. Hence the ampholyte
is ionized so that more negative than positive
ions are brought into solution to balance the hydrogen ions.
As a result,
the dilute ampholyte solution cannot be isoionic, since this state is charac-
terized by the same concentration of ions in the positive and the negative
states. When the ampholyte concentration is increased, the pH of the
solution will be closer to the isoionic point because the hydrogen ion con-
centration in the given example will have a decreased influence.
It is
evident that the influence of the ion concentration of dissociated water
molecules can be neglected in the pH range
3-11 when reasonable amounts
of ampholytes are dissolved
(0.5-1 % w/w).
Experimentally, the isoionic point is defined as the pH of an ampho-
lyte solution which will not change when the concentration is increased
by dissolving more of the pure ampholyte.
The mathematical treatment of the isoelectric conditions (the pH of
zero mobility) for an ampholyte is a much more intricate problem than
that of the isoionic state. Since the difference is without practical im-
portance, the isoionic state is chosen for the discussions below. Therefore
no distinction
is made in the following pages between “isoelectric” and
“isoionic” point. “Isoelectric point” will be used also
for isoionic points
and the symbol
PI will be used for both.
B. ISOELECTRIC POINT AND ISOIONIC POINT OF A FOCUSED ZONE
The isoionic point, for a protein solution not too low in concentration,
is experimentally defined as that pH which does not change when
a small
amount of pure protein is added to the solution
(46). This definition also
applies to a protein which has been focused isoelectrically
(7,26). If more
protein is added to the zone, the pH does not change. The buffering at
the site of focusing
is considered to be completely dominated by the

14 HERMAN HAGLUND
carrier ampholyte, the protein zone being of negligible importance for
the pH there. In other words, the isoionic point
is represented by the
pH at the point of maximum protein zone concentration. However, for
the carrier ampholytes in the natural pH-gradient, the maximum con-
centration represents their isoelectric value. Each carrier ampholyte zone
is partly mixed with the adjacent zones and can thus never be completely
pure. The pH of the carrier ampholyte zone
is dependent on the carrier
ampholyte concentration, contrary to the condition for the focused pro-
tein zone of the sample. These conditions necessitate that the location of
maximum concentration in the pH-gradient will not be affected by forma-
tion of complexes between the protein and the carrier ampholytes, if
such
occurs.
C. REQUIREMENTS OF THE NATURAL PH-GRADIENT
The pH-gradient must have sufficient
bufer capacity to be able to
dictate
a pH-gradient, so that the buffering properties of the sample
proteins
or other sample ampholytes do not change the course of the
pH-gradient. Also, the carrier ampholytes must be sufficiently soluble in
water to reach the necessary buffering capacity.
The
conductance must be large enough to permit a certain electric cur-
rent to
flow through the system. This means that each ampholyte must
conduct and have
a buffering capacity at its PI. Moreover, the ampho-
lytes must all have about the same conductivity, that
is, the conduc-
tivity must be fairly uniform throughout the whole system.
If one part
of the gradient has significantly less conductivity,
a large part of the
potential drop will take place there. Consequently, other parts of the
gradient will be subjected to
a field strength too low to maintain the
gradient
or to enable the electrophoretic transport of the components
which have to be focused
at sites along the gradient. The pH-gradient
must be
stable long enough for the focusing to take place.
The physical and chemical properties of the pH-gradient have to be
such that they do not interfere with the components of the sample speci-
men, thus affecting their biological and chemical identity. Finally, the
physical and chemical properties of the ampholytes should not interfere
with conventional methods of identifying and recording the protein
zones. This means that the carrier ampholytes must not absorb in the
ultraviolet
at 280 nm, for example, since recording protein fractions by
photometry
at 280 nm is a well-established practice.
D. PROTOLYTIC PROPERTIES OF THE AMPHOLYTES
Consider a simple diprotic ampholyte where ampho is the zwitterionic
and unprotolysed form, and amph-, and amph+ are the anionic and

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 15
cationic forms of the ampholyte respectively. Camphot Camph- and Camph,
are the molar concentrations and Camph the total concentration of ionic
and uncharged forms. Two equilibria will occur in the solution:
ampho amph- + H+ (1)
ampho + H+ 5 amph, (2)
Not considering activity coefficients, the law of mass action gives:
Using logarithms and substituting
- log CH+ for pH and - log K+ and
- log K- for PI(+ and pK- respectively, we obtain:
Camph+ = camph, x 10(pK+-pH)
camph-
= Camph, x 10(pH-pK-)
(5)
(6)
PK- + PK+
2
The isoionic point is PI = (7)
we can eliminate Camph, and obtain:
If the degree of protolysis is defined as
Camph, + Csmph-
Camph
a!=
and PI = pH in the isoionic state, the degree of protolysis will be
2
The electric charge of the ampholyte due to the protolysis will be a mean.

16 HERMAN HAGLUND
The above equations assume the use of diprotic ampholytes. They can
however be extended to polyprotic ampholytes, in which case
PI<+ and
pK- stand for the protolysis constants nearest to the
PI of the ampholyte,
one on the acid side (PI<+) and the other on the basic side (pIL.), pro-
vided the other protolytic constants are remote enough.
E. THE LAW OF PH MONOTONY
The law of pH monotony was formulated by Svensson in 1967. It
states that when a natural pH-gradient is created by an electric current,
it is positive throughout. In other words, the pH increases all the way
from the anode to the cathode. This law can be exemplified by con-
sidering a pair of ampholytes in the same system, e.g., aspartic acid
(PI
= 2.77) and glutamic acid (PI = 3.22). Both acids carry consider-
able proportions
of electric charged species even in the neighborhood of
their isoelectric points. However, they can never become completely sepa-
rated by the electric current. A zone of pure water cannot arise between
them. Each of them always contains a certain proportion of the other.
In order to separate glutamic acid and aspartic acid,
a third ampholyte
must be present with intermediate
PI. Another possibility is an electro-
lytic system, that is, a carrier ampholyte system, which can define a
pH-gradient even in the absence
of glutamic acid and aspartic acid.
The law
of pH monotony can be expressed in another way: An electro-
lytic vacuum is not permissible in natural pH-gradients. This explains why
complete separation of proteins could not be achieved before introduction
of suitable carrier ampholytes.
The law has never been proved theoretically. However, thousands
of
experiments have demonstrated it empirically. There is only one place
where a zone
of pure water can arise. This is where water acts as a carrier
ampholyte covering the neutral zone lying between the most neutral of
the acid ampholytes and the most neutral of the basic ampholytes present.
F. WATER, AN AMPHOLYTE IN THE PH-GRADIENT
All the isoelectric fractionations previously described took place in
water. Thus they all contain the ampholyte water, which
is isoelectric at
pH
7. An ampholyte with PI less than 7 can thus be completely sepa-
rated from another with
PI larger than 7. A zone of pure water will be
created between them. But
if a pair of ampholytes both have a PI lying
on the same side
of pH 7, that is, both are less than 7, or both exceed 7,
they can never be separated unless other ampholytes are present. Water
as an ampholyte furthermore has the drawback
of having an extremely
low conductivity
at its isoelectric point pH 7.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 17
G. CONDUCTIVITY
Under the conditions prevailing during electrofocusing, water may be
assumed to have its theoretical conductivity, i.e.
X, = 1.0 X lo-* ohm-l cm
The field strength may be designated by the equation
E = I/X. Even
at low current densities such as
lop4 A/cm2, the field strength in pure
water is
10,000 V/cm. The Joule effect produces heat proportional to the
square of the current divided by the conductivity. This is equivalent to
the production of one watt per om3. Thus it is obvious that if there is
a
region of pure water in the system, it will absorb practically the entire
applied voltage. A zone of pure water offers such high resistance that
it
greatly reduces the current. As a result, in the zones where there are
conducting electrolytes, the field strength is almost zero, making it
impossible for focusing effects and electrolytic transport to be achieved.
(14)
The extent of protolysis of an ampholyte can be written
(11)
where Camph, is the concentration of positive ions, Camph- is the concen-
tration of the negative ions, and
Camph is the total concentration of zwit-
terions and undissociated ampholyte. As pointed out on page
15, the
extent of protolysis at the isoionic point may be expressed as follows:
Camph, + camph-
Camph
&=
Since PI is always larger than PI<+, the second term in the denominator
will always be larger than unity. This means that the upper limit for
a is
equal to
3. Obviously a becomes larger as the difference between pK+
and the isoionic point diminishes. The conductivity of an ampholyte is
directly dependent of the extent of its ionization. This means that the
condition for high conductivity at the isoionic and isoelectric point is
that the pair of
PI< values lying on either side of the PI and nearest to
it are close together.
Svensson
(2) has calculated the conductivities of several ampholytes
of low molecular weight. We refer the reader to his works. For example,
histidine has
PI = 7.S1, PI - PI<+ = 1.50, and conductivity x = 158
mhos cm-I . At this pH, the contribution from the conductivity of
the water is zero. Another example is lysine, with PI = 9.96, PI - pK, =
0.79 and X(corr) = 2.162 mhos cm-I . lod6. Thus lysine has a consider-
ably larger conductivity at its isoelectric point than histidine. This results

18 HERMAN HAQLUND
from the difference between p1 and pK+ being smaller. At this pH the con-
ductivity of the water makes a small contribution-in this case
it is 17
mhos cm-' - Particularly in the neutral range it is difficult to find
ampholytes of low molecular weight having
a small difference between
PI and pK+, that is, satisfactory conductivity. In this range, the con-
ductivity of water also is insignificant.
H. BUFFERING CAPACITY OF THE CARRIER AMPHOLYTES
Everywhere in the pH-gradient there must be a sufficient buffering
capacity to prevent the protein components of the sample specimen from
affecting the pH. In other words, each carrier ampholyte must have suf-
ficient buffering capacity
at its isoelectric point.
If the charge Q is plotted against pH, the result is identical with the
titration curve of the ampholyte. The buffering capacity can thus be
expressed:
(15)
-- -dQ d(Carnph-/Carnph) - -d(carnph+/carnph)
d(PH) - d(PH) 4PH)
For PI = pH, Eqs. 15, 9 and 10 give
- dQ 2 log 10
d(pH) = 2 + 1o(PI-PK+)
The buffering capacity seems also to be a function of PI - pK+. Its
numerical value is largest for small differences between pK+ and the
isoelectric point.
As the difference between PI and pK+ increases, the
buffering capacity diminishes, linearly at first, and then exponentially.
0 1 2 3
pl - pK+
Figure 3. The buffering capacity of a carrier ampholyte as a function of PI - pK.
The intercept with the ordinate axis is the limiting buffering capacity. Also, when
PI
- pK is 1 pH unit, Q of the limiting capacity is still retained. The curves shows that
carrier ampholytes should have the property
of being isoelectric between two closely
spaced pK values (Svensson,
2).

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 19
+2
+1
0
-1
-2
024681012
Figure 4. Titration curves of glutamic acid, glycine, histidine, and lysine. The
three amino acids whose titration curves sharply cut the zero-charge-horizontal-line
also have
a net charge apart from zero in the vicinity of the pH where they cut the
zero line, i.e., the
PI. That means that they have buffering capacity and conductance
in the neighborhood of the isoelectric point and therefore are useful
aa carrier ampho-
lytes. Glycine, on the other hand, with its extended horizontal part
of the curve is
not suitable. (Svensson,
2.)
(See Fig. 3.) When PI - PI<+ = 2, there remains only & of the maxi-
mum buffering capacity.
It is evident that carrier ampholytes ought to
have a pair of pK values which lie as closely as possible to
PI. This con-
dition
is in agreement with the condition for high conductivity at the
isoelectric point. An ampholyte which has high conductivity at its iso-
electric point is also found to have good buffering capacity. The suit-
ability of a carrier ampholyte may be judged by the value of
PI - pK+
and the solubility in water.
I. TITRATION CURVE
Another way of judging the suitability of a carrier ampholyte is from
the titration curve giving the net charge conditions in the vicinity
of the
isoelectric point. Figure
4 shows the titration curves for glutamic acid,
glycine, histidine and lysine. An ampholyte will be
a suitable carrier if it
has a sharp isoelectric point. This condition is met when the slope is
sharp against the net-charge-zero-line in Figure
4. Glycine is obviously un-
suitable since it is isoelectric over
a pH interval of more than 3 pH units.

20 HERMAN HAGLUND
J. THE CARRIER AMPHOLYTES, IONIC STRENGTH AND
INFLUENCE ON SOLUBILITY
OF PROTEINS
The concept of ionic strength was devised by Debye and Hiickel (47)
in order to describe the electric double layer and the general structure
of the ionic cloud surrounding a dissolved particle.
It is given by
p = +zcz2
where C is molarity and Z the charge of the different ion species.
The ions under consideration are assumed to be freely moving and
charges of opposite sign are assumed not to be separated. The concept is
much used in connection with the electrophoresis of proteins. The solu-
bility of proteins depends partly on the ionic conditions of the environ-
ment. In salt solutions these ionic conditions can be discussed satisfactorily
with the ionic strength concept, but not in ampholyte solutions. In spite
of the fact that the ionic strength is low, the carrier ampholytes at their
isoelectric points contribute to the ionic cloud surrounding the dissolved
protein molecules. Thus they also contribute to the solubility and sta-
bility conditions
of the protein molecule.
The concept of ionic strength thus loses its significance in the natural
pH-gradient. However, at every point there exists a particular situation
with regard to charge, a situation which affects
a protein which may be
at that point. There are many examples of proteins which are insoluble
or become denatured in pure water, yet they show considerable solubility
in the pH-gradient and retain their biological identity there. Valmet
(48)
showed that the larger part of human gamma globulin could be retained
in solution at the respective isoelectric points in the natural pH-gradient,
if the concentration of the carrier ampholytes was maintained
at about
2%. At an ampholyte concentration of 1%, the solubility was too low.
The expression
PI - PI<+ for the carrier ampholytes obviously de-
scribes the ionic conditions in
a solution at and near the isoelectric point
of the ampholyte. Thus it might be usable when discussing the solubility
and stability of proteins in pH-gradients. The conductivity of the natural
pH-gradient is directly related to the expression
PI - pK+, and can
easily be determined.
If a pH-gradient is allowed to reach a stable state,
and its conductivity is plotted against the pH, this enables predictions
to be made for the proteins which are to be focused in the gradient.
By making use of this graph, it might be possible to gather empirical
knowledge about the stability and solubility conditions for proteins
existing there. This means that for carrier ampholytes the concept of
conductivity at the isoelectric point could be used in
a similar way as
the concept of ionic strength for salt solutions.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 21
K. SAMPLE PROTEIN COMPONENTS
As established earlier in this paper, two carrier ampholytes cannot be
separated completely on a pH-gradient unless there is a third one present
with intermediate
PI However, it is important to state that this is only
valid for the carrier ampholytes and not for the sample proteins.
TWO
protein components can be separated completely without the need of a
carrier ampholyte having an intermediate PI because the carrier ampho-
lytes show overlapping concentration distributions. This is due to the
fact that the protein components are in minor concentration compared
to the carrier ampholytes. Thus they have no influence on the course of
the pH-gradient.
L. RESOLVING POWER
The resolving power of a pH-gradient depends on the field strength
created by the applied voltage, the shallowness of the pH-gradient
dpH/dx, the charge of the ampholyte to be resolved in the vicinity of
its isoelectric point, and the diffusion
D of the resolved ampholyte. This
latter condition can be expressed as the slope of the pH mobility curve
dU/dpH: Svensson
(1) developed the following expression for a focused
zone
:
$4 dU dpH
xi=(&) p=--x-
dpH dx
where xi denotes the width of the Gaussian distribution of the focused
zone measured from the top of the distribution of the focused ampholyte
to the inflection point (one standard deviation). The discussion of the
resolving power is now reduced to the intricate question what is meant
by ‘(two fully resolved peaks.” Svensson
(4) has published a paper on the
subject. Vesterberg has also discussed the problem in several publications.
Consider two identical Gaussian curves representing the concentration
contribution of equal amounts of two very similar proteins
at a distance
Ax from each other. Mathematical analysis shows that the run of these
two curves has only one maximum if
Ax is smaller than two standard
deviations, that is,
2xi. The distance is thus insufficient for a visible
separation of the proteins. For
Ax larger than 2xi the summation of the
two distribution curves shows two maxima and between them one mini-
mum. In this case one can speak about a detectable separation between
the two proteins, i.e., two focused protein zones in electrofocusing.
As
the value of Ax increases, the depth of the minimum between the peaks
increases, at
first slowly then more rapidly. For Ax = 3.07~~ the mini-

22 HERMAN HAGLUND
mum has an ordinate of e-$$ = 0.61. This means that the concentration
minimum between the two separated peaks is
61 % of the two surround-
ing maxima.
If this is an acceptable criteria, one can calculate the
resolving power:
for
e--H is Ax = 3.07xi
thus
When this value is inserted in the equation for
xi along with the figures
derived from the separation of myoglobins obtained by Vesterberg and
Svensson
(7) and by Vesterberg (8)) a resolving power of 0.01 - 0.02 pH
units is obtained. This agrees well with experimentally obtained results.
The experimenter can influence the resolving power only by changing
the value of the pH-gradient dpH/dx and the field strength
E. The dif-
fusion constant D and the mobility -pH slope dU/dpH are fixed by the
chemical nature of the proteins to be separated.
For large proteins such
as viruses with small D values, the resolving power is better than for
small proteins such
as myoglobin. However, there is a third root de-
pendence at D on molecular size. The square root dependence of the
resolving power on D is shown in the equation above. Therefore there
is
only a sixth root dependence of molecular size on resolving power. Con-
sequently
a virus with the molecular weight 2 X lo7 can be expected to
be resolved only three times more effectively than
a small protein such as
myoglobin, provided that the slope dU/dpH is the same.
In experiments described by Vesterberg and Svensson
(7) separating
myoglobin
111 from myoglobin 113, Vesterberg (8) calculated the charge
of one of the two protein components at the PI value of the other one.
He arrived at
0.13 electrostatic unit. The stated PI difference was
0.06 pH unit.
M. ISOELECTRIC POINT MEASURED IN ELECTROFOCUSINQ
AND ELECTROPHORESIS, RESPECTIVELY
When comparing the PI values of proteins measured by isoelectric
focusing with those measured by the moving-boundary method, a differ-
ence is usually observed. Electrofocusing yields
a higher PI than the
moving-boundary method does.
It is well known that when the iso-
electric point is determinated by electrophoresis,
it is affected by buffer
ions, the ionic strength used, and some other factors. The moving-
boundary method can give very different
PI values when using various

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 23
buffers. When the values for proteins are extrapolated to an ionic strength
of zero, the
PI values are often higher compared with that obtained at
the ionic strength most often used, that is,
0.1. This may be explained
by the fact that proteins have
a tendency to form complexes with anions.
The anions of the buffer salt thus lower the isoelectric point.
A certain
concentration of some salt is always necessary in electrophoresis. In iso-
electric focusing, on the other hand, the experiments take place in an
environment which is devoid of all salts.
It is conceivable that weak complexes can form between proteins and
carrier ampholytes. There have been no reports of investigations on this
subject, which has however been discussed by Vesterberg and Svensson
(7) and Vesterberg (49,50). However, when the PI of proteins is deter-
mined by electrofocusing, the values seem to be independent of the kind
and concentration of the carrier ampholytes.
A protein focused at its
isoelectric point exists in
a surrounding of carrier ampholytes each of
which essentially lies at its isoelectric point. Thus it cannot be assumed
that a possible complex between a protein and the surrounding carrier
ampholytes would cause the isoelectric point to shift.
Electrofocusing makes
it possible to measure the PI of a protein with
great accuracy. This fundamental characteristic of
a protein can be de-
mined with better controlled and more stable conditions in the surround-
ings than in early experiments, where isoelectric points were measured
with the help
of the moving boundary method.
The
PI is temperature dependent. This dependence is not the same for
all ampholytes. Thus no systematic transference
of PI values from one
temperature to another can be made. The
PI should be obtained at the
same temperature for the electrofocusing experiment
as for the pH
measurement and this temperature has to be reported together with the
PI value.
N. THE SYNTHESIS OF CARRIER AMPHOLYTES
Svensson described in his theoretical work (2) experiments using vari-
ous commercially available substances
as carrier ampholytes. He had
particular difficulty in finding such substances in the pH range adjacent
to the neutral point. This was
a serious disadvantage of the method,
since many proteins have their isoelectric points in this neighborhood.
The situation improved when he succeeded in hydrolyzing hemoglobin
(3) to yield mixtures of peptides, which also contained carrier ampho-
lytes with the ability to define pH in the region around the neutral point.
However, this mixture
of peptides had serious shortcomings. The pep-
tides resembled the proteins which had to be separated. The conductivity

24 HERMAN HAGLUND
varied too much from one part of the pH-gradient to another. This led to
great variations in the amount of heat developed in different parts of the
system. These shortcomings in the carrier ampholytes available at that
time encouraged Vesterberg to make
a systematic study of the possi-
bilities of synthesizing ampholytes which would meet the requirements
theoretically established by Svensson. Vesterberg
(7,25) succeeded in
arriving at methods of synthesizing aliphatic polyamino-polycarboxyl
acids exhibiting many values of
PI< for the same type of molecule and
having great solubility in water. The methods are described by Vesterberg
(51) and in a patent (25). A mixture of many different polyethylene-
polyamines in aqueous solution was reacted with acrylic acid. This intro-
duced
a large number of carboxylic groups into the molecules. The
resultant mixture contained a very great variety of different compounds
with
a molecular weight between 300 and 1000, having different PI values
from about
3 to about 10. Moreover, the pH region of 4 to 7, which had
caused
so much trouble earlier, was covered by a very large number of
compounds.
This ampholyte system has great advantages in comparison with all
the groups of substances tested earlier, and fulfilled all the requirements
of good carrier ampholytes according
to the criteria put forward by
Svensson. The properties are partly due to
a suitable distribution of the
pK values
(51). The carrier ampholytes may be characterized by the
following general formula:
.---CH-N-(CHz)z-N-CH*.--
I
(CJd. R
Nk,
z=2or3
R = H or -(CHZ),-COOH
0. FRACTIONATING THE CARRIER AMPHOLYTES
Sometimes it is desirable to cover a pH-gradient smaller than 3 to 10.
In this case fractionation is necessary in order to obtain the suitable
mixture of carrier ampholytes for the purpose. This may be carried out
satisfactorily in
a multichamber according to principles similar to those
described
by Williams and Waterman (12).
The apparatus described by Vesterberg (26) had 20 chambers sepa-
rated by sieve membranes of polyvinylchloride paper. Cooling water was
circulated through narrow glass tubes in each cell. The original mixture
from the synthesis of carrier ampholytes was poured into the cells. Cur-
rent was applied via the platinum electrodes in the two end chambers.
After about
24 hr the ampholytes had separated, the most acidic ones

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 25
lying in the cells near the anode, and the most basic ones lying in the
cells near the cathode. Each cell contained a mixture of ampholytes
covering a narrow pH range. The contents of each cell were drawn off
separately in a number of fractions, each one enabling the production of
a different pH-gradient. Further details may be found in Vesterberg’s
patent
(25).
P. PHYSICAL PROPERTIES OF THE AMPHOLYTES
Davies (52) performed numerous determinations of physicochemical
data for carrier ampholytes of Vesterberg’s type. Figures
5 and 6 show
the conductivity, pH and optical absorption at
280 nm for ampholyte
fractions covering different pH ranges. The aliphatic polyamino-poly-
carboxyl acids produced by Vesterberg’s synthesis ought to exhibit very
low absorption at
280 nm in the ultraviolet. The diagram shows that the
absorption is certainly low, but reaches significantly high values
in cer-
tain parts of the gradient. This is probably due to traces of compounds
with cyclic structures formed during the synthesis.
When using an ultraviolet photometer for recording purposes, the dis-
turbance resulting from this absorption
at 280 nm is rather small in nor-
mal experiments, wherein the average concentration of ampholytes
is
1%. However, the disturbances can be severe for low protein contents
and high concentrations of ampholytes.
If it is desired to evaluate column
experiments quantitatively by photometry at
280 nm, it may be neces-
sary to make corrections for this absorption. These can be made by
running one control experiment without protein.
The conductivity of carrier ampholytes shows a minimum at neutral
pH, that is, for the carrier ampholytes with neutral isoelectric points.
Consequently, it rises when the isoelectric point increases or decreases
from pH
7, as shown in Figure 5. If the entire gradient pH 3-10 is to be
used in
a column, then pH 7 will lie in the middle of the column. Since
the conductivity is least
at that position, the greatest potential drop
will take place there, resulting in the greatest amount
of heat being de-
veloped there during the experiment. This involves the risk
of thermal
convection, which may destroy the nearby focused zones. The buffering
capacity is depicted in Figure
7. As expected, it follows the conductivity.
It is lowest at neutral pH, and rises as the pH increases or decreases.
The linear part of the pH-gradient terminates at about pH
3.5 on the
acid side and about
9.5 on the basic side. Toward the ends of the gradi-
ent, the number of different ampholyte molecules diminishes. The buffer-
ing capacity therefore becomes low there. However, in these pH ranges
there are other good carrier ampholytes available. By adding,
for exam-

I
10 20 30 40 60 60 70 80 90 100 rnl
1000
2000
3ooo
4ooo
M)oo
m
7000
8ooo
goo0
n
1000
2000
3Ooo
4Ooo
5Ooo
8ooo
7000
8ooo
go00
Figure 5. Two sucrose density gradient electrofocusing runs identical except for
the polarity of the electrodes. The first,
A, has been focused with the anode in the dense
solution, i.e., at the bottom of the column, and the second,
B, with the cathode in the
dense solution. The pH-gradient
is hardly affected by the superimposed sucrose density
gradient.
In the conductivity, however, there is a difference in the two experiments.
With the cathode in the bottom, the conductivity lowering effect from the sucrose
density gradient will add to the relatively low conductivity of the carrier ampholytes
isoelectric near pH
9. In both curves one can observe the low conductivity of the
crtrrier ampholytes around pH
7.
26

Figure 6. The conductance course of the pH-gradients pH 3-6 and pH 7-10 are
very even. The gradient pH
5-8 contains the low conductivity ampholytes around 7
and shows a more uneven conductance course. This gradient is consequently more
sensitive
for thermal convection caused by Joule’s heat in the low conductance region.
Generally, the conductance course
is more even when shorter pH ranges are used.
27

28 HERMAN HAQLUND
LO
30
20
10
10 pn 2 3 4 s 6 7 8 s
Figure 7. Buffering capacity of fractions from the pH-gradient pH 3-10 focused
with the anode at the bottom of the column, obtained by titrating
4 ml samples on the
average containing
10 mg/ml. No corrections have been made for the buffering capac-
ity of water
or sucrose.
ple, arginine at the basic end and aspartic and glutamic acids at the acid
end, the pH-gradient can be extended down to
3 and up to about 10.
The commercial “Ampholine” chemicals have been reinforced in this way.
“Ampholine carrier electrolytes” are supplied in the form of water
solutions,
40% w/w, each covering a PI range of 2 pH units. In the
near future
also 1 pH unit ranges will be available. In order to get a
more suitable distribution of the field strength, it is preferable to add a
small amount, say, 10% of the total amount of carrier ampholytes of a
batch with pH 6-8. This is especially important when working with
extreme pH ranges.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 29
The user himself can produce a narrower fraction which covers a shorter
pH range, for example, half a pH unit. This can be done with the ordinary
experimental equipment. A natural pH-gradient is first established with
carrier ampholytes in the range of
2 pH units in a higher concentration,
say
4%. The fractions having pH values in the appropriate range are iso-
lated after elution. These fractions are then used in a new experiment-
this time the narrow fraction with its short pH range will fill the entire
apparatus (cf addition of pH range
6-8 ampholytes above). This type of
pH-gradient has definite advantages. A focused protein zone in a 1 pH
range gradient has more space than in a
3-10 pH range. Thus the same
amount of protein in
a focused zone will be less sharp and less concen-
trated in the narrow pH-gradient, although the resolving power is higher
than in the pH
3-10 range. This lessens the risk of convection instability
caused by too high density of the protein zone. Another advantage re-
sults from the longer distance separating the focused zones. This facili-
tates emptying of the column since the risk of the zones getting mixed is
much less during elution
or a similar process. However, this does not
necessarily mean that the resolving power is improved, only that
it is
easier to retain the resolution while emptying the column.
Q. pH RANGES REMOTE FROM THE NEUTRAL POINT
Attention must be paid to the following risks when working with pH
ranges remote from the neutral point. Let us assume that we are using
a
pH-gradient composed of carrier ampholytes with pH in the range 9 to 10.
The most acidic of these ampholytes, that is, the one with pH = 9, ought
to gather in the neighborhood of the acid electrode, the anode. However,
the liquid in the anode section is very acidic, with a pH well below
7,
due to the electrode reaction. Since water is an ampholyte which is al-
ways present in the system, the most acidic carrier ampholyte in our
example is not the most acidic ampholyte present in the system. During
the formation of the natural pH-gradient, a zone of pure water will thus
be created between the anode and the carrier ampholytes. The conduc-
tivity there falls to a very low level. Practically all the potential drop
tends to take place in the water zone. The heat generated there will spoil
the whole experiment, or the potential left will be too low for other
regions in the system.
When working far from the neutral point, it is necessary to make sure
that this electrolytic vacuum is filled.
If 10% of the total amount of
carrier ampholytes is added in the form of supplementary carrier ampho-
lytes from the fraction pH
6-8, this addition bridges the gap near the
electrode.
No low conductivity water zone is formed and a reasonable
field strength is obtained in all parts of the system.

30 HERMAN HAGLUND
The same applies to pH-gradients in the acid range. There one also
has to overbridge by adding ampholytes with pH
6-8. The most basic
species of carrier ampholytes ought to concentrate at the cathode. How-
ever, the water is a more basic ampholyte and tends to form a zone be-
tween the carrier ampholytes and the electrode.
As mentioned above, the
problem can be solved by the addition of carrier ampholytes which cover
the whole pH range. The pH curve will thus contain
a fairly straight
incline covering the pH range which the experimenter desires to utilize.
(This pH range extends throughout almost the whole length of the col-
umn.) The pH curve then rises steeply, due to the added fraction with
pH
6-8. This fraction occupies the rest of the column, including the
cathode section.
1”’“
R. DIALYSIS AND GEL FILTRATION
A
280
nm
10
0.5
Vesterberg (50) studied the separation of carrier ampholytes from pro-
teins by dialysis and by gel filtration. He used ampholytes containing
W,
-
-
I
0 h 50
25
20
15
10
5
FRACTION
VOLUME (mll
Figure 8. The separation of albumin and Ampholine on a 2.5 X 28 cm bed of
Sephadex (2-50 (fine). Sample volume 6 ml. Eluant 0.1 M phosphate buffer pH 7.
Flow rate 38 ml/h. The curve 0- 0 represents A280~~~ and a- a
represents counts per minute per ml X 10-8. (Vesterberg, 50.)

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 31
and used scintillation counting for assay. Less than 0.5% of the ampho-
lytes remained in a normal dialysis bag consisting of thin-walled cellulose
acetate tubing, when stirred and dialyzed at
+4"C for 48 h. Comparative
experiments with the dialysis of inorganic salts show that the rate of
dialysis of carrier ampholytes is considerably lower.
A quicker and convenient way is to use Sephadex gels. Complete
separation of ovalbumin from ampholytes was possible on
a gel bed of
Sephadex
G50, 50 cm high. (See Figure 8.) One should avoid drawing
far-reaching conclusions as to molecular weight on the basis
of the gel
filtration experiment. Furthermore the molecules of the carrier ampho-
lyte are probably
of elongated type and their polarity may also affect
their behavior in the Sephadex gel.
IV. STABILIZATION AGAINST CONVECTION
When performing a run in practice, the remixing of separated zones,
due to undesired convection and other movements in the liquid electro-
lyte system, has to be prevented. The liquid system must be stabilized
against convection in some way. In electrophoresis such stabilization can
be achieved in many ways. Valmet
(53) has made the following sum-
mary on methods used:
Capillary system (filterpaper, powder, gel) in columns, thin layer or
trough.
Multichamber cells, using permeable or semi-permeable membranes to
stabilize the cell compartments.
Electrophoresis convection, where the undesirable thermal convection is
eliminated because separation takes place in a relatively narrow
channel.
Forced-flow electrophoresis, where stabilization is achieved by
a forced,
laminar flow of liquid superimposed perpendicular to the direction of
electrophoretic migration of the proteins.
Moving-boundary electrophoresis, where stabilization is performed by
the density gradients formed by the migrating protein fronts in
a
U-tube. The method is not preparative, but purely analytical. The
migrating components overlap and can be distinguished by observa-
tion only. The
first and last one can, however, be withdrawn to some
extent and thus partly isolated.
Density gradient stabilization obtained by electrically neutral substances,
mostly sucrose.
Free-flow electrophoresis in a continuously flowing film of capillary
dimensions (about
0.5 mm).

32 HERMAN HAGLUND
Free-zone electrophoresis, where stabilization is achieved by slowly
rotating the cylindrical cell about its horizontal axis.
Semi-fluid film, for example,
a buffer containing 0.2% agar.
The above systems have appeared in many variations and combina-
tions.
A description of them all lies beyond the scope of this article.
Detailed descriptions of the various electrophoretic methods, with refer-
ences to numerous works in this field, have been given by Bier
(54).
Unfortunately, no stabilizing medium is free from side effects. The
anticonvection medium is present in far greater quantities than the sam-
ple. This results in losses due to adsorption. Charges attached to the
surface of the anticonvection medium give rise to electro-osmotic flow in
the liquid phase of the system.
Of the techniques mentioned, the
density gradient technique is used in
most electrofocusing experiments reported to date, although
gel electro-
focusing
has recently had wide applications. Valmet’s zone convection
electrofocusing
is a promising new approach to the stabilization problem.
There also, no added stabilizing medium is necessary.
HjertBn’s free-zone rotating cell technique has been reported as success-
fully applied by him to electrofocusing. Principally,
it is a convenient
method totally free from any disturbing anticonvection medium.
It is,
however, only applicable on an analytical scale.
Earlier, before the modern development of the natural pH-gradient,
multichamber systems were used, as was filter paper technique.
The stabilization techniques of importance today in electrofocusing are
(a) density gradient electrofocusing, (b) gel electrofocusing, and
(c) zone
convection electrofocusing. These methods
are described in detail later in
this article.
1. Equipment
From the descriptions of apparatus for electrofocusing, five main types
1. Column apparatus using sucrose gradients to stabilize against
2. Column apparatus using polyacrylamide to stabilize against
3. Thin-layer technique equipment usually using polyacrylamide as
4. Zone convection electrofocusing equipment, as created by Valmet
5. Rotating tube apparatus according to Hjerth (42), developed for
can be discerned:
convection.
convection.
convection stabilizer.
(40).
free-zone electrophoresis but works also for electrofocusing.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 33
V. DENSITY GRADIENT ELECTROFOCUSING
1. Introduction
The technique of isoelectric focusing requires apparatus of very simple
design. The principle assumes that a steady state has been reached. This
means that no attention need be paid to protein zones moving through
the column, nor to the distance between electrodes and the main com-
partment where separation takes place. Nor are other special devices
needed to prevent acidic or basic products
of electrolysis from penetrating
the separation compartment. In other words, the electrodes can commu-
nicate directly with the separation compartment.
The carrier ampholytes adjacent to the electrodes must be protected
from anodic oxidation or cathodic reduction. This is done by using special
electrode solutions, which perform the function of a liquid lock. A dilute
solution of an acid such as phosphoric or sulfuric acid is used at the
anode. A dilute alkali such as sodium hydroxide is used at the cathode.
Electrolysis attracts the acid and the base to the respective electrodes.
The acid at the anode gives
a positive charge to the carrier ampholytes
there. Thus they are repelled from the anode. At the cathode, the base
gives a negative charge to the carrier ampholytes nearby. They are then
repelled from the cathode.
Column apparatus can be very simple, since the entire pH-gradient
between the electrode can be utilized.
No special electrode vessels are
necessary. Steps must be taken, however, to prevent gas bubbles from
the electrodes from entering the separation compartment.
A very simple
type of apparatus has been described by Svensson
(3) (see Figure 9), and
a similar apparatus was used
65 years ago by Picton and Linder (55).
They did not use a density gradient for stabilization purposes. The gas
bubbles formed at the central electrode develop only inside the central
tube, which protects the density gradient. Thus they do not enter the
separation compartment. The bubbles from the top electrode are devel-
oped close to the upper surface, to which they rise, and do not cause any
convection in the separation compartment.
After the completion
of the experiment, the solution must be pumped
out of the column or manually drained to prevent the focused zones from
remixing. The experimenter will also desire to analyze the solution after
withdrawal and to be able to chart each vertical interval of the column
with respect to the data desired.
In the first place, the isoelectric point
of the protein should be estab-
lished, together with its position along the vertical, longitudinal axis of
the column. This is often done by localizing the protein zones by measur-

34 HERMAN HAGLUND
Figure 9. Easily assembled apparatus for density gradient isoelectric focusing of
proteins.
A narrow glass tube is inserted into a glaas cylinder within this a platinum
wire extends almost to the bottom. The other electrode is
a loop of platinum wire at
the surface of the liquid. (Svensson, 3.)
ing the absorption of light at 280 nm, for example, in a Uvicord I1 pho-
tometer. (See Figure
10.) The content of the column is then fractionated,
usually be using a fraction collector after which the pH of the solution,
which contains the protein of interest
is measured. As was mentioned
earlier, the pH value
is equivalent to the isoelectric point of the protein.
Thus the presentation of an electrofocusing experiment usually includes
the pH values of all fractions. These are superimposed on the coordinate
diagram showing the optical density as
a function of the location in the
column. The latter is expressed either as
a length or as a volume. Figure
11 shows a typical presentation of an electrofocusing experiment and
Figure
10 the column with the focused zones.
The simple column shown in Figure
9 can be emptied by inserting
capillary tubing through the base. The contents may then be withdrawn
by means of a peristaltic pump and transferred to
a fraction collector.

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 35
However, the acid solution in the anode tube shown in the picture will
then enter the electrofocused solution continuously.
It will thus gradually
change the pH of the latter, giving false pH values. To make Picton and
Linder’s apparatus usable it should be equipped with
a valve at the
bottom of the anode tube. This valve should be closed at the termination
of electrofocusing. The contents could then be withdrawn without being
spoiled by the admixture of electrode solution. Of the two columns for
electrofocusing at present being marketed, the one which
is most common
is based on a similar principle. However, it is furnished with a shut-off
valve mounted on the central tube. (See Figure
12.)
LKB-Produkter AB, Stockholm, Sweden, has introduced electrofocus-
ing by making available supplies of carrier ampholytes and columns for
electrofocusing. This
is done under the trade name of “Ampholine.”
There are two kinds of column. One is specially designed to meet the
Figure 10. Electrofocusing equipment consisting of electrofocusing column (LKB
8100-10) (110 ml), power supply (LKB 3371), UV monitor (LKB 8300), recorder
(Varian
G-14), and test tube rack for collecting fractions. The sample is a commercial
hemoglobin preparation used as a colored test sample for methodological studies.

36 HERMAN HAQLUND
Figure 11. Separation of hemoglobin preparation by electrofocusing in the same
apparatus shown in Fig.
10 showing a curve from the same run. The curve with the
peaks shows the absorption in the eluate at
260 nm. It is obtained from one run in a
series of consecutive experiments with the aim of getting a more narrow pH-gradient
and a more refined separation of sample compounds in every step. The steadily falling
curve is plot of the pH-gradient. The
PI values shown at the various peaks were read
from the pH-gradient curve. The electrofocusing was
run at +4OC as were the pH
readings.
requirements of electrofocusing. It is a direct development of the appa-
ratus described by Svensson
(3) and later improved by Forchheimer,
Vesterberg and LKB-Produkter (5). Two sizes are available, one
110 ml
and the other
440 ml.
The other column is
a special version of the “Uniphor” apparatus for
zone electrophoresis, also produced and sold by the same company. Apart
from this commercial equipment, there is yet another type described in
the literature. This is designed for electrofocusing using
a column density
gradient (56). This apparatus
is suitable for the separation and fractionation
of proteins but less suitable for PI determinations.
2. Ampholine Carrier Ampholytes
Ampholine carrier ampholytes, satisfying the requirements given on
page 24, consist of a number of different aliphatic polyamino-polycar-
boxylic acids. They are manufactured and marketed by LKB-Produkter
AB, S-161
25 Bromma, Sweden. The amino groups can be primary,
secondary or tertiary. A great number of homologues and isomers are
possible. Below is given the general structural formula which should be

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 37
common to all Ampholines offered. The total pH range of the carrier
ampholytes is at present
3-10.
---~CHz-N-(CHz),-N-CHy--~
I
dLL R
I
NRz
R = H or -(CHZ),-COOH
x=2or3
The carrier ampholytes are delivered in water solution at a concen-
tration of
40% (W/V), in a 25 ml bottle (10 g ampholyte per bottle)
for standard ampholytes. The standard fractions cover the following
pH
ranges: 3-10, 3-6, 5-8, 7-10, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9 and 8-10. Accord-
ing to the manufacturer,
1 pH ranges will also be available in the near
future.
If closer ranges are desired, they can be prepared by the experi-
menter from the fractions mentioned above (see also section
VI, 2). The
solubility in water of the carrier ampholytes is better than
60% (W/V).
The UV-light absorption for the different pH ranges is about the same,
namely
<0.30 at 254 nm, <0.05 at 280 nm and <0.08 at 365 nm wave
length for a solution of
1%, in a 1 cm cuvette. To prevent the ampho-
lytes from being decomposed and discolored, they should not be exposed
to direct sunlight or temperatures above
+20°C for long periods. In
addition, certain micro-organisms may grow in the solutions,
so they
should be stored at low temperature (below
+6"C). The ampholytes
form complexes with metal ions. This should be taken into consideration
when electrofocusing proteins containing metal ions. However, a num-
ber of metal proteins have been fractionated by electrofocusing without
complications, for example, hemoproteins
and laccas. The concentration
usually recommended is
1 g of Ampholine per 100 ml solution. The
Ampholine chemicals contribute to the solubility of the proteins. There
are some proteins which become denatured at their isoelectric point in
water, but do not if carrier ampholytes are present. Higher concentra-
tions of Ampholine are recommended in such cases.
3. Density Gradient
A prerequisite for the present technique of isoelectric fractionation is
the use of a density gradient of
a non-ionic solute in order to prevent
thermal convection and to stabilize the protein zones. Therefore,
a den-
sity gradient is prepared by mixing
a light solution (containing distilled
water, ampholytes and sample) and a dense solution (containing distilled
water, ampholytes and
a "dense" solute). In general, the following re-

38 HERMAN HAQLUND
quirements must be fulfdled by a good solute:
1. Good solubility and low viscosity in water.
2. High density-must give a minimum density difference of 0.12
3. Must not interact with the sample (the proteins).
4. Must not be ionic.
g/cm3.
The most common solute
is sucrose, which must be absolutely pure
(analytical reagent grade).
A suitable concentration of sucrose in the
dense solution is
50% (W/V). This gives a density difference of 0.2 g/cm
between the dense and less dense solution
(or between the top and the
bottom of the column). Higher concentrations of sucrose give too high
viscosity. However, other solutes such
as ethylene glycol and glycerol
can also be used, for example, when an enzyme to be electrofocused re-
acts with sucrose
or makes the assay of the enzyme troublesome. These
substances are often used with
a concentration of 60 to 70% in the dense
solution because of their lower density. Lastly,
it can be said that any
non-ionic substance harmless to the sample and pH gradient can be used
for preparing
a density gradient. It should also be taken into consider-
ation that the linear gradient mixer used must be adapted for the ap-
propriate difference in density between the heavy and light solutions.
4. Sample Solution
The sample solution may contain up to 0.5 m moles of salt for a column
volume of 110 ml, for example,
for the LKB 8100-10. If necessary,
dialyze with several changes against either
a small volume of a 0.5%
solution of carrier ampholytes, or against a 1% solution of glycine.
Because of the focusing character of the method, the volume of the
protein solution to be applied to the column
is not very critical. In a
110 ml column up to 85 ml of protein solution can be applied. Several
factors determine the total load of protein allowable.
The capacity of the density gradient to carry
a focused protein zone is
limited.
As the voltage increases, the zones focus more sharply. This in
turn raises the density in the zone to
a point at which droplet for-
mation may start.
The applied voltage also has an influence on the sharpness of focusing.
A higher voltage gives a more focused zone. When using a narrow pH
range in the column, comparatively broad zones can be allowed and
a
good separation of proteins having adjacent PI values can still be ob-
tained. About 1-5 mg of protein per square centimeter of cross-sectional

ISOELECTRIC FOCUSING IN PH GRADIENTS 39
area can be in one zone, that is, about 5-25 mg in LKB 8100-10 (110 ml
column). The lower figures are recommended for analytical high reso-
lution separations.
Consequently the total load of sample depends on the number of zones
obtained in an experiment (that is, on the heterogeneity of the sample),
the pH range used for the experiment and the charge condition for the
protein in question in the neighborhood of its isoelectric point.
5. LKB 8100 Ampholine Equipment
Two sizes of column are available-110 ml and 440 ml. An outer cool-
ing mantle surrounds the annular inner compartment for electrofocusing.
In the middle, there is a detachable cooling pipe which also contains the
central electrode. Figure 12 shows the general layout. Item (17) is the
annular compartment for electrofocusing. The shaded area represents
the cooling water which cools the electrofocusing compartment both out-
side and inside, keeping it
at a constant temperature (thermostat).
Tubing (33) connects these cooling compartments. The electrodes are
made of platinum. They are located
so as to prevent gas bubbles from
disturbing the electrofocusing. Moreover, the products of electrolysis are
prevented from entering the electrofocusing compartment.
The upper electrode (32) consists of a coil at the top of the separation
compartment (17).
It is connected to a terminal (30). The central elec-
trode is wound around
a Teflon rod (20) which lies within the central
tube (19). This electrode is also connected to
a terminal (29). The Teflon
rod has two functions; it supports the electrodes and it operates the valve
(26). This valve makes
it possible to shut the central tube (19) off from
the electrofocusing compartment (17). This operation is controlled by
the setting device (25), which has two positions-open and closed.
6. Typical Experiment
A typical electrofocusing experiment with the apparatus just described
is as follows:
The valve (26) is opened, and the cooling water
is turned on. A pump
or a funnel is used to add the electrode solution for the central electrode
via the nipple (1). The electrode solution consists of the most concen-
trated sucrose solution to be used in the experiment.
(A solution of the
same sucrose concentration is added to the bottom of the separation
compartments.) The electrode solution also contains
a strong acid or a
strong base, depending on whether the central electrode is to operate as

Figure 12. A sketch of the electrofocusing column shown in Fig. 10 (LKB 8100-10,
110
ml). Compartment (17) where the electrofocusing takes place has an annular cross
section and is thermostatted from both sides by cooling water compartments. These
are interconnected with tubing
(33). The platinum electrodes are positioned to prevent
gaa bubbles disturbing the electrofocusing process and to keep the products of
electrolysis out of the electrofucusing compartment. The upper electrode
(32) consists
of a loop located at the top of electrofocusing compartment
(17) connected to a plug
(30). The central electrode is bound on a teflon rod (20) in the central tube (19) and
connected to plug
(29). This rod serves both aa a carrier for the electrode and as a lever
for valve
(26) making it possible when emptying to shut off the central tube (19) from
compartment
(17) by means of a setting device (25) at the top of the column.
40

Another Random Document on
Scribd Without Any Related Topics

saamme tutkia niiden sisällyksen ja luonnon ja päättää, voiko tuon
uskottoman naisen rankaiseminen tyydyttää oikeuttamme, vai
täytyykö meidän myös, vertavuotavin sydämin, ryhtyä
rangaistuskeinoihin omaa veljeämme vastaan.»
Useita vieraitamiehiä kutsuttiin todistamaan, miten suuriin vaaroihin
Bois-Guilbert oli antautunut pelastaessansa Rebekan palavasta
linnasta ja miten hän suojellessaan tyttöä ei ollut välittänyt
vähääkään omasta hengestään. Miehet kertoivat näitä asioita
suurennellen, kuten aina sivistymättömät ihmiset, joiden mieleen
merkillinen tapaus on tehnyt voimakkaan vaikutuksen. Ja heidän
luonnollinen liioittelunhalunsa sai tässä tilaisuudessa vielä paljon
yllytystä siitä ilmeisestä mielihyvästä, jolla korkean herran nähtiin
kuuntelevan hänelle kerrottuja juttuja. Tällä tavalla Bois-Guilbertin
kokemat vaarat, jotka suurentelemattakin olivat olleet sangen
suuret, muuttuivat kertojien suussa aivan ihmeellisiksi. Ritarin
huolenpito Rebekan turvallisuudesta ei paisunut ainoastaan
varovaisuuden, vaan myös hurjimmankin ritarillisen innostuksen
rajojen yli. Ja nöyryys, jolla hän oli kuunnellut kaikkia tytön puheita,
vaikka ne usein olivat tylyjä ja soimaavia, kuvattiin niin
ylenmääräiseksi, että se hänen kaltaiselleen röyhkeäluontoiselle
miehelle tuntui aivan luonnottomalta.
Sitten käskettiin Templestowen preceptorin kertoa, millä tavalla Bois-
Guilbert ja juutalaistyttö olivat saapuneet preceptorio-kartanoon.
Malvoisin antoi todistuksensa taitavan varovaisesti. Mutta vaikka hän
nähtävästi koetti olla loukkaamatta Bois-Guilbertin tunteita, niin hän
kuitenkin aika ajoin sekoitti puheeseensa hämäriä lauseita, joilla hän
ikäänkuin viittasi, että Bois-Guilbert sillä hetkellä mahtoi olla
mieleltään hiukan vialla, koska hän näytti olevan niin silmittömästi
ihastunut tuomaansa neitoon. Katuvaisin huokauksin preceptori
ilmaisi sydänsuruaan sen johdosta, että hän oli sallinut Rebekan
rakastajansa seurassa päästä hänen hallitsemaansa preceptorio-
kartanoon. »Mutta tätä tekoa», hän lopetti, »olen koettanut selittää
ripissäni korkea-arvoiselle isällemme suurmestarille. Hän tietää, ettei
tarkoitukseni ollut paha, vaikka käytökseni ei ollut aivan

lainmukainen. Mielelläni otan vastaan sen rangaistuksen, minkä hän
minulle määrää.»
»Hyvin puhuit, Albert», lausui Beaumanoir. »Tarkoituksesi oli hyvä,
koska tahdoit estää eksynyttä veljeäsi rientämästä eteenpäin sillä
hullutuksen tiellä, joka vie kadotukseen. Mutta väärin teit kuitenkin,
niinkuin tekee mies, joka tahtoen hillitä pillastunutta hevosta tarttuu
käsin jalustimeen eikä suitsiin, eikä saa siis yritystänsä onnistumaan,
vaan vielä päälliseksi tulee itse vioitetuksi. — Kolmetoista isämeitää
ovat säätymme jumaliset perustajat määränneet luettavaksi joka
aamu ja yhdeksän joka ilta; lue sinä kaksi sen vertaa. Kolmesti
viikossa on temppeliherroille lihan syöminen sallittu; mutta paastoa
sinä kaikki seitsemän päivää. Tee näin kuuden viikon aikana, niin
rangaistuksesi määrä on täysi.»
Teeskennellen alamaisinta nöyryyttä Templestowen preceptori
kumarsi päänsä lattiaan suurmestarin edessä ja kävi sitten jälleen
istumaan.
»Eikö olisi hyvä», kysyi suurmestari taas, »että me hiukan
tutkisimme tämän naisen entisiä tekoja ja puheita, nimenomaan
saadaksemme nähdä, onko luultavaa, että hän on käyttänyt
taikakeinoja ja loitsuja. Sillä jo nyt kuulluista todistuksista päättäen
olemme taipuvaiset siihen uskoon, että eksynyttä veljeämme näissä
hänen valitettavissa teoissaan.»
Herman, Goodalricken herra, oli neljäs läsnäoleva preceptori; muut
kolme olivat Konrad, Malvoisin ja Bois-Guilbert itse. Herman oli
vanha soturi, jonka kasvoissa kävi ristiin rastiin
muhamettilaissapelien jättämiä arpia; häntä pidettiinkin suuressa
arvossa ja kunniassa veljien kesken. Hän nousi ja kumarsi
suurmestarille, joka heti soi hänelle puheenvuoron.
»Minä tahtoisin, korkeastikunnioitettava isä, että urhoolliselta
veljeltämme, Brian de Bois-Guilbertilta kysyttäisiin, mitä hän itse
arvelee noista ihmeellisistä syytöksistä ja mikä nyt on hänen oma
ajatuksensa hänen valitettavista suhteistaan tähän juutalaistyttöön.»

»Brian de Bois-Guilbert», lausui suurmestari, »sinä kuulit
kysymyksen, johon meidän veljemme, Goodalricken herra, tahtoo
saada sinulta vastauksen.»
Kun häntä näin puhuteltiin, käänsi Bois-Guilbert päänsä suurmestarin
puoleen, mutta ei virkkanut mitään.
»Hänessä on mykkä perkele», sanoi suurmestari. »Pois täältä,
saatana! —Puhu, Brian de Bois-Guilbert, minä käsken sinua tällä
ristillä, pyhän säätymme tunnusmerkillä!»
Bois-Guilbert ponnisti kaikki voimansa hillitäkseen yltyvää
ylenkatsetta ja vihastustaan, joiden ilmipuhkeaminen — sen hän
selvästi näki — ei olisi ollut hänelle vähimmäksikään hyödyksi. »Brian
de Bois-Guilbert», hän vastasi, »ei tahdo vastata,
korkeastikunnioitettava isä, näin hulluihin ja perättömiin kanteisiin.
Jos joku soimaa minun kunniaani, niin tahdon puolustaa sitä
kädelläni ja tällä miekallani, jotka usein ovat taistelleet kristinuskon
puolustukseksi.»
»Me annamme sinulle anteeksi, veli Brian», lausui suurmestari,
»vaikka sotataitosi kerskaaminen minun edessäni on omien tekojesi
ylistämistä ja riettaan hengen yllytystä, joka kiusaa meitä
arvostelemaan liian suureksi oman arvomme. Mutta me annamme
sinulle sen anteeksi, sillä me uskomme, ettet puhu näin omasta
tahdostasi, vaan sen yllytyksestä, jonka me Jumalan avulla ja
tahdosta tahdomme kukistaa ja tästä kokouksesta karkoittaa.» —
Ylenkatseen salama säihkyi Bois-Guilbertin mustista, tulisista
silmistä, mutta hän ei vastannut mitään. — »Ja nyt», jatkoi
suurmestari, »kun veljemme, Goodalricken herran, kysymys on tullut
vastatuksi, vaikka tosin vaillinaisesti, tahdomme jatkaa
tutkintoamme, veljet, yrittäen suojeluspyhämme avulla saada selvää
tämän synnin salaisuuden pohjimmaisestakin perukasta. — Astukoot
siis esille ne, joilla on jotakin sanomista tämän juutalaisnaisen
tavoista ja puheista.» — Hälinää kuului nyt salin oven puolelta, ja
suurmestarin kysyttyä syytä siihen vastattiin siellä olevan halvatun
miehen, jonka syytetty oli ihmeellisellä voiteella parantanut, niin että
hän nyt jokseenkin hyvin taisi käyttää jäseniänsä.

Mainittu talonpoikaparka, saksilainen sukuperältään, raahattiin nyt
tuomioistuimen eteen; hän oli kovin peloissaan, odottaen, mitä
rangaistusta hänelle määrättäisiin siitä rikoksesta, että hän
halvaustaudissaan oli turvautunut juutalaistytön parannusvoimaan.
Aivan terve hän ei ollut vielä nytkään, sillä hänen täytyi tullessaan
todistamaan käyttää kainalosauvoja. Sangen vastahakoisesti ja itkien
hän antoi todistuksensa. Mutta hän tunnusti kuitenkin, että kaksi
vuotta takaperin, kun hän Yorkissa oli nikkarintyössä rikkaan Iisak
Juutalaisen luona, ankara tauti oli äkkiä häneen tarttunut. Hän ei
ollut kyennyt vuoteeltaan liikahtamaan, kunnes Rebekan käyttämät
lääkkeet, varsinkin eräs lämmittävä ja ryydeiltä hajahtava voide,
olivat jälleen johonkin määrään saattaneet hänen jäsenensä
liikkuviksi. Viimein, sanoi hän, oli Rebekka vielä antanut hänelle
pullollisen tätä kallista voidetta sekä myös yhden kolikon
matkarahaksi, jotta hän pääsisi isänsä kotiin, joka oli lähellä
Templestowea. »Älkää pahaksi panko, armollinen ja kunnioitettava
herra», lopetti mies, »mutta enpä voi uskoa, että tyttö tarkoitti
minulle pahaa, vaikka hän kovaksi onnekseen on juutalainen
synnyltänsä. Sillä hänen antamiansa voiteita käyttäessäni luin aina
isämeitää ja uskontunnustusta eikä lääkkeen hyvä voima siitä yhtään
vähentynyt.»
»Suu kiinni, orja», tiuskaisi suurmestari, »ja mene tiehesi! Hyvinpä
sopii tosiaan sinun kaltaistesi luontokappalten puuhata helvetin
lääkkeitten kanssa ja tehdä palkkatyötä pahuuden lapsille. Muista,
mitä sanon: perkele lähettää usein tauteja ihmisille juuri siinä
tarkoituksessa, että jokin helvetistä tuotu lääke tulisi näiden tautien
poistamisella ihmisten kesken kuuluisaksi. Onko sinulla sitä voidetta
täällä mukanasi, josta puhuit?»
Talonpoika kopeloi vapisevin käsin poveansa ja otti esiin pienen
pullon, jonka kyljessä oli muutamia heprealaisia kirjaimia; ja sepä jo
useimpien katsojain mielestä oli varma todistus siitä, että perkele oli
keittänyt voiteen. Beaumanoir ristittyänsä silmänsä otti pullon
käteensä ja luki sujuvasti — sillä hän osasi useimpia itämaan kieliä
— seuraavat sanat: Juudaan heimokunnan Leijona on voittanut. —
»Ihmeellinenpä on saatanan voima», lausui hän, »kun se näin voi

vääntää Raamatun sanoja jumalanpilkaksi sekoittaen myrkkyä
terveelliseen ruokaan! — Eikö täällä ole ainoatakaan lääkäriä
saapuvilla, joka taitaisi ilmoittaa meille, mistä aineista tämä
taikavoide on kokoonpantu?»
Kaksi lääkäriä, siksi he ainakin itse kehuivat itseään, astui esiin, —
toinen oli munkki, toinen parranajaja. He vakuuttivat, etteivät he
voineet saada selkoa voiteen aineista, paitsi että se tuoksahti
myrhalta ja kamfertilta, jotka he tiesivät itämaan yrteiksi. Mutta
ammattikateus, jolla semmoiset miehet aina katselevat taitavaa ja
onnistunutta virkaveljeä, pani heidät vielä lisäämään, että voide
epäilemättä oli luvattomin taikakeinoin keitetty, koska he eivät
voineet saada siitä selkoa. »Tunnemmehan me», sanoivat he,
»perinpohjin kaikki taitomme haarat, sen verran kuin hyvän kristityn
omatunto sitä sallii.» — Tämän lääkärintutkinnon päätyttyä
saksilainen talonpoika nöyrästi pyysi saada takaisin tuon voiteen,
jonka voima oli ollut niin parantava. Mutta sen kuullessaan
suurmestari ankarasti rypisti kulmakarvojansa. »Mikä nimesi on,
mies?» kysyi hän rammalta.
»Higg Snellinpoika», vastasi tämä.
»No sitten, Higg Snellinpoika», lausui suurmestari, »minä sanon
sinulle, että sinun on parempi maata vuoteessasi halvattuna kuin
kyetä nousemaan ja kävelemään pakanan antaman lääkkeen avulla.
Parempi on väkivaltaisella kädellä ryöstää uskottomien aarteita kuin
ottaa heiltä vastaan armolahjoja tai palvella heitä palkan edestä.
Mene nyt ja tee niinkuin olen sanonut.»
»Voi, korkeastikunnioitettava herra», virkkoi talonpoika, »älkää
panko pahaksi, mutta liian myöhäinenhän tuo neuvo on minulle, sillä
minä olen rampa mies. Mutta kyllä minä mainitsen molemmille
veljilleni, jotka palvelevat rikasta rabbiinia Nathan Ben Samuelia,
suurmestarin sanoneen, että on parempi varastaa mainitulta
rabbiinilta kuin rehellisesti häntä palvella.»
»Ajakaa ulos se lörpöttelevä ilkimys!» tiuskaisi Beaumanoir, joka ei
heti osannut vastata tähän käytännölliseen johtopäätökseen, jonka

toinen oli vetänyt hänen antamastaan yleisestä ohjeesta.
Higg Snellinpoika poistui kansanjoukon keskelle, mutta kun häntä
halutti saada tietää, mikä tulisi hänen hyväntekijänsä kohtaloksi, jäi
hän kuitenkin saliin kuuntelemaan tuomiota. Sen hän teki, vaikka
hän tiesi siten vielä kerran voivansa joutua tuon ankaran herran
vihastuksen alaiseksi, joka äsken oli häntä pelästyttänyt, niin että
hänen sydämensä aivan kutistui kokoon.
Suurmestari käski nyt Rebekkaa poistamaan hunnun kasvoiltaan.
Ensi kertaa avaten huulensa tyttö vastasi nöyrästi mutta kuitenkin
arvokkaasti: — hänen kansansa tyttärillä ei ollut tapana näyttää
kasvojansa hunnuttomina kun he olivat yksinänsä vierasten
joukossa. —Hänen äänensä suloinen sointu ja hänen vastauksensa
siveys taivuttivat kuulijain mielet sääliin ja leppeyteen. Mutta
Beaumanoir, joka katsoi Jumalalle otolliseksi, että armotta
kukistettaisiin kaikki säälin tunteet, jotka voivat estää hänen luultua
velvollisuuttansa, uudisti käskynsä ja määräsi, että Rebekan huntu
oli poistettava. Vartijat astuivat siis lähemmäksi poistaaksensa sen,
mutta Rebekka nousi nyt itse ja kääntyi suurmestarin puoleen:
»Ei — jos teille omat tyttärenne ovat rakkaat! — Voi», hän lisäsi
huomaten erehdyksensä, »eihän teillä olekaan tyttäriä! — Mutta
teidän äitinne muiston tähden — jos te rakastatte omia sisarianne ja
pidätte pyhänä naisen häveliäisyyttä, niin älkää salliko, että minua
täten kohdellaan teidän läsnäollessanne. Ei sovi, että miesten kädet
väkivaltaisesti riisuvat tytön verhoja. Minä tahdon totella teitä»,
lopetti hän kärsivällisellä, vaikka surullisella äänellä, joka miltei
sulatti itse Beaumanoirinkin kovan sydämen. »Te olette kansanne
vanhin; teidän käskystänne tahdon poistaa verhon onnettoman tytön
kasvoilta.»
Hän veti huntunsa pois ja loi heihin katseen, joka ilmaisi
häveliäisyyttä ja arvontuntoa. Hänen erinomainen kauneutensa
nostatti ihmettelevää kuiskailua, ja nuoremmat ritarit katsahtivat
merkitsevästi toisiinsa ilmaisten siten ajatuksensa, että tytön
ihanuuden todellinen voima — ilman mitään taikakeinoja — riitti
täydesti selittämään Brianin käytöksen. Mutta Higg Snellinpoikaan

hänen hyväntekijänsä kasvojen näkeminen vaikutti kaikkein
syvimmin. »Antakaa minun mennä pois», sanoi hän ovenvartijalle,
»antakaa minun mennä pois! — Minä kuolen, jos vielä kerran näen
hänet, sillä minullakin on osaa hänen murhaansa.»
»Älä sure, mies parka», virkkoi Rebekka, joka kuuli hänen huutonsa,
»sinä et ole tehnyt minulle mitään pahaa sillä, että ilmaisit totuuden,
etkä myöskään voi auttaa minua valituksillasi ja itkullasi. Mene kotiin
ja pelasta itsesi.»
Vartijat, jotka pelkäsivät, että miehen kova parkuminen saattaisi
heille nuhteita ja hänelle itselleen rangaistuksen, tahtoivat ajaa
Higgin ulos. Mutta hän lupasi olla ääneti ja sai siis pysyä salissa. —
Nyt kutsuttiin esille ne kaksi sotamiestä, joille Albert de Malvoisin oli
pannut sanat suuhun, mitä heidän oli todistettava. Vaikka molemmat
olivat paatuneita, kovasydämisiä konnia, niin vangitun tytön
ulkomuoto sekä hänen erinomainen ihanuutensa näytti ensi hetkellä
saattavan heidät levottomiksi. Mutta Templestowen preceptorin
tuima silmänisku palautti pian heidän paatuneen rohkeutensa.
Liiankin tarkkaan, minkä olisi tasapuolisen tuomarin mielessä pitänyt
nostaa epäluuloa, he kertoivat kaikenlaisia asioita, jotka olivat joko
peräti valheellisia tahi itsessään mitättömiä ja luonnollisia, mutta
vahingollisia kanteenalaiselle sen vuoksi, että vieraatmiehet niitä
suurentelivat ja selittivät pahimmalla tavalla. Heidän todistamansa
seikat olisi meidän aikanamme jaettu kahteen osaan: toiset
mitättömiä, toiset luonnollisista syistä mahdottomia. Mutta noina
tietämättömyyden ja taikauskon aikoina ne nielaistiin kaikki tyyni
helposti täysinä syyllisyyden todisteina. Edelliseen luokkaan kuului
esimerkiksi se, että Rebekan oli kuultu itsekseen mutisevan oudolla
kielellä — että laulut, joita hän välistä lauleli, kuuluivat niin ihmeen
kauniilta, jotta kuulijain korvat alkoivat soida ja sydän sykähdellä —
että hän joskus puheli itsekseen ja katsahteli ylöspäin ikäänkuin
odottaen taivaasta vastausta — että hänen pukunsa oli outo ja
kumma, aivan toisenlainen kuin hyvämaineisten naisten yleensä —
että hänellä oli taikasanoja piirrettynä sormuksiinsa ja kummia
kirjaimia kudottuna huntuunsa.

Kaikkia näitä luonnollisia tai aivan mitättömiä seikkoja kuunneltiin
todistuksina luvattomasta seurustelusta yliluonnollisten voimien
kanssa tai ainakin väkevinä syinä epäluulon heräämiseen.
Mutta tulipa näiden todistusten lisäksi eräs, joka vielä selvemmin oli
perätön, mutta jonka kuulijat tai ainakin enin osa heistä
herkkäuskoisuudessaan ahneesti omistivat todeksi. Eräs sotamies
kertoi nähneensä, miten Rebekka paranteli erästä haavoittunutta
miestä, jonka he olivat tuoneet mukanaan Torquilstoneen.
Juutalaistyttö oli muka siinä tilaisuudessa tehnyt ihmeellisiä
temppuja ja lausunut salaperäisiä sanoja, joita sotamies ei sanonut
ymmärtäneensä, mutta olevansa Jumalalle kiitollinen siitä. Näiden
taikakeinojen voimalla oli varsijousen nuolen rautakärki itsestään
irtautunut haavasta, veri laannut vuotamasta, haava sulkeutunut
umpeen ja kuolemaisillaan ollut mies oli neljännestunnin kuluttua
astunut muurille auttamaan puhujaa kivenheittokoneen
virittämisessä. Alkuaiheena tähän juttuun oli epäilemättä se, että
Rebekka oli Torquilstonen linnassa hoidellut Ivanhoeta. Mutta tämän
puheen totuutta oli sitä vähemmän syytä epäillä, koska vieras mies
viimein vahvistaaksensa sanojaan todistusesineen avulla veti
taskustaan saman nuolenpään, joka muka taikakeinoin oli saatu ulos
haavasta. Ja koska tämä rautakappale painoi runsaan luodin, niin
antoi se tietysti miehen jutulle täydesti todistavan painavuuden.
Hänen kumppaninsa puolestaan oli läheiseltä muurilta nähnyt
Rebekan ja Bois-Guilbertin välisen kahakan, jolloin edellinen tahtoi
heittäytyä alas tornikamarin akkunasta. Hänkään ei tahtonut olla
huonompi tarinoija kuin edellinen ja kertoi siis nähneensä, miten
Rebekka kävi tornin katonreunukselle seisomaan ja muuttui
lumenvalkoiseksi joutseneksi, jossa haamussa tyttö kolmesti lentää
lekotti Torquilstonen linnan ympäri. Sitten hän muka palasi samaan
torniin ja muuttui jälleen naisen hahmoon.
Vähemmän kuin puolet näistä painavista todistuksista olisi jo
saattanut tuomionalaiseksi minkä köyhän ja ruman akan tahansa,
vaikka kristinuskoisenkin. Ja voittivatpa ne myös Rebekan nuoruuden

ja erinomaisen ihanuudenkin, saatuansa lisäpainoa siitä
onnettomasta seikasta, että hän oli juutalainen.
Suurmestari oli kuulustellut tuomarikunnan jäsenten mieltä ja kysyi
nyt juhlallisella äänellä Rebekalta, mitä hänellä oli sanomista
kuolemantuomiota vastaan, joka nyt tulisi julistettavaksi.
»Minä huomaan», sanoi Rebekka.
»että olisi turhaa ruveta teiltä armoa
anomaan.»
»Minä huomaan», vastasi suloinen juutalaistyttö, »että olisi yhtä
turhaa kuin mielestäni myös alentavaa itselleni ruveta teiltä armoa
anomaan. Turha olisi myös, jos sanoisin, että sairaan ja haavoitetun

hoitaminen, vaikka hän kuuluisikin toiseen uskontokuntaan, ei liene
vastenmielinen teko Hänelle, jonka tiedetään olevan niin kristityn
kuin myös juutalaisen uskonnon perustajan. Vähän apua samaten
taitaisi olla siitä, jos minä väittäisin mahdottomiksi useita seikkoja,
joita nuo miehet —Jumala heille sen synnin anteeksi suokoon! —
ovat tuoneet esiin minua vastaan — sillä näytättehän te uskovan ne
mahdollisiksi. Ja vielä vähemmän auttaisi minua, jos selittäisin, että
minun oudot vaatteeni, puheeni sekä tapani ovat ominaiset
kansalleni — olinpa sanoa kotimaalleni, — mutta eihän meillä
olekaan omaa maata. En myöskään tahdo puolustuksekseni puhua
pahaa sortajastani, joka tuolla seisoo kuunnellen näitä valheellisia
tarinoita ja syytöksiä, joista päättäen tyranni itse olisi ollut sorron
uhrina. Jumala tuomitkoon meidän välillämme! — Mutta pikemmin
tahdon kymmenen kertaa kärsiä minkä kuoleman tahansa, johon te
katsonette hyväksi tuomita minut, kuin suostua niihin ehtoihin, joita
tämä Belialin mies on tarjonnut minulle — ystävättömälle,
turvattomalle hänen vallassaan olevalle naiselle. Mutta hän kuuluu
teidän omaan uskontokuntaanne, ja hänen pieninkin sanansa siis
tekisi tyhjäksi onnettoman juutalaistytön juhlallisimmatkin
vakuutukset. En siis tahdo kääntää häntä vastaan sitä kannetta,
jonka alainen minä olen — vaan häntä itseään — niin, Brian de Bois-
Guilbert, sinua itseäsi minä vaadin vastaamaan, ovatko nämä
syytökset minua vastaan todet vai perättömät? Eivätkö ne ole yhtä
valheellisia ja mahdottomia kuin turmiota tuottaviakin?»
Vähän aikaa oli kaikki hiljaista; kaikkien silmät olivat kääntyneet
Brian de Bois-Guilbertiä kohti. Mutta hänkin oli ääneti.
»Puhu», jatkoi Rebekka, — »jos olet kristitty, puhu! — Minä käsken
sinua säätysi puvun nimessä — isiesi suvun nimessä — sen
ritarikunnan nimessä, josta kerskailet — äitisi kunnian nimessä —
näiden kaikkien nimessä vaadin sinua ilmoittamaan, ovatko nämä
tarinat tosia?»
»Vastaa hänelle, veli», sanoi suurmestari, »jos siltä pahaltahengeltä,
jonka kanssa nyt taistelet, voit ja kykenet.»

Bois-Guilbertin sydämessä näyttivät todellakin eri tunteet taistelevan
vääristellen hänen kasvojansa, ja sortuneella äänellä hän viimein sai
sanotuksi katsahtaen rukoilevasti Rebekkaan: »Paperi! — Paperi!»
»Kas niin», virkkoi Beaumanoir, »tuo todellakin oli todistus! Tytön
loitsuilla lumottu mies-parka ei voi saada suustansa muuta sanaa
kuin sen 'paperin', johonka kirjoitetut taiat nähtävästi ovat syynä
hänen äänettömyyteensä.»
Mutta Rebekka käsitti toisella tavalla sanan, joka oli aivan kuin
väkisin päässyt Bois-Guilbertin suusta. Hän katsahti paperipalaseen,
jota hän yhä vielä piti kädessään, ja luki siitä arabialaisilla kirjaimilla
kirjoitetut sanat: Vaadi puolustajataistelijaa! Läsnäolijat puhelivat
hiljaa keskenänsä Bois-Guilbertin kummallisen vastauksen johdosta;
sillä tavoin sai Rebekka tilaisuuden kenenkään huomaamatta lukea
sekä hävittää paperin. Kuiskausten vaiettua suurmestari jälleen
lausui:
»Rebekka, sinulle ei voi olla yhtään apua tämän onnettoman ritarin
todistuksesta, jota paha henki silminnähtävästi vielä riivaa. Onko
sinulla mitään muuta sanomista?»
»On minulla vielä yksi pelastuksen mahdollisuus», sanoi Rebekka,
»jonka teidän oma ankara lakinnekin suo. Elämäni on ollut kurja —
kurja ainakin viime aikoina — mutta en kuitenkaan tahdo heittää
pois sitä Jumalan lahjaa, niin kauan kuin Hän suo minulle keinoja
sitä puolustamaan. Minä sanon, että syytökset minua vastaan ovat
valheita ja väitän olevani viaton! — Minä vaadin jumalantuomiota
kaksintaistelulla ja tahdon saada puolustajataistelijan!»
»Mutta kukahan, Rebekka», vastasi suurmestari, »kukahan on
laskeva peitsensä tanaan noidan vuoksi? Kuka tahtoisi taistella
juutalaisen puolesta?»
»Kyllä Jumala on lähettävä minulle puolenpitäjän», lausui Rebekka.
»Mahdotonta on, että iloisessa Englannissa — tässä
vieraanvaraisessa, jalomielisessä ja vapaassa maassa, missä niin
moni aina on altis antautumaan vaaraan kunnian tähden —
mahdotonta on, että tässä maassa ei olisi ainoatakaan, joka tahtoisi

taistella oikeuden puolesta. Mutta siinä on kyllin, että vaadin
jumalantuomiota kaksintaistelulla — tuossa on sormikkaani!»
Hän riisui kullalla kirjotun sormikkaan kädestänsä ja viskasi sen
suurmestarin eteen teeskentelemättömän majesteetillisella
arvokkuudella, joka ihmetytti ja ihastutti kaikkia läsnäolevia.

KAHDEKSASNELJÄTTÄ LUKU.
— — Ja vastavuoroon kintaani ma heitän
nyt jalkoihin sen korskan kavaltajan,
näin näyttäikseni kunnon ritariksi
parhaissa hänen sydänverissään.
Rikhard II.
Itse Luukas Beaumanoiriakin liikutti Rebekan ulkomuoto ja käytös.
Hän ei ollut alkujansa julma eikä edes kovaluontoinenkaan mies.
Mutta hänen luonnostaan kylmä verensä sekä ankara, vaikka
harhatielle eksynyt omatuntonsa ja lihankiduttajanelämänsä, ylen
suuri, hänelle uskottu valta sekä uskottomuuden kukistamisen ja
vääräuskoisuuden hävittämisen velvollisuus, jonka hän käsitti olevan
erittäin hänelle uskotun, ne kaikki olivat paaduttaneet hänen
sydämensä kovaksi. Hänen kasvojensa tavallinen tylyys lauhkeni,
kun hän katseli tuota edessään olevaa ihanaa olentoa, joka yksin ja
ystävittä ja kuitenkin niin luottavaisen rohkeasti piti puoliaan.
Kahdesti hän risti silmiänsä ikäänkuin epäillen itsekin, minkä voiman
vaikutuksesta oikeastaan johtuikaan hänen sydämensä tavaton
lempeys, — tuon sydämen, joka muulloin aina tämmöisissä
tilaisuuksissa oli ollut yhtä luja kuin hänen miekkansa teräs. Viimein
hän lausui:
»Tyttö, suuri on rikoksesi, jos sinä häijyillä taikakeinoilla olet
nostanut sen säälintunteen, jota nyt sydämessäni tunnen. Mutta
luulenpa pikemmin sen kuitenkin johtuvan oman pohjaltaan
lempeämmän luontoni vaikutuksesta, joka surkuttelee, että näin
suloisen muodon pitää olla pahuuden astiana. Kadu, tyttäreni —
tunnusta noituutesi — luovu ilkeästä uskostasi — suutele tätä pyhää
ristiä, ja kaikki on vielä hyvin käyvä sinulle, niin tässä kuin
toisessakin elämässä. Jossakin ankarimpien sääntöjen alaisena

elävässä naisluostarissa saat viettää loppuikäsi rukouksissa ja
sopivissa lihankurituksissa sekä siinä katumustyössä, jota syntisen ei
tarvitse koskaan katua. Tee näin ja pelasta henkesi — mitähän hyvää
Mooseksen laki on tehnyt sinulle, jotta kuolisit senvuoksi?»
»Se on isieni laki», lausui Rebekka; »se julistettiin ukkosen jyrinällä
ja myrskyn pauhinalla, pilvissä ja tuulissa, Siinain vuorelta. Senhän
tekin uskotte, jos olette kristityitä. — Se on peruutettu, sanotte te;
mutta näin eivät minun opettajani ole sanoneet minulle.»
»Astukoon», tiuskaisi Beaumanoir, »meidän kappalaisemme esiin ja
selittäköön tälle itsepäiselle uskottomalle...»
»Älkää panko pahaksi, että keskeytän», virkkoi Rebekka nöyrästi.
»Minä olen tyttö, taitamaton uskoni puolesta sanoilla taistelemaan;
mutta kuolla minä voin sen edestä, jos se on Jumalan tahto. —
Olkaa hyvä ja vastatkaa pyyntööni saada vedota jumalantuomioon.»
»Antakaa minulle hänen sormikkaansa», sanoi Beaumanoir. »Heikko
ja hieno tosiaan», jatkoi hän katsellen sormikkaan hienoa kudontaa
ja soukkia sormia — »on tämä pantti niin verisestä työstä! —
Näetkös, Rebekka, yhtä ohut ja heikko kuin tämä sinun sormikkaasi
on meidän raskaitten teräskintaittemme rinnalla, yhtä heikko on
myös sinun asiasi temppelin voiman suhteen, sillä koko
ritarikuntaamme olet sinä taisteluun vaatinut.»
»Pankaa minun viattomuuteni toiseen vaakalautaseen», vastasi
Rebekka, »niin silkkisormikkaani tulee rautakinnasta
painavammaksi.»
»Sinä siis yhä edelleen kiellät syyllisyytesi etkä tahdo peruuttaa
taisteluvaatimustasi?»
»Niin teen kuin teenkin, jalo herra», vastasi Rebekka.
»No tapahtukoon siis niin, Jumalan nimeen», lausui suurmestari, »ja
todistakoon Hän oikeuden puolesta.»
»Amen», lopettivat preceptorit hänen ympärillään, ja kaikki muutkin
läsnäolijat toistivat kovalla äänellä saman sanan.

»Veljet», lausui Beaumanoir, »te tiedätte, että me olisimme hyvin
voineet kieltää tältä naiselta sen edun, että hän saisi vedota
jumalantuomion kaksintaisteluun. Mutta vaikka hän onkin juutalainen
ja uskoton, niin onpa hän myös turvaton muukalainen, ja Jumala
varjelkoon, että häneltä kiellettäisiin meidän leppeitten lakiemme
suoja, koska hän itse sitä anoo. Sitäpaitsi me olemme ritareita ja
sotureita yhtä hyvin kuin hengellisiä miehiä, ja häpeä olisi, jos me,
millä syyllä tahansa, välttäisimme meille tarjottua taistelua. Tällainen
on siis tämän asian laita; — Rebekkaa, Iisak Yorkilaisen tytärtä, on
monen, monenlaisen ja itsessään sangen epäilyttävän seikan nojalla
syytetty siitä, että hän on harjoittanut noitakeinoja erästä meidän
veljeskuntaamme kuuluvaa jaloa ritaria kohtaan, ja hän on vedonnut
jumalantuomioon kaksintaistelulla toivoen siitä viattomuutensa
puhdistusta. Kenelle, arvoisat veljeni, tämä taistelunpantti teidän
mielestänne on annettava, ja kenenkä me samalla määräisimme
puolestamme-taistelijaksi?»
»Brian de Bois-Guilbertille, jota asia ennen muita koskee», lausui
Goodalricken preceptori, »ja joka sitäpaitsi parhaiten tietää, millä
puolella totuus tässä asiassa on.»
»Mutta jos», väitti suurmestari vastaan, »veljemme Brian on taian tai
lumouksen alainen — minä puhun ainoastaan varovaisuudesta, sillä
eihän ole toista kättä tässä meidän pyhässä säädyssämme, jolle
minä muuten mieluummin uskoisin tämän tai sitä vielä
tärkeämmänkin asian?»
»Korkea-arvoinen isä», vastasi Goodalricken preceptori, »ei mikään
lumous voi vaikuttaa häneen, joka astuu esiin taistelemaan
jumalantuomion puolesta.»
»Oikein puhuit, veli», päätti suurmestari. »Albert Malvoisin, anna
tämä taistelupantti Brian de Bois-Guilbertille. Me kehoitamme sinua,
veli», jatkoi hän kääntyen Bois-Guilbertin puoleen, »että taistelet
miehuudella uskoen oikean asian menestykseen. — Ja sinä,
Rebekka, huomaa, että sinulle määrään kolmannen päivän tästä
lukien; siihen asti saat etsiä ritaria, joka tahtoo puolestasi taistella.»

»Se on lyhyt aika», vastasi Rebekka; »kuinka muukalainen ja vielä
lisäksi vierasuskolainen voisi sen harvoina hetkinä löytää miehen,
joka hänen puolestaan panisi henkensä ja kunniansa alttiiksi
antautuen taisteluun sotataidostaan kuuluisaa ritaria vastaan.»
»En voi suoda sinulle pitempää aikaa», lausui suurmestari. »Taistelu
on taisteltava minun omien silmieni edessä, sillä useat tärkeät syyt
vaativat minua neljäntenä päivänä lähtemään täältä.»
»Jumalan tahto tapahtukoon siis!» sanoi Rebekka. »Minä turvaan
Häneen, jonka voimalla silmänräpäys on yhtä riittävä kuin koko pitkä
ihmisikä.»
»Oikein puhuit, tyttö», virkkoi suurmestari; »mutta hyvinhän
tiedämme, kuka sinussa osaa pukeutua valkeuden enkelin muotoon.
Nyt ei ole enää muuta tehtävää, kuin että määräämme soveliaan
taistelutantereen ja —jos se tulokseksi tulisi — mestauspaikan. —
Missä on tämän kartanon preceptori?»
Albert Malvoisin, joka yhä piteli Rebekan sormikasta kädessään,
puheli Bois-Guilbertin kanssa hyvin kiivaasti vaikka matalalla äänellä.
»Mitä!» kysyi suurmestari, »eikö hän tahdo ottaa panttia vastaan?»
»Kyllä hän tahtoo — kyllä hän ottaa, korkeasti kunnioitettava isä»,
vastasi Malvoisin peittäen sormikkaan oman viittansa alle. »Ja mitä
taistelutantereeseen tulee, pidän Pyhän Yrjänän turnajaiskenttää,
joka on tämän kartanon oma ja jota me käytämme
sotaharjoituksiimme, siihen soveliaimpana.»
»Hyvä on», päätti suurmestari. — »Rebekka, tälle mainitulle kentälle
sinun pitää tuoda puolustajasi. Ja jollet voi sitä tehdä tai jos
puolustajasi jumalantuomion kautta jää tappiolle, niin tulee sinun
kuolla noidan kuolema, tuomion mukaan. — Kirjoitettakoon tämä
päätökseni muistiin ja luettakoon pöytäkirja ääneen, ettei kukaan
saisi väittää, että ei ole saanut siitä tietoa.»
Eräs ritariston papeista, joka toimitti pöytäkirjurin virkaa, kirjoitti heti
tuomion paksuun kirjaan, joka sisälsi tämmöisissä juhlallisissa

kokouksissa tehdyt päätökset. Kun hän oli lopettanut
kirjoittamisensa, luki toinen pappi ääneen seuraavan:
»Rebekkaa, juutalaistyttöä, Iisak Yorkilaisen tytärtä, syytettiin
noituudesta sekä muista pahoista teoista erästä ritaria vastaan, joka
kuuluu pyhään Siionin temppelin ritaristoon. Ja hän kielsi sen
väittäen, että tänä päivänä häntä vastaan esiintuodut todistukset
olivat väärät, pahanilkiset ja kavalat. Ja hän pyysi laissa sallitulla
tavalla saada puolustaa asiaansa jonkun ritarin välityksellä, koska
hänen oma ruumiinsa ei kykene taisteluun. Ja tulee tämän hänen
puolestaan taistelevan ritarin täyttää rehellinen tehtävänsä kaikella
ritarillisella tavalla ja sellaisilla aseilla, jotka kaksintaisteluun täydesti
kuuluvat. Ja se kaikki on tehtävä juutalaistytön omalla
kustannuksella ja vaaralla. Ja näin sanoen hän tarjosi panttinsa. Ja
tämä pantti annettiin jalolle herralle ja pyhän Siionin temppelin
ritarille, Brian de Bois-Guilbertille, joka siis määrättiin taistelemaan
tätä tappelua niin säätynsä kuin myös omasta puolestaan, koska
syytetyn harjoittamat taikatemput olivat häntä vioittaneet ja
vahingoittaneet. Sentähden korkeasti kunnioitettava isä ja mahtava
herra, Luukas, Beaumanoirin markiisi, suostui mainittuun
taisteluvaatimukseen sekä myös siihen, että kanteenalainen saa
panna toisen puolestaan taistelemaan, ja määräsi suurmestari, että
mainittu tappelu on taisteltava kolmantena päivänä tästä lukien siinä
aitauksessa lähellä Templestowen preceptorio-kartanoa, jota
nimitetään Pyhän Yrjänän turnajaiskentäksi. Ja suurmestari käskee
kanteenalaisen toimittaa puolustajansa siihen paikkaan sillä uhalla,
että hän muuten tulee tuomituksi syylliseksi noitana ja
viekoittelijana. Ja pitää myös kanteen puolustajan saapua samaan
paikkaan sillä uhalla, että hänet muuten katsotaan ja tuomitaan
uskottomaksi. Ja on yllämainittu jalo herra ja korkeasti
kunnioitettava isä päättänyt, että tappelu tulee taisteltavaksi hänen
silmiensä edessä ja kaikin puolin sen mukaan, miten semmoisissa
tilaisuuksissa on katsottu sopivaksi ja hyväksi. Ja olkoon Jumala itse
oikeuden puolella!»
»Amen!» lausui suurmestari, ja kaikki läsnäolijat toistivat saman.
Rebekka ei puhunut mitään; hän vain katsahti taivaaseen päin ja

pani kätensä ristiin pysyen tässä asennossa hetken aikaa
liikahtamatta.
Sen jälkeen hän nöyrästi huomautti suurmestarille, että hänelle olisi
sallittava tilaisuus saattaa sana ystävillensä, jotta he saatuaan tiedon
hänen tilastaan voisivat mikäli mahdollista hankkia hänelle
puolustajan.
»Se on oikeuden ja kohtuuden mukaista», päätti suurmestari.
»Valitse joku sanansaattaja, johon luotat, ja hän saa vapaasti tulla
puheillesi vankihuoneeseesi.»
»Onkohan», kysyi Rebekka, »täällä ketään, joka hyvän asian vuoksi
tai runsaan palkinnon tähden tahtoisi toimittaa perille onnettoman
tytön sanan?»
Kaikki olivat vaiti; kukaan ei uskaltanut suurmestarin läsnäollessa
tunnustaa säälivänsä tuota väärän kanteen alaista vankia; jokainen
näet pelkäsi sen takia joutuvansa epäillyksi juutalaisuuden salaisesta
suosimisesta. Tätä pelkoa ei palkinnon toivokaan voinut voittaa,
saatikka sitten armeliaisuus.
Rebekka seisoi hetken aikaa sanomattoman tuskan vallassa ja
huudahti sitten: »Voiko tämä olla totta? — Pitääkö Englannissa sen
ainoan vähäisen pelastuksen toivon, joka minulle on vielä suotu,
raueta tyhjäksi siitä syystä, ettei kukaan tahdo tehdä minulle
armeliaisuuden työtä, jota muuten ei kielletä paatuneimmaltakaan
pahantekijältä?»
Vastasipa silloin viimein Higg Snellinpoika: »Minä olen vain vaivainen
mies, mutta tämän tytön armeliasta apua saan kiittää siitä, että voin
senkin verran kävellä ja liikkua. Minä lähden siis toimittamaan
asiasi», lisäsi hän kääntyen Rebekan puoleen, »niin hyvin kuin
vaivainen raukka voi, ja iloinen olisin, jos jalkojeni nopeus vielä voisi
parantaa kieleni tuottaman pahan. Voi, voi! Kun kehuin sinun
armeliaisuuttasi, niin enpä osannut aavistaa, että sillä saatoin sinut
vaaraan!»
»Jumala», virkkoi Rebekka, »kaikki asiat säätää. Hän voi
heikoimmankin välikappaleen avulla lakkauttaa Juudaan kansan

vankeuden. Ja etana saisi tämän asiani toimeen yhtä varmaan kuin
haukka. Käy etsimään käsiisi Iisak Yorkilaista — tässä on rahaa
hevosen ja miehen elatukseksi — ja vie hänelle tämä paperi. — En
tiedä, taivaastako tämä ajatus mieleeni johtui, mutta lujimmalla
luottamuksella uskon, että kuolema ei ole tuleva osakseni ja että
minulle on puolustaja nouseva. Jää hyvästi! —Elämäni tai kuolemani
riippuvat sinun joutuisuudestasi!»
Mies otti paperin, joka sisälsi vain muutamia hepreankielisiä rivejä.
Moni katsojajoukosta kielsi häntä koskemasta tuohon
epäluulonalaiseen kirjeeseen, mutta Higg oli lujasti päättänyt auttaa
hyväntekijätään. »Hän on pelastanut henkeni», sanoi hän, »ja minä
uskon varmasti, ettei hän tahdo saattaa sieluani hukkaan. Minä
koetan», hän lisäsi, »saada lainaan naapurini Burthonin kelpo juhdan
ja riennän sitten Yorkiin niin kiireesti kuin vain mies ja hevonen
jaksavat.»
Mutta eipä hänen tarvinnutkaan mennä niin kauas. Noin puolen
virstan päässä preceptorio-kartanon portilta hän kohtasi kaksi
ratsumiestä, jotka hän puvuista ja korkeista, keltaisista lakeista tunsi
juutalaisiksi. Ja vielä lähemmäksi saavuttuaan hän huomasi, että
toinen heistä olikin hänen entinen isäntänsä Iisak Yorkilainen. Toinen
oli rabbiini Ben Samuel. Molemmat miehet olivat kuultuansa, että
suurmestari piti ritaristonkokousta noidan tuomitsemista varten,
tulleet niin lähelle preceptorio-kartanoa kuin heidän pelkonsa salli.
»Veli Ben Samuel», sanoi Iisak, »sieluni on levoton, vaikk'en oikein
tiedä siihen syytä. Tuommoisia noitakanteita on usein ennenkin
keksitty peitteeksi kansamme tuomioksi haudotuille pahoille
hankkeille.»
»Ole huoleti, veikkoseni», lohdutti lääkäri. »Mikä hätä sinun on olla
tekemisissä nasarealaisten kanssa, kun sinulla on tarpeeksi tuota
väärää mammonaa, jolla voit ostaa heiltä vapauden — hallitseehan
kulta noiden jumalattomien miesten sydämiä yhtä voimallisesti kuin
mahtavan Salomonin sinetin sanotaan hallinneen pahoja henkiä. —
Mutta mikä vaivais-parka tuolla kömpii tännepäin kainalosauvojensa
nojassa arvattavasti minun puheilleni? — Veikkonen», lisäsi lääkäri

puhuen Higg Snellinpojalle, »kyllä kernaasti autan sinua taidollani,
mutta en koskaan anna ropoakaan maantiekerjäläiselle. Hyi häpeää!
— Ovatko jalkasi halvatut? No, sitten elätä itseäsi kättesi työllä. Sillä
vaikk'et juuri kelpaa joutuisaksi sanansaattajaksi etkä huolelliseksi
paimeneksi etkä sotamieheksi etkä hätäisen herran palvelijaksi, niin
onpahan niitä kuitenkin töitä... Mitä nyt, veli?» hän keskeytti korean
puheensa katsahtaen Iisakiin, joka vain vilkaistuaan Higgin tuomaan
paperiin parahti kovasti, putosi muulinsa selästä kuin kuollut ja
makasi hetken aikaa tunnottomana maassa.
Rabbiini hyppäsi säikähtyneenä hänkin alas juhtansa selästä ja koetti
toinnuttaa matkakumppaniansa semmoisilla lääkkeillä, jotka hän tiesi
hyviksi. Olipa hän ottanut suoneniskuraudankin taskustansa aikoen
sen voimalla virotella onnetonta miestä henkiin, kun tämä tointui jo
itsestään. Ensi työkseen Iisak repi lakin päästään ja ripotti tomua
harmaihin hiuksiinsa. Lääkäri luuli tämän äkillisen ja kovan
mielenliikutuksen raivonpuuskaksi ja aikoi taas ottaa esiin kojeensa,
mutta Iisakin puheesta hän pian pääsi asian perille.
»Surunlapseni», valitti juutalainen, »paremmin sopisi sinulle nimi
Benoni kuin Rebekka. Miksi pitää sinun kuolemallasi saattaa harmaat
hiukseni hautaan, niin että katkerana kiroon Jumalaa ja kuolen!»
»Veljeni», virkkoi rabbiini suuresti hämmästyneenä, »oletko
tosiaankin Israelin seurakunnan vanhimpia, kun tämmöisiä sanoja
päästät suustasi? Tottahan toivoakseni huoneesi lapsi vielä elää?»
»Elää hän vielä», vastasi Iisak; »mutta hän elää niinkuin Daniel, jota
nimitettiin Belsassariksi, eli leijonanluolassa. Hän on vankina noiden
Belialin miesten vallassa, ja he aikovat harjoittaa julmuuttaan häntä
vastaan armahtamatta hänen nuoruuttaan ja kauniita kasvojaan. Voi,
voi! Hän oli kuin vihreistä palmunlehdistä punottu seppele harmailla
hiuksillani; ja nyt hänen täytyy yhdessä yökaudessa lakastua kuten
Joonaan kurpitsa! — Rakkauteni lapsi! Vanhuuteni lapsi! Voi
Rebekka, Raakelini lapsi! Kuoleman varjon pimeys on sinut
peittänyt.»

»Mutta luehan tuo paperi», neuvoi rabbiini; »kenties me vielä
löydämme pelastuskeinon.»
»Lue sinä, veli», vastasi Iisak, »sillä silmäni ovat kuin vesilähde.»
Lääkäri luki siis omalla kielellään seuraavat sanat:
»Iisakille, Adonikamin pojalle, jota pakanat nimittävät Iisak
Yorkilaiseksi: rauhaa ja lupauksen siunausta vuotakoon
runsaasti ylitsesi! — Isäni, minä olen kuin se, joka on tuomittu
kuolemaan pahanteosta, mistä ei sieluni tiedä mitään —
nimittäin noituudesta. Isäni, jos löytyisi jostakin väkevä mies,
joka tahtoisi puolestani taistella miekalla ja peitsellä
nasarealaisten tavan mukaan Templestowen turnajaistantereella
kolmantena päivänä tästä lähtien, niin meidän isiemme Jumala
kukaties suo sille miehelle voimaa puolustaa viatonta ja
turvatonta. Mutta jollei semmoista miestä löydetä, niin käske
kansamme tyttärien itkeä minua niinkuin kadonnutta itketään, ja
niinkuin metsäkaurista, jonka metsästäjä on ampunut, ja kuin
kukkasta, jonka niittäjän viikate on katkaissut. Sentähden katso,
mitä voit tehdä ja onko pelastus mahdollinen. Eräs
nasarealaissoturi ehkä kyllä tarttuisi miekkaan puolestani,
nimittäin Wilfred, Cedrikin poika, jota pakanat nimittävät
Ivanhoeksi. Mutta hän luultavasti ei vielä kykene kantamaan
rautapukua. Lähetä sittenkin, oi isä, hänelle sanoma tästä; sillä
hänellä on ystäviä kansansa väkevien miesten joukossa, ja
koska hän vankeudessa oli meidän kärsimystoverimme, niin
kenties hän hankkii minulle puolustajan. Ja sano hänelle, että
Rebekka, olipa elämä tai kuolema hänelle sallittu, on eläessään
ja kuollessaan aivan viaton siitä rikoksesta, josta häntä
syytetään. Ja jos niin olisi Jumalan tahto, että sinun täytyy
kadottaa tyttäresi, älä, vanha rakas isäni, kauemmin viivy tässä
verenvuodatuksen ja julmuuden maassa, vaan muuta pois
Cordovaan, missä veljesi elää hyvässä turvassa Boabdil
Saraseeniläisen valtaistuimen suojassa. Sillä maurilaisten
julmuus ei ole niin julma Jaakobin sukua vastaan kuin Englannin
nasarealaisten julmuus.»

Niin kauan kuin Ben Samuel luki kirjettä, kuunteli Iisak sitä
jokseenkin lujalla mielellä. Mutta sitten hän taas rupesi itämaiseen
tapaan osoittamaan suruansa liikkeillään ja parkumisellaan, repien
vaatteitansa, ripottaen maantien tomua tukkaansa ja huutaen: »Voi
tytärtäni! Voi tytärtäni! Voi sinua, joka olet lihaa lihastani ja luuta
luustani!»
»Mutta rohkaise mielesi», lohdutti rabbiini, »sillä surusta ei nyt ole
apua. Sonnusta kupeesi ja mene etsimään tuota Wilfrediä, Cedrikin
poikaa. Kukaties hän voi auttaa sinua neuvoillaan tai voimallansa;
sillä tuo nuorukainen on suuressa suosiossa Rikhard-kuninkaan
luona, jota nasarealaiset nimittävät Leijonamieleksi, ja huhu tämän
kuninkaan kotiinpaluusta on yhä varmempana levinnyt ympäri
maata. Saattaisi käydä niin, että kuningas antaa hänelle kirjeen ja
sinetin kieltäen noita verisiä miehiä, jotka temppelin häväistykseksi
ovat ottaneet itselleen temppeliritarien nimen, toteuttamasta tätä
aikomaansa pahuutta.»
»Minä lähden heti häntä hakemaan», virkkoi Iisak, »sillä hän on
hyvä nuorukainen ja armahtavainen Jaakobin lapsia kohtaan heidän
maanpakolaisuudessaan. Mutta hän ei kykene pukemaan ylleen
rautavaruksia, ja kuka toinenkaan rupeaisi taistelemaan Siionin
poljettujen lasten puolesta?»
»Älähän», sanoi rabbiini; »puhuthan nyt niinkuin se, joka ei tunne
pakanoitten mieltä. Kullalla voit heidän apunsa ostaa, aivan samalla
tavalla kuin voit kullalla lunastaa itsesi heistä vapaaksi. Ole huoleti ja
lähde hakemaan tuota Wilfred Ivanhoeta. Minäkin nousen ja ryhdyn
toimiin, sillä suuri synti olisi, jos jättäisin sinut yksiksesi tässä
pulassa. Minä riennän Yorkin kaupunkiin, missä on monta sotaherraa
ja väkevää miestä koolla, ja heidän paristaan, sitä älä epäilekään,
löydän kyllä jonkun, joka ottaa taistellakseen tyttäresi puolesta. Sillä
kulta on heidän jumalansa, ja rikkauden vuoksi he panevat henkensä
yhtä kernaasti kuin maansakin alttiiksi. — Tottahan sinä, veli, sitten
täytät, mitä lupaan heille sinun nimessäsi?»
»Tietysti, veli», vastasi Iisak, »ja siunattu olkoon Jumala, että hän
tässä hädässäni soi minulle lohduttajan. Älä sittenkään oitis suostu

heidän vaatimukseensa, sillä saatpa nähdä, että tällä kirotulla
kansalla on tapana vaatia leiviskä ja lopulta kuitenkin tyytyä luotiin.
— Mutta olkoon kuitenkin, niinkuin tahdot, sillä mitä apua olisikaan
minulla kaikesta kullastani, jos rakkauteni lapsi hukkaantuisi?»
»Hyvästi», sanoi lääkäri, »ja tapahtukoon, niinkuin sydämesi
halajaa.»
He syleilivät toisiansa ja lähtivät sitten kumpikin haaralleen.
Vaivainen talonpoika jäi vielä vähäksi aikaa paikoilleen katsellen
heidän jälkeensä.
»Te juutalaiskoirat», kirosi hän; »ettehän pidä enempää lukua
vapaasta miehestä, kuin olisi hän osto-orja tai turkkilainen tai
vaikkapa vain ympärileikattu hebrealainen niinkuin te! Olisivatpa nuo
toki voineet viskata minulle äyrin tai kaksikin palkakseni. Mikä pakko
minun oli kuljettaa heidän jumalattomia koukeroitaan, jotka kenties
voivat loihtia minutkin, niinkuin usea varoitti lähtiessäni. Ja mitä
apua minulle on tästä kultakappaleesta, jonka tyttö minulle antoi, jos
ensi pääsiäisenä saan sen vuoksi toruja papilta, joka ottaa minulta
kaksi sen vertaa syntini sovittajaisiksi, ja jos minun kenties vielä
päälliseksi täytyy koko ikäni pitää hyvänäni haukkumanimeä
'juutalaisen postimies'? Taisinpa tosiaankin olla noiduttu seistessäni
lähellä tuota tyttöä! —Mutta niinhän aina on käynyt kaikkien, niin
juutalaisten kuin kristittyjen, jotka sattuvat hänen seuraansa — ei
kukaan voinut olla tottelematta, kun tyttö lähetti jollekin asialle — ja
nytkin, kun häntä muistelen, antaisin koko työhuoneeni sekä kaikki
työkaluni, jos hänet sillä saisin lunastetuksi.»

YHDEKSÄSNELJÄTTÄ LUKU.
Oi, tyttö, kylmä ja leppymätön,
minun ylpeä mielen' on myös.
SEWARD.
Iltahämärissä samana päivänä, jolloin edelläkerrottua
oikeudenistuntoa (jos sitä sellaiseksi voi sanoa) oli pidetty,
kolkutettiin Rebekan vankihuoneen ovelle. Tätä kolkutusta ei kuullut
huoneen asukas, joka par'aikaa luki iltarukoustaan uskontonsa
käskyn mukaan ja lopuksi veisasi tämän virren:
Kosk' Israel, kansa Jumalan,
läks ulos maasta orjuuden,
edellä nähtiin kulkevan
oppaana patsaan tulisen.
Päivällä savupilvenä
se kulki verkkaan kulkuaan,
ja yöllä hehkuin helein
punasi hiekat erämaan.
Ylistysvirret kaikuivat
kanss' pasuunain ja symbaalein
ja yhdess' äänet raikuivat
Siionin impein, sankarein.
Mut ihmeet meit' ei auta nyt,
kansamme Herra hylkäsi;
Sun tieltäis se on erinnyt,
siis otit siltä kätesi.
Siionin alttarilta ei
nyt nouse savu tupruttain,

ja kauniit kanteleemme jäi
pilkattavaksi pakanain.
Mut sikain vert' et vaadikaan,
et uuhten lihaa uhrikses;
katuva, nöyrä sydän vaan
on mieluisin sun mielelles.
Kun Rebekan hurskaan virren säveleet olivat vaienneet, kuului
hiljainen kolkutus uudestaan. »Astu sisään», virkkoi Rebekka, »jos
olet ystävä; ja vaikka olisit vihamieskin, ei minulla ole voimaa estää
sinua sisään tulemasta.»
»Minä olen», sanoi Brian de Bois-Guilbert astuen huoneeseen,
»ystävä tai vihamies siitä riippuen, kuinka meidän keskustelumme
tulee päättymään.»
Nähdessään tuon miehen, jonka irstasta himoa Rebekka piti
alkusyynä onnettomaan kohtaloonsa, hän varovaisella, mutta
kuitenkin pelottomalla liikkeellä perääntyi vankilansa syrjäisimpään
sopukkaan. Näytti kuin hän olisi päättänyt väistyä temppeliherran
tieltä niin paljon kuin mahdollista, mutta sitten pysyä lujasti
paikallansa, kun hän ei enää voinut päästä edemmäksi. Hän
seisahtui siihen, ja hänen kasvonsa ilmaisivat mielenlujuutta,
vaikkakaan ei uhmaa. Selvästi näkyi, että hän ei tahtonut yllyttää
vastustajaansa väkivaltaan, mutta oli päättänyt kaikella voimallansa
panna vastaan, jos Bois-Guilbert yritti tehdä väkivaltaa.
»Ei teidän tarvitse pelätä minua, Rebekka», virkkoi temppeliherra,
»tai jos vielä tarkemmaksi oikaisen puheeni, teidän ei tarvitse
ainakaan nyt pelätä minua.»
»En teitä pelkääkään, herra ritari», vastasi Rebekka, vaikka hänen
henkensä ahdistus tahtoi tehdä tyhjäksi sanojen uljuuden.
»Luottamukseni on luja, minä en pelkää teitä.»
»Siihen ei olekaan syytä», virkkoi Bois-Guilbert vakavana; »entisiä
hurjia yrityksiäni teidän ei nyt tarvitse pelätä. Tässä on vartijoita
lähellä, joita voitte kutsua avuksi ja jotka eivät ole minun
käskettäviäni. Heillä on määränä viedä teidät kuolemaan, Rebekka;

mutta he eivät sallisi kenenkään, kaikkein vähimmin minun, loukata
teitä, jos hulluuteni — sillä hulluutta se todella on — ajaisi minut
semmoisiin tekoihin.»
»Jumala olkoon ylistetty siitä!» lausui juutalaistyttö; »kuolemaa minä
kaikesta vähimmin pelkään tässä pahuuden pesässä.»
»Niin», vastasi temppeliherra, »peloton sydän taipuu helposti
kuolemaan, jos matka sinne on lyhyt ja avoin. Peitsenpistosta tai
miekansivalluksesta minäkään en suuresti surisi — eikä teitä peloita
hyppäys pyörryttävän korkealta muurilta tai terävän väkipuukon
pisto —ne eivät ole meidän mielestämme niin hirmuiset kuin se, mitä
pidätte häpeänä. Kuule minua — mitä sanon, Rebekka — minun
kunniantuntoni on kenties yhtä herkkä kuin sinunkin; ja molemmat
me osaamme yhtä hyvin kuolla sen vaatiessa.»
»Onneton mies», sanoi juutalaistyttö, »onko sinun siis pakko antaa
henkesi alttiiksi semmoisten ajatusten tähden, joita kylmäverisenä
ollessasi et itsekään usko? Se tosiaankin on kalliin aarteen
vaihtamista tavaraan, joka ei ole leipää. Mutta älä luule, että minun
laitani on sama. Jos sinun aikomuksesi ajeleekin ihmismielen hurjilla,
vaihtelevilla laineilla, niin minun päätökseni on laskenut ankkurinsa
ikikallioon.»
»Vaiti, tyttö», vastasi temppeliherra, »semmoisista puheista ei nyt
ole paljon apua. Sinua ei ole tuomittu nopeaan ja helppoon
kuolemaan, joka onnettomalle on mieluisaa ja toivottomalle
tervetullut, vaan hitaaseen ja tuskalliseen kidutukseen, jonka
julmuus on yhtä suuri kuin se rikos, mistä noiden ihmisten
perkeleellinen taikauskoisuus sinua syyttää.»
»Ja kenenkä — jos sellainen kohtalo uhkaa minua — kenenkä syytä
se onkaan?» intti Rebekka; »tietysti hänen, joka ajatellen vain omaa
petomaista himoansa väkisin raahasi minut tänne ja joka nyt, en
tiedä missä tarkoituksessa, suurentelee minua uhkaavan kohtalon
hirmuisuutta.»
»Älä usko», sanoi temppeliherra, »että olen saattanut sinut tähän
tilaan. Minä olisin tahtonut suojella sinua tätäkin vaaraa vastaan

omalla ruumiillani yhtä hartaasti kuin peittelin sinua nuolilta, jotka
muuten olisivat sinut surmanneet.»
»Jos tarkoituksesi olisi ollut viattoman tytön kunniallinen
suojeleminen», virkkoi Rebekka, »niin olisin sinua kiittänyt
huolenpidostasi. — Mutta niinkuin asia nyt on, olet niin monta kertaa
vaatinut siitä sellaista palkintoa, etten pidä elämääni minkään
arvoisena, jollei se voi säilyä muulla kuin sinun vaatimallasi
hinnalla.»
»Lakkaa jo moittimasta minua, Rebekka», sanoi temppeliherra.
»Minulla on itsellänikin paljon syytä tuskaan enkä kärsi, että enennät
sitä moitteillasi.»
»Mikä sitten on tarkoituksenne, herra ritari?» kysyi juutalaistyttö.
»Puhukaa lyhyesti. Jos teillä täällä on muuta tekemistä kuin että
tulitte katsomaan onnettomuutta, johon olette syypää, niin
ilmoittakaa se minulle. Ja sitten olkaa armelias ja jättäkää minut
yksin. Askel tästä ajallisesta maailmasta iankaikkiseen elämään on
lyhyt, mutta hirvittävä, ja minulla on vain muutamia harvoja hetkiä
valmistusaikaa siihen.»
»Minä näen, Rebekka», virkkoi Bois-Guilbert, »että yhä vielä pidät
minua syypäänä onnettomuuteesi, vaikka kuitenkin hartain haluni
olisi ollut pelastaa sinut siitä.»
»Herra ritari», sanoi Rebekka, »mielelläni jättäisin kaikki moitteet
sikseen. Mutta mikä on sen varmempaa, kuin että hillitön himonne
on syynä minun kuolemaani?»
»Sinä erehdyt — sinä erehdyt», — jatkoi temppeliherra kiireesti,
»kun luulet minun tarkoituksekseni tai teokseni sellaista, mitä en
voinut estää enkä edes ennakolta arvatakaan. — Kuinka minä osasin
ajatella, että tänne äkisti tulisi tuo ukko-hupakko, jonka jotkut hurjan
uljuudenpuuskat ja hupsujen ylistämät, järjettömät lihankidutukset
ovat kohottaneet paljon ylempään paikkaan, kuin mitä hän ansaitsisi,
ylempään kuin terve järki sallisi, ylemmäksi minua ja ylemmäksi
satoja muita meidän säätymme ritareita, jotka ajatuksissaan ja

tunteissaan ovat vapaat kaikista noista tyhmistä ja turhista
hullutuksista, joita hän aina tottelee?»
»Mutta istuittehan tekin», väitti Rebekka vastaan, »tuomitsemassa
minua, joka olen viaton, aivan viaton, niinkuin te itse hyvin tiedätte.
Tekin olitte osallinen siinä päätöksessä, joka määräsi minulle
kuoleman, ja jos oikein ymmärsin, te tulette itse miekallanne
todistamaan syyllisyyteni ja vahvistamaan tuomioni.»
»Malta, tyttö», vastasi temppeliritari. »Onhan sinun heimosi
paremmin kuin mikään muu kansa aina osannut taipua asianhaaroja
myöten ja käännellä laivansa kokkaa, niin että ovat hyväkseen
käyttäneet vastatuuliakin.»
»Kirottu olkoon se hetki», virkkoi Rebekka, »joka Israelin suvulle
opetti sen taidon. Mutta kova onni masentaa sydämet, niinkuin tuli
taivuttaa jäykkää terästäkin; ja niiden, joilla ei enää ole omaa valtaa
eikä omaa vapaata, itsenäistä kotimaata, täytyy kumartaa
muukalaista. Se on kansamme kirous, herra ritari, joka epäilemättä
on ansaittu palkka meidän omista ja esi-isiemme pahoista teoista.
Mutta paljon suurempi on häpeä, kun te — te, joka kehutte vapautta
synnynnäiseksi oikeudeksenne — näin alennatte itseänne ja vasten
omaa parempaa tietoanne kiitätte meidän pahaa tapaamme.»
»Sinun sanasi ovat katkerat, Rebekka», virkkoi Bois-Guilbert astuen
suuttuneena edestakaisin huoneessa; »mutta enpä tullutkaan tänne
sinun kanssasi moitteita vaihtamaan. — Bois-Guilbert, huomaa se, ei
väisty kenenkään kuolevaisen pelosta tieltään, vaikka hän
asianhaarain pakosta saattaa vähän aikaa kulkea kiertotietä. Minun
tahtoni on kuin vuorivirta, joka kallion vastaan sattuessa tosin
hetkeksi painuu syrjään, mutta lakkaamatta kuitenkin jatkaa
kulkuansa valtamerta kohti. Tuo paperi, joka antoi sinulle neuvon
pyytää jumalantuomiota kaksintaistelulla, keneltä sen luulet tulleen,
jollei Bois-Guilbertiltä? Kuka toinen olisi niin hartaasti pitänyt sinusta
huolta?»
»Lyhyt viivytysaika ennen kuolemaa», sanoi Rebekka, »josta ei
minulle tule suurta apua — siinäkö kaikki, mitä voitte tehdä sen

hyväksi, jonka päähän olette sälyttänyt raskaan surun kuorman ja
jonka olette saattanut avatun haudan partaalle?»
»Ei, tyttö», vastasi Bois-Guilbert, »siinä ei ollut kaikki, mitä aioin
tehdä. Jollei asiaan olisi sekaantunut taikauskoinen höperö ukko ja
hupsu Goodalricke, joka muka, vaikka hän on temppeliherra, on
ajattelevinaan ja päättävinään tavallisten ihmislakien mukaan, niin
olisi tavallinen ritari, eikä mikään preceptori, tullut määrätyksi
meidän veljeskuntamme puolustusmieheksi. Sitten olisin minä itse —
semmoinen oli ajatukseni — torven torahtaessa ratsastanut
tantereelle pitämään sinun puoltasi puettuna vaeltavaksi ritariksi,
joka hakee taisteluita kilpensä ja peitsensä vahvuuden todistukseksi.
Ja sitten vaikka Beaumanoir olisi valinnut kenen hyvänsä täällä
olevista säätyveljistäni, vaikkapa kaksi tai kolmekin, niin olisin, sen
tiedän, yksin peitselläni sysännyt heidät satulasta maahan. Tällä
tavoin, Rebekka, olisin todistanut viattomuutesi, ja sinun
kiitollisuudeltasi olisin lujalla luottamuksella toivonut palkintoa
voitostani.»
»Nyt te, herra ritari», sanoi Rebekka, »vain turhaan kerskailette siitä,
mitä muka olisitte tehnyt, jollette olisi katsonut paremmaksi tehdä
toisin. Mutta te otitte vastaan sormikkaani; ja minun puolustajani,
jos näin onnettomalle olennolle ilmestyykään semmoista, tulee
tantereella taistelemaan teidän peistänne vastaan, ja sittenkin te
sanotte olevanne muka minun ystäväni ja suojelijani!»
»Sinun ystäväsi ja suojelijasi», sanoi temppeliherra vakavasti,
»tahdon vieläkin olla, — mutta huomaa, mikä häväistys siitä voi
koitua minulle, tai oikeammin sanoen, varmasti on koituva minulle.
Älä siis moiti minua, jos asetan muutamia ehtoja, ennenkuin
juutalaistytön pelastukseksi uhraan kaikki, mitä tähän asti olen
pitänyt kalliina.»
»Puhukaa», virkkoi Rebekka, »en teitä ymmärrä.»
»Hyvä», sanoi Bois-Guilbert; »minä tahdon puhua ajatukseni yhtä
peittämättömästi kuin taikauskoinen syntinen puhuu papille
rippituolissa. — Rebekka, jos minä en saavu tuohon taisteluun, niin

menetän virkani ja kunniani — menetän sen, mikä minulle on yhtä
kallista kuin sieraimieni henki, menetän — sanon minä —
säätyveljieni kunnioituksen ja kaiken toivon sen mahtavan vallan
perimisestä, jota nyt tuo taikauskoinen ukko-hupakko Luukas de
Beaumanoir pitää kädessään ja jota minä käyttäisin ihan toisiin
tarkoituksiin. Semmoinen tulee olemaan välttämätön kohtaloni, jollen
tartu peitseen sinua vastaan. Kirous Goodalrickelle, joka saattoi
minut tähän satimeen! Ja kaksin kerroin kirottu olkoon Albert de
Malvoisin, joka esti minua ensi hetkenä tehdystä päätöksestäni. Sillä
aioinhan minä nakata sormikkaasi tuolle taikauskoiselle, vanhalle
hupsulle itselleen vasten silmiä, koska hän otti korviinsa niin hullun
kanteen, joka oli nostettu näin jalomielistä, sulomuotoista olentoa
vastaan!»
»Ja mitä apua on nyt kaikista näistä suurista ja makeista sanoista?»
vastasi Rebekka. »Sinulla oli kaksi ehtoa: joko viattoman naisen
veren vuodattaminen tai oman maallisen korkeutesi ja maallisten
toivojesi menettäminen. — Mitä apua on siitä, että siitä enää
puhelemme? Sinun valintasi on jo tehty.»
»Ei, Rebekka», sanoi ritari lauhkeammalla äänellä lähestyen neitoa,
»valintani ei ole vielä lopullisesti tehty — ei, huomaa se; sinulla on
nyt valitsemisen valta. Jos menen taisteluun, niin täytyy minun
ylläpitää sotamainettani; ja jos niin teen, on sinun kuolemasi
tuliroviolla välttämätön. Sillä koko maailmassa ei ole yhtään ritaria,
lukuunottamatta Rikhard Leijonamieltä ja hänen suosikkiaan
Ivanhoeta, joka minun kanssani taistellessa on päässyt voitolle tai
edes ollut täysin vertaiseni. Mutta Ivanhoe, senhän hyvin tiedät, on
nyt kykenemätön rautahaarniskaa kantamaan, ja Rikhard on
vieraassa maassa vankeudessa. Jos minä menen taisteluun, niin et
voi kuolemaasi välttää, vaikka kauneutesi nostaisikin jonkun
kuumaverisen nuorukaisen puolustajaksesi.»
»Ja mitä apua on siitä, että kerrot tätä minulle niin moneen
kertaan?» kysyi Rebekka.
»Paljon», vastasi temppeliherra, »sillä sinun on tarkastettava
kohtaloasi kaikilta puolilta.»

»Hyvä on, käännä sitten kuva», sanoi juutalaistyttö, »ja näytä
minulle sen toinen puoli.»
»Jos minä», jatkoi Bois-Guilbert, »menen tuohon kirottuun
taisteluun, niin sinun täytyy kuolla hidas, julma kuolema, samassa
piinassa, jonka sanotaan määrätyn toisessa maailmassa syyllisille.
Jollen mene taisteluun, niin olen virkani ja kunniani menettänyt
ritari, jota haukutaan noitien ja uskottomien liittolaiseksi — sukuni
kuuluisa nimi, jonka olen itse tehnyt vielä kuuluisammaksi, on
muuttuva soimaus- ja pilkkanimeksi. Minä menetän maineeni,
menetän kunniani, menetän toivoni päästä korkeuteen, jonka
vertaiseen keisaritkin harvoin pääsevät; minä uhraan hartaan
kunnianhaluni, jätän kesken hankkeeni, jotka ovat rakennetut yhtä
korkealle kuin ne vuoret, joita myöten jättiläiset, pakanallisen tarun
mukaan, yrittivät kiivetä taivaaseen. — Ja kuitenkin, Rebekka», lisäsi
hän langeten polvilleen tytön jalkojen juureen, »kaiken tämän
korkeuden tahdon uhrata, kaiken tämän maineen tahdon hylätä,
kaiken tämän vallan jättää, — nytkin, kun käteni jo on siihen
ylettymäisillään, — jos vain sinä sanoisit: Bois-Guilbert, minä sallin
sinun rakastaa itseäni.»
»Heittäkää jo nämä mielettömät ajatukset, herra ritari», vastasi
Rebekka. »Rientäkää sen sijaan leskikuningattaren ja prinssi
Juhanan luokse — he eivät voi, Englannin kruunun kunnian tähden,
sallia teidän suurmestarinne tehdä tämmöistä. Tällä keinolla tulisin
pelastetuksi ilman uhrausta teidän puolestanne, ja teidän saamatta
tekosyytä vaatia palkkiota uhrinne korvaukseksi.»

Welcome to our website – the perfect destination for book lovers and
knowledge seekers. We believe that every book holds a new world,
offering opportunities for learning, discovery, and personal growth.
That’s why we are dedicated to bringing you a diverse collection of
books, ranging from classic literature and specialized publications to
self-development guides and children's books.
More than just a book-buying platform, we strive to be a bridge
connecting you with timeless cultural and intellectual values. With an
elegant, user-friendly interface and a smart search system, you can
quickly find the books that best suit your interests. Additionally,
our special promotions and home delivery services help you save time
and fully enjoy the joy of reading.
Join us on a journey of knowledge exploration, passion nurturing, and
personal growth every day!
ebookbell.com

Methods Of Biochemical Analysis Vol 19 David Glick

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Methods Of Biochemical Analysis Vol 19 David Glick

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 5

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Slide 66

Slide 67

Slide 68

Slide 69

Slide 70

Slide 71

Slide 72

Slide 73

Slide 74

Slide 75

Slide 76

Slide 77

Slide 78

Slide 79

Slide 80