Mycobacteria Protocols 4th Tanya Parish Anuradha Kumar

Mycobacteria Protocols 4th Tanya Parish Anuradha
Kumar download
https://ebookbell.com/product/mycobacteria-protocols-4th-tanya-
parish-anuradha-kumar-47694684
Explore and download more ebooks at ebookbell.com

Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Mycobacteria Protocols Second Edition 2nd Edition John T Belisle
https://ebookbell.com/product/mycobacteria-protocols-second-
edition-2nd-edition-john-t-belisle-4288202
Mycobacteria Protocols 3rd Edition Tanya Parish David M Roberts Eds
https://ebookbell.com/product/mycobacteria-protocols-3rd-edition-
tanya-parish-david-m-roberts-eds-5032706
Mycobacterium Tuberculosis Protocols 1st Edition Nicola Casali
https://ebookbell.com/product/mycobacterium-tuberculosis-
protocols-1st-edition-nicola-casali-4327060
Mycobacterium Ulcerans Methods And Protocols 1st Edition Gerd Pluschke
https://ebookbell.com/product/mycobacterium-ulcerans-methods-and-
protocols-1st-edition-gerd-pluschke-35986056

Pathogenic Mycobacteria In Water A Guide To Public Health Consequences
Monitoring And Management Who Emerging Issues In Water Infectious
Disease S Pedley
https://ebookbell.com/product/pathogenic-mycobacteria-in-water-a-
guide-to-public-health-consequences-monitoring-and-management-who-
emerging-issues-in-water-infectious-disease-s-pedley-2330268
Pathogenic Mycobacteria In Water A Guide To Public Health Consequences
Monitoring And Management
https://ebookbell.com/product/pathogenic-mycobacteria-in-water-a-
guide-to-public-health-consequences-monitoring-and-management-4653632
The Ecology Of Mycobacteria Impact On Animals And Humans Health 1st
Edition Jindrich Kazda
https://ebookbell.com/product/the-ecology-of-mycobacteria-impact-on-
animals-and-humans-health-1st-edition-jindrich-kazda-4288332
Molecular Genetics Of Mycobacteria 2nd Edition Graham F Hatfull
William R Jacobs
https://ebookbell.com/product/molecular-genetics-of-mycobacteria-2nd-
edition-graham-f-hatfull-william-r-jacobs-4922458
Zoonotic Tuberculosis Mycobacterium Bovis And Other Pathogenic
Mycobacteria 3rd Edition Charles O Thoen James H Steele John B Kaneene
https://ebookbell.com/product/zoonotic-tuberculosis-mycobacterium-
bovis-and-other-pathogenic-mycobacteria-3rd-edition-charles-o-thoen-
james-h-steele-john-b-kaneene-51287498

Mycobacteria
Protocols
Tanya Parish
Anuradha Kumar Editors
Methods and Protocols
Fourth Edition
Methods in
Molecular Biology 2314

METHODS INMOLECULARBIOLOGY
Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, UK
For further volumes:
http://www.springer.com/series/7651

For over 35 years, biological scientists have come to rely on the research protocols and
methodologies in the critically acclaimedMethods in Molecular Biologyseries. The series was
the ﬁrst to introduce the step-by-step protocols approach that has become the standard in all
biomedical protocol publishing. Each protocol is provided in readily-reproducible step-by-
step fashion, opening with an introductory overview, a list of the materials and reagents
needed to complete the experiment, and followed by a detailed procedure that is supported
with a helpful notes section offering tips and tricks of the trade as well as troubleshooting
advice. These hallmark features were introduced by series editor Dr. John Walker and
constitute the key ingredient in each and every volume of theMethods in Molecular Biology
series. Tested and trusted, comprehensive and reliable, all protocols from the series are
indexed in PubMed.

MycobacteriaProtocols
Fourth Edition
Edited by
Tanya Parish and Anuradha Kumar
Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children’s Research Institute, Seattle, WA, USA

Editors
Tanya Parish
Center for Global Infectious Disease Research
Seattle Children’s Research Institute
Seattle, WA, USA
Anuradha Kumar
Center for Global Infectious Disease Research
Seattle Children’s Research Institute
Seattle, WA, USA
ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)
Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-0716-1459-4 ISBN 978-1-0716-1460-0 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1460-0
©Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 1998, 2009, 2015, 2021
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, speciﬁcally the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microﬁlms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a speciﬁc statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations
and therefore free for general use.
The publisher, the authors, and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
expressed or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been
made. The publisher remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional afﬁliations.
Cover Illustration Caption: Trehalose probes speciﬁcally label the mycobacterial outer membrane, enabling a variety of
applications including live-cell imaging, proteomics experiments, and potentially diagnostic and therapeutic targeting.
The cover image depicts Mycobacterium smegmatis labeled with an azide-modiﬁed trehalose monomycolate probe and
then treated with an azide-reactive cyclooctyne ﬂuorescent dye. Provided by the authors of Chapter 18.
This Humana imprint is published by the registered company Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer
Nature.
The registered company address is: 1 New York Plaza, New York, NY 10004, U.S.A.

Preface
The mycobacteria continue to be a genus of great interest and importance, largely due to the
presence of pathogenic species.Mycobacterium tuberculosis, causing tuberculosis, continues
to be a major global health problem and is now the biggest killer from infectious disease.
Leprosy, caused byMycobacterium leprae, has not yet been eradicated, and there has been an
increase in the number of opportunistic infections caused by nontuberculous mycobacteria.
Solving these global health problems requires an increased understanding of the basic
biology and pathogenesis of these organisms, as well as research directed toward improved
drugs and new vaccines.
Mycobacteria are difﬁcult organisms to work with, in part due to intrinsic characteristics,
but also due to the requirement for specialized laboratories for the pathogenic organisms.
Practical difﬁculties include their slow growth rate, their tendency to clump in culture, the
difﬁculty of lysing the bacteria, and their high GC content. Despite these barriers, much
progress has been made in adapting state-of-the-art methods to be used with these organ-
isms. In addition, much effort has been put toward developing high-throughput screening
methods that can be applied in drug discovery programs.
Perhaps it is not surprising then that we are now in our fourth edition of this book,
containing all of the tips and tricks developed by numerous researchers over the past
decades. Over the years since the ﬁrst volume was published, many researchers have
expressed their gratitude for its existence. As an editor, it is rewarding to hear this, but of
course none of this would exist without the hard work of the contributors who wrote the
chapters. As new researchers come into this ﬁeld, it has been encouraging to see how the
previous volumes have helped accelerate their research.
In preparing this fourth edition, we have tried to strike a balance between including
those basic methods that are still required for mycobacteriology and the newer or improved
methods that have been developed since the last volume was published. We hope these will
spark new areas of research.
We have included chapters on the basics of DNA isolation, protein isolation, and lipid
isolation, as well as more sophisticated techniques for isolation of ribosomes. Methods for
analyzing subcellular fractions—the proteome, the lipidome, and the metabolome—are
included. We have also gone back to basics and included a thorough review of culture
methods which provide the underpinning for all of the other work. Since whole genome
sequencing and its application is much more widely available, we have included a review
chapter to discuss best practices. Sequencing technology has developed rapidly, and so we
also include a chapter on whole genome sequencing from sputum samples.
A wide variety of in vitro models are available for mycobacteria. We have included
methods for macrophage and Dictyostelium infections using different mycobacterial spe-
cies, as well as chapters on analysis by ﬂow cytometry and microﬂuidics for single cell and
time-lapse microscopy.
Molecular methods have accelerated over the past decade, so we included basic methods
for electroporation as well as gene switching, together with newer protocols for recombi-
neering and methods to generate knockdown strains by proteolysis or CRISPRi. Use of
ﬂuorescent proteins has expanded greatly, and a chapter on ﬂuorescent reporters is included
v

as well as methods to label bacteria with trehalose probes. Many of these methods will be
relevant to research in different ﬁelds.
Drug discovery has become a much bigger ﬁeld in the last decade, and so this edition has
several methods relating to testing compounds in model systems. These include determin-
ing minimum inhibitory concentrations, multi-stress models, testing against hypoxic cul-
tures, efﬂux/permeability, high-throughput screening, high-content screening, the hollow
ﬁber model, and measurement of drug interactions (synergy or antagonism).
While it is not possible to include every method and protocol that has been developed,
we hope that these methods taken together provide the basics for any new research program
on mycobacteria.
We thank all of the contributors to this book who have given their time, effort, and
knowledge to prepare methods to share with the community. We hope that this volume will
help those starting out new with their mycobacteria research and those who have worked in
the ﬁeld for decades.
Seattle, WA, USA Tanya Parish
Anuradha Kumar
vi Preface

Contents
Preface . .................................................................... v
Contributors................................................................. xi
1 Culturing Mycobacteria.................................................. 1
Elizabeth Wallace, Debra Hendrickson, Nicholas Tolli, Carolina Mehaffy,
Marı´a Pen˜a, Jerry A. Nick, Phillip Knabenbaur, Jackson Watkins,
Anne Simpson, Anita G. Amin, Delphi Chatterjee, Karen M. Dobos,
Ramanuj Lahiri, Linda Adams, Michael Strong, Max Salﬁnger,
Rebecca Bradford, Timothy T. Stedman, Marco A. Riojas,
and Manzour Hernando Hazbon
2 DNA Isolation from Mycobacteria . . ...................................... 59
Heena Jagatia and Daire Cantillon
3 Extraction and Separation of Mycobacterial Proteins ........................ 77
Megan Lucas, Joan M. Ryan, Jackson Watkins, Kala Early,
Nicole A. Kruh-Garcia, Carolina Mehaffy, and Karen M. Dobos
4 Lipid and Lipoarabinomannan Isolation and Characterization ................ 109
Marie-Antoinette Lane´elle, Lucie Spina, Je´roˆme Nigou,
Anne Lemassu, and Mamadou Daffe´
5 Puriﬁcation of Hibernating and Active CRibosomes
from Zinc-Starved Mycobacteria.......................................... 151
Yunlong Li, Pooja Keshavan, Jamie H. Corro, Ravi K. Koripella,
Rajendra K. Agrawal, and Anil K. Ojha
6 Macrophage Infection Models forMycobacterium tuberculosis................ 167
Benjamin K. Johnson, Sean M. Thomas, Andrew J. Olive,
and Robert B. Abramovitch
7 Novel Single-Cell and High-Throughput Microscopy Techniques
to MonitorDictyostelium discoideum–Mycobacterium marinum
Infection Dynamics ..................................................... 183
Manon Mottet, Cristina Bosmani, Nabil Hanna,
Jahn Nitschke, Louise H. Lefranc¸ois, and Thierry Soldati
8 Single-Cell Analysis of Mycobacteria Using Microﬂuidics
and Time-Lapse Microscopy.............................................. 205
Giulia Manina and Neeraj Dhar
9 Measuring Efﬂux and Permeability in Mycobacteria . ........................ 231
Liliana Rodrigues, Jose´A.Aı´nsa, and Miguel Viveiros
10 Drug Susceptibility Screening Using In Vitro Models
of Hypoxic Non-Replicating Persistent Mycobacteria....................... 247
Savannah E. R. Gibson, James Harrison, and Jonathan A. G. Cox
11 Flow Cytometry Analysis of Mycobacteria and Mycobacteria-Infected
Immune Cells.......................................................... 261
Sydney L. Solomon and Bryan D. Bryson
vii

12 Electroporation of Mycobacteria.......................................... 273
Tanya Parish
13 Gene Switching and Essentiality Testing................................... 285
Amanda Claire Brown
14 Oligo-Mediated Recombineering and its Use for Making SNPs,
Knockouts, Insertions, and Fusions inMycobacterium tuberculosis............. 301
Kenan C. Murphy
15 Using Proteolytic Hypomorphs to Detect Small Molecule
Mechanism of Action.................................................... 323
Eachan O. Johnson and Deborah T. Hung
16 CRISPR Interference (CRISPRi) for Targeted Gene Silencing
in Mycobacteria........................................................ 343
Andrew I. Wong and Jeremy M. Rock
17 Exploiting Fluorescent Proteins to UnderstandMycobacterium
tuberculosisBiology ..................................................... 365
David Giacalone, Lu Huang, and Shumin Tan
18 Metabolic Labeling of Live Mycobacteria with Trehalose-Based Probes........ 385
Nicholas Banahene and Benjamin M. Swarts
19 Identiﬁcation and Characterization of Mycobacterial Species
Using Whole-Genome Sequences......................................... 399
Marco A. Riojas, Andrew M. Frank, Samuel R. Greenﬁeld,
Stephen P. King, Conor J. Meehan, Michael Strong,
Alice R. Wattam, and Manzour Hernando Hazbon
20 Whole-Genome Sequencing ofMycobacterium tuberculosis
Directly from Sputum Samples........................................... 459
Amanda Claire Brown
21 Experimental and Computational Workﬂow for RNA Sequencing
inMycobacterium tuberculosis: From Total RNA to Differentially
Expressed Genes........................................................ 481
Shuyi Ma, Richard M. Jones Jr., Natalie S. Gleason,
Jessica Farrow-Johnson, and David R. Sherman
22 RNA Sequencing for Transcript 5
0
-End Mapping in Mycobacteria............ 513
M. Carla Martini, Huaming Sun, and Scarlet S. Shell
23 Methods for Proteomic Analyses of Mycobacteria........................... 533
Carolina Mehaffy, Megan Lucas, Nicole A. Kruh-Garcia,
and Karen M. Dobos
24 Targeted Lipidomics of Mycobacterial Lipids and Glycolipids ................ 549
Emilie Layre
25 Metabolomics ofMycobacterium tuberculosis............................... 579
Kyle A. Planck and Kyu Rhee
26 Determining Minimum Inhibitory Concentrations in Liquid
Cultures or on Solid Medium............................................ 595
Qinglan Wang and Helena I. M. Boshoff
viii Contents

27 A Multistress Model for High Throughput Screening Against
NonreplicatingMycobacterium tuberculosis................................. 611
Ben Gold, Thulasi Warrier, and Carl Nathan
28 Antimicrobial Susceptibility Testing forMycobacterium sps
in High-Throughput Format............................................. 637
Esther Pe´rez-Herra´n and Alfonso Mendoza
29 High-Content Analysis Monitoring Intracellular Trafﬁcking
and Replication ofMycobacterium tuberculosisInside Host Cells.............. 649
Nathalie Deboosere, Ime`ne Belhaouane, Arnaud Machelart,
Eik Hoffmann, Alexandre Vandeputte, and Priscille Brodin
30 Efﬁcient Measurement of Drug Interactions with DiaMOND
(Diagonal Measurement of N-Way Drug Interactions)...................... 703
Nhi Van, Yonatan N. Degefu, and Bree B. Aldridge
31 Drug Sensitivity Testing ofMycobacterium tuberculosisGrowing
in a Hollow Fiber Bioreactor............................................. 715
A. Brett Mason and Ve´ronique Dartois
Index . . .................................................................... 733
Contents ix

Contributors
ROBERTB. ABRAMOVITCH •Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan
State University, East Lansing, MI, USA
LINDAADAMS•United States Department of Health and Human Services, Health Resources
and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, National Hansen’s Disease
Program, Baton Rouge, LA, USA
RAJENDRAK. AGRAWAL •Division of Translational Medicine, Wadsworth Center, New York
State Department of Health, Albany, NY, USA; Department of Biomedical Sciences,
University at Albany, Albany, NY, USA
JOSE
´A. AI
´
NSA•Grupo de Gene´tica de Micobacterias, Departamento de Microbiologı´a,
Pediatrı´a, Radiologı´a y Salud Pu´blica, Facultad de Medicina, BIFI Universidad de
Zaragoza-IIS Aragon, Zaragoza, Spain; CIBER Enfermedades Respiratorias
(CIBERES), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain
BREEB. ALDRIDGE •Department of Molecular Biology and Microbiology and Stuart B. Levy
Center for Integrated Management of Antimicrobial Resistance, Tufts University School of
Medicine, Boston, MA, USA; Laboratory of Systems Pharmacology, Harvard Medical
School, Boston, MA, USA; Department of Biomedical Engineering and Laboratory for
Living Devices, Tufts University School of Engineering, Medford, MA, USA
ANITAG. AMIN•Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology & Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
NICHOLASBANAHENE •Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan
University, Mount Pleasant, MI, USA
IME
`
NEBELHAOUANE •Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille,
Center for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille Cedex, France
HELENAI. M. BOSHOFF •Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Immunology
and Microbiology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National
Institutes of Health, Bethesda, MD, USA
CRISTINABOSMANI •Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of Geneva,
Geneva, Switzerland
REBECCABRADFORD •ATCC/BEI Resources, Manassas, VA, USA
PRISCILLEBRODIN•Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, Center
for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille Cedex, France
AMANDACLAIREBROWN •Texas A&M Veterinary Medical Diagnostic Laboratory
(TVDML), College Station, TX, USA; Department of Animal Science, Texas A&M
University, Kleberg Center, College Station, TX, USA; Oxford Gene Technology, Oxford,
UK
BRYAND. BRYSON•Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of
Technology, Cambridge, MA, USA; Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard,
Cambridge, MA, USA
DAIRECANTILLON •Department of Global Health and Infection, Brighton and Sussex
Medical School, University of Sussex, Brighton, UK
DELPHICHATTERJEE •Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology & Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
xi

JAMIEH. CORRO•Division of Genetics, Wadsworth Center, New York State Department of
Health, Albany, NY, USA; Department of Biomedical Sciences, University at Albany,
Albany, NY, USA
JONATHANA. G. COX•School of Life and Health Sciences, Aston University, Birmingham,
UK
MAMADOUDAFFE
´
•Tuberculosis & Infection Biology Department, Institut de Pharmacologie
et de Biologie Structurale (IPBS), Centre National de la Recherche Scientiﬁque (CNRS),
Toulouse, France; Universite´ de Toulouse, Universite´ Paul Sabatier (Toulouse III), Toulouse,
France
VE
´
RONIQUEDARTOIS•Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health,
Nutley, NJ, USA
NATHALIEDEBOOSERE •Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille,
Center for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille Cedex, France
YONATANN. DEGEFU•Department of Molecular Biology and Microbiology and Stuart B.
Levy Center for Integrated Management of Antimicrobial Resistance, Tufts University
School of Medicine, Boston, MA, USA; Laboratory of Systems Pharmacology, Harvard
Medical School, Boston, MA, USA
NEERAJDHAR•School of Life Sciences, Swiss Federal Institute of Technology in Lausanne
(EPFL), Lausanne, Switzerland
KARENM. DOBOS•Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
KALAEARLY•Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
JESSICAFARROW-JOHNSON •Department of Microbiology, University of Washington, Seattle,
WA, USA
ANDREWM. FRANK•ATCC, Manassas, VA, USA
DAVIDGIACALONE •Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University
School of Medicine, Boston, MA, USA; Graduate Program in Molecular Microbiology,
Graduate School of Biomedical Sciences, Tufts University, Boston, MA, USA
SAVANNAHE. R. GIBSON•School of Life and Health Sciences, Aston University, Birmingham,
UK
NATALIES. GLEASON •Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, WA,
USA
BENGOLD•Department of Microbiology and Immunology, Weill Cornell Medicine, New
York, NY, USA
SAMUELR. GREENFIELD •ATCC, Manassas, VA, USA
NABILHANNA•Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of Geneva,
Geneva, Switzerland
JAMESHARRISON •School of Life and Health Sciences, Aston University, Birmingham, UK
MANZOURHERNANDOHAZBO
´
N•ATCC, BEI Resources, Manassas, VA, USA
DEBRAHENDRICKSON •ATCC/BEI Resources, Manassas, VA, USA
EIKHOFFMANN •Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, Center
for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille Cedex, France
LUHUANG •Department of Microbiology and Immunology, University of Arkansas for
Medical Sciences, Little Rock, AR, USA
DEBORAHT. HUNG•Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA;
Department of Molecular Biology and Center for Computational and Integrative Biology,
xii Contributors

Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA; Department of Genetics, Harvard
Medical School, Boston, MA, USA
HEENAJAGATIA•Department of Respiratory Sciences, University of Leicester, Leicester, UK
BENJAMINK. JOHNSON •Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan
State University, East Lansing, MI, USA
EACHANO. JOHNSON •The Francis Crick Institute, London, UK
RICHARDM. JONESJR.•Department of Microbiology, University of Washington, Seattle,
WA, USA
POOJAKESHAVAN •Division of Translational Medicine, Wadsworth Center, New York State
Department of Health, Albany, NY, USA
STEPHENP. KING•ATCC, Manassas, VA, USA
PHILLIPKNABENBAUR •Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology & Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
RAVIK. KORIPELLA •Division of Translational Medicine, Wadsworth Center, New York State
Department of Health, Albany, NY, USA
NICOLEA. KRUH-GARCIA•Mycobacteria Research Laboratories, Department of
Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO,
USA; BioMARC, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
RAMANUJLAHIRI•United States Department of Health and Human Services, Health
Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, National Hansen’s
Disease Program, Baton Rouge, LA, USA
MARIE-ANTOINETTELANE
´
ELLE•Tuberculosis & Infection Biology Department, Institut de
Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Centre National de la Recherche
Scientiﬁque (CNRS), Toulouse, France; Universite´ de Toulouse, Universite´ Paul Sabatier
(Toulouse III), Toulouse, France
EMILIELAYRE•Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Universite´ de Toulouse,
CNRS, Universite´ Paul Sabatier, Toulouse, France
LOUISEH. LEFRANC¸ OIS•Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of
Geneva, Geneva, Switzerland
ANNELEMASSU •Tuberculosis & Infection Biology Department, Institut de Pharmacologie et
de Biologie Structurale (IPBS), Centre National de la Recherche Scientiﬁque (CNRS),
Toulouse, France; Universite´ de Toulouse, Universite´ Paul Sabatier (Toulouse III), Toulouse,
France
YUNLONGLI•Division of Genetics, Wadsworth Center, New York State Department of
Health, Albany, NY, USA
MEGANLUCAS•Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
SHUYIMA•Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, WA, USA
ARNAUDMACHELART •Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille,
Center for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille Cedex, France
GIULIAMANINA•Microbial Individuality and Infection Group, Cell Biology and Infection
Department, Microbiology Department, Institut Pasteur, Paris, France
M. CARLAMARTINI•Department of Biology & Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute,
Worcester, MA, USA
A. BRETTMASON•Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health,
Nutley, NJ, USA
CONORJ. MEEHAN •University of Bradford, Bradford, UK
Contributors xiii

CAROLINAMEHAFFY•Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
ALFONSOMENDOZA •Gobal Health Phama Research Unit, Tres Cantos Medicines
Development Campus (TCMDC), GlaxoSmithKline, Madrid, Spain
MANONMOTTET•Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of Geneva,
Geneva, Switzerland
KENANC. MURPHY •Microbiology and Physiological Systems, University of Massachusetts
Medical School, Worcester, MA, USA
CARLNATHAN •Department of Microbiology and Immunology, Weill Cornell Medicine, New
York, NY, USA
JERRYA. NICK•Department of Medicine, National Jewish Health, Denver, CO, USA
JE
´
RO
ˆ
MENIGOU•Tuberculosis & Infection Biology Department, Institut de Pharmacologie et
de Biologie Structurale (IPBS), Centre National de la Recherche Scientiﬁque (CNRS),
Toulouse, France; Universite´ de Toulouse, Universite´ Paul Sabatier (Toulouse III), Toulouse,
France
JAHNNITSCHKE•Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of Geneva,
Geneva, Switzerland
ANILK. OJHA•Division of Genetics, Wadsworth Center, New York State Department of
Health, Albany, NY, USA; Department of Biomedical Sciences, University at Albany,
Albany, NY, USA
ANDREWJ. OLIVE•Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State
University, East Lansing, MI, USA
TANYAPARISH•Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children’s Research
Institute, Seattle, WA, USA
MARI
´
APEN˜A•United States Department of Health and Human Services, Health Resources
and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, National Hansen’s Disease
Program, Baton Rouge, LA, USA
ESTHERPE
´
REZ-HERRA
´
N•Gobal Health Phama Research Unit, Tres Cantos Medicines
Development Campus (TCMDC), GlaxoSmithKline, Madrid, Spain
KYLEA. PLANCK•Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Weill Cornell
Medicine, New York, NY, USA; Department of Pharmacology, Weill Cornell Medicine,
New York, NY, USA
KYURHEE•Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine,
New York, NY, USA; Department of Microbiology and Immunology, Weill Cornell
Medicine, New York, NY, USA
MARCOA. RIOJAS•ATCC, BEI Resources, Manassas, VA, USA
JEREMYM. ROCK•Laboratory of Host-Pathogen Biology, The Rockefeller University, New
York, NY, USA
LILIANARODRIGUES •Global Health and Tropical Medicine, GHTM, Instituto de Higiene
e Medicina Tropical, IHMT, Universidade Nova de Lisboa, UNL, Lisbon, Portugal
JOANM. RYAN•Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
MAXSALFINGER •College of Public Health & Morsani College of Medicine, University of
South Florida, Tampa, FL, USA
SCARLETS. SHELL•Department of Biology & Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute,
Worcester, MA, USA; Program in Bioinformatics & Computational Biology, Worcester
Polytechnic Institute, Worcester, MA, USA
xiv Contributors

DAVIDR. SHERMAN •Department of Microbiology, University of Washington, Seattle, WA,
USA
ANNESIMPSON •Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology & Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
THIERRYSOLDATI•Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of Geneva,
Geneva, Switzerland
SYDNEYL. SOLOMON •Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of
Technology, Cambridge, MA, USA; Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard,
Cambridge, MA, USA
LUCIESPINA•Tuberculosis & Infection Biology Department, Institut de Pharmacologie et de
Biologie Structurale (IPBS), Centre National de la Recherche Scientiﬁque (CNRS),
Toulouse, France; Universite´ de Toulouse, Universite´ Paul Sabatier (Toulouse III), Toulouse,
France
TIMOTHYT. STEDMAN •ATCC/BEI Resources, Manassas, VA, USA
MICHAELSTRONG •Department of Medicine, National Jewish Health, Denver, CO, USA
HUAMINGSUN•Department of Biology & Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute,
Worcester, MA, USA; Program in Bioinformatics & Computational Biology, Worcester
Polytechnic Institute, Worcester, MA, USA
BENJAMINM. SWARTS•Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan
University, Mount Pleasant, MI, USA
SHUMINTAN•Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University School of
Medicine, Boston, MA, USA; Graduate Program in Molecular Microbiology, Graduate
School of Biomedical Sciences, Tufts University, Boston, MA, USA
SEANM. THOMAS •Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State
University, East Lansing, MI, USA
NICHOLASTOLLI•ATCC/BEI Resources, Manassas, VA, USA
NHIVAN•Department of Molecular Biology and Microbiology and Stuart B. Levy Center for
Integrated Management of Antimicrobial Resistance, Tufts University School of Medicine,
Boston, MA, USA
ALEXANDREVANDEPUTTE •Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille,
Center for Infection and Immunity of Lille (CIIL), Lille Cedex, France
MIGUELVIVEIROS•Global Health and Tropical Medicine, GHTM, Instituto de Higiene
e Medicina Tropical, IHMT, Universidade Nova de Lisboa, UNL, Lisbon, Portugal
ELIZABETHWALLACE•ATCC/BEI Resources, Manassas, VA, USA
QINGLANWANG•Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Immunology and
Microbiology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of
Health, Bethesda, MD, USA
THULASIWARRIER•Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA
JACKSONWATKINS•Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology,
Immunology, and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA
ALICER. WATTAM•University of Virginia, Charlottesville, VA, USA
ANDREWI. WONG•Laboratory of Host-Pathogen Biology, The Rockefeller University, New
York, NY, USA
Contributors xv

Chapter1
Culturing Mycobacteria
Elizabeth Wallace, Debra Hendrickson, Nicholas Tolli, Carolina Mehaffy,
Marı´a Pen˜a, Jerry A. Nick, Phillip Knabenbaur, Jackson Watkins,
Anne Simpson, Anita G. Amin, Delphi Chatterjee, Karen M. Dobos,
Ramanuj Lahiri, Linda Adams, Michael Strong, Max Salﬁnger,
Rebecca Bradford, Timothy T. Stedman, Marco A. Riojas,
and Manzour Hernando Hazbo´n
Abstract
Building upon the foundational research of Robert Koch, who demonstrated the ability to growMycobac-
terium tuberculosisfor the ﬁrst time in 1882 using media made of coagulated bovine serum, microbiologists
have continued to develop new and more efﬁcient ways to grow mycobacteria. Presently, all known
mycobacterial species can be grown in the laboratory using either axenic culture techniques or in vivo
passage in laboratory animals. This chapter provides conventional protocols to grow mycobacteria for
diagnostic purposes directly from clinical specimens, as well as in research laboratories for scientiﬁc
purposes. Detailed protocols used for production ofM. tuberculosisin large scale (under normoxic and
hypoxic conditions) in bioreactors and for production of obligate intracellular pathogens such asMycobac-
terium lepraeand “Mycobacterium lepromatosis” using athymic nude mice and armadillos are provided.
Key wordsMycobacterium tuberculosis,Mycobacterium leprae, Nontuberculous mycobacteria, Nor-
moxic culture, Hypoxic culture, Large-scale production of mycobacteria
1 Introduction
Culturing mycobacteria is a critical task for both clinical and
research laboratories that either diagnose mycobacterial infections
or study different aspects of mycobacterial physiology. Difﬁculties
associated with the culture of mycobacteria have historically been
associated with delayed diagnosis of these infections in the clinical
setting and are factors in the slow pace of research on the genus. In
this chapter, we provide protocols for mycobacteria isolation, small-
scale growth for diagnostic purposes, and large-scale growth for
research purposes. Isolation of mycobacteria is a requirement for
both clinical [i.e.,Mycobacterium tuberculosisand nontuberculous
Tanya Parish and Anuradha Kumar (eds.),Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 2314,
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1460-0_1,©Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2021
1

mycobacteria (NTM) from sputum and other clinical specimens]
and research (i.e., NTM from environmental samples) laboratories.
Isolation of mycobacteria from these complex samples must factor
the presence of other microorganisms that may outgrow mycobac-
teria present in each sample. For that reason, clinical and environ-
mental samples need to be homogenized, fractionated to
discourage growth of non-mycobacterial species, and concentrated.
Selective media are recommended as an initial step for culture
isolation. Once a mycobacterial strain is isolated and determined
to be pure, culturing may be performed in the absence of selective
media. However, in the case of slow-growing strains, it may be
prudent to continue growth on selective media to ensure or main-
tain purity from contaminating species inadvertently introduced
into the culture. Thus, mycobacteria are typically cultured in selec-
tive media. Large-scale growth, particularly of Biosafety level-3
mycobacteria, such as members of theM. tuberculosiscomplex,
also poses additional biosafety considerations that need to be
taken into account in order to minimize the risk of infection for
laboratory personnel. In this chapter, we gathered a wide variety of
culture procedures that could be used in several settings for differ-
ent types of applications. Many of the authors of this chapter are
involved in the production of mycobacterial strains and reagents for
distribution to the mycobacteriology research community [1].
Many mycobacterial strains and biological derivatives are avail-
able through ATCC (https://www.atcc.org) or BEI Resources
(https://www.beiresources.org). BEI Resources enables access of
strains and reagents to laboratories engaged in mycobacterial and
infectious disease research and is funded by the National Institute
of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). These reagents are
authenticated, quality-assured biomaterials characterized by geno-
typic and phenotypic assays when produced and provide standards
of quality that may not be available from shared laboratory stocks.
Some of the protocols for growth and production of these reagents
are included in this chapter.Mycobacterium lepraeis uncultivable on
microbiological culture media and must be grown in animal mod-
els. The Health Resources and Services Administration (HRSA)
National Hansen’s Disease Program Laboratory (NHDP) (Baton
Rouge, LA) grows large quantities ofM. lepraein nine-banded
armadillos and provides the infected tissues to the Dobos Labora-
tory at Colorado State University (Fort Collins, CO) for puriﬁca-
tion of leprosy reagents. The HRSA NHDP also growsM. leprae
and “M. lepromatosis”in athymic nude mouse footpads for provi-
sion of live bacilli to researchers [2]. The Dobos Laboratory pro-
duces a large number ofM. tuberculosisreagents thanks to their
expertise with large-scale growth of differentM. tuberculosisstrains.
On the clinical side, resources for researchers, including well-
characterized NTM isolates from individuals with cystic ﬁbrosis
(CF), accompanying whole-genome sequencing information, and
2 Elizabeth Wallace et al.

technical support are available through the Colorado CF Research
and Development Program, located at National Jewish Health in
Denver and funded by the CF Foundation ( https://www.
nationaljewish.org/cocfrdp).
1.1 Mycobacterium
Growth
TheMycobacteriumgenus was initially composed of more than
190 closely related species [3]. This genus was recently reclassiﬁed
into ﬁve different genera:Mycobacterium,Mycobacteroides,Mycoli-
cibacterium,Mycolycibacterium, andMycolicibacillus[4]. However,
this new taxonomy is generating controversy and has not been
accepted by all stakeholders [5]. Because the new taxonomic classi-
ﬁcation bears no relevance on the way, these organisms are grown,
for the sake of simplicity, in this chapter we use the general term
mycobacteria to refer to species in theMycobacteriumgenus as well
as the four new genera derived from it.
Mycobacteria are Gram-positive, acid-fast bacteria (AFB), aer-
obic rods with a high GC% content in their DNA (62–70%)
[6]. Mycobacteria have a thick cell wall with a high lipid content,
making it both Gram-positive and AFB (seeFig.1) and resistant to
most lysis methods [7]. Mycobacteria are generally divided into
two groups based on their growth rates: the slowly growing myco-
bacteria (SGM) and the rapidly growing mycobacteria (RGM).
RGM produce visible colonies on solid media in<7 days with a
standardized inoculum. SGM typically require between 7 days and
6 weeks to produce visible colonies on solid media [7]. While this is
generally accepted in the mycobacterial community, in the clinical/
diagnostic ﬁeld,M. tuberculosis,M. leprae, andM. ulceransare
separate listed and not included in the SGM/RGM dichotomy.
While it is true that phylogenetically these three species belong to
the SGM, the terms SGM and RGM are mainly used for
Fig. 1Acid-fast staining ofMycolicibacterium monacenseB9-21-178
T
(BEI
Resources item # NR-49075)
Culturing Mycobacteria 3

nontuberculous mycobacteria. In this context, obviously
M. tuberculosisdoes not belong to the slowly growing NTM and
M. lepraeandM. ulceransare often listed separately and not part of
the SGM/NTM. On the disease side, it is even clearer, as these are
referred as tuberculosis, leprosy, Buruli ulcer, and diseases caused
by NTM.
1.2 Solid Media Egg-based media, the most common being Lo¨wenstein–Jensen
(L-J), will support growth of most mycobacteria. In addition to
egg, L-J also contains potato starch and glycerol. The concentra-
tion of malachite green will inhibit the growth of many other
organisms but still allows mycobacteria to grow, albeit slowly (see
Fig.2and Table1).
While L-J medium was the ﬁrst popular solid medium to sup-
port mycobacteria, Middlebrook 7H10 with OADC enrichment,
developed in 1958, produced colonies in approximately half the
time of L-J cultures, 10–12 days rather than 18–24 days. OADC
enrichment includes oleic acid, used in mycobacterial metabolism,
albumin to protect against any toxic agents in the media and
provides protein, dextrose as a carbon source, and catalase to
destroy any toxic peroxidases in the media [8]. Middlebrook agar
is temperature and photo-sensitive and should be stored according
to manufacturer’s instructions, generally in a dark refrigerator (see
Fig.3).
Rapidly growing species require less than 7 days whereas slow
growing species require between 1 and 6 weeks to grow. Most
species prefer 37

C with 5% CO
2. Increased humidity can improve
Fig. 2Growth on L-J medium ofM. tuberculosis(NR-18151) on the left, and
M. ulcerans(NR-51701) on the right
4 Elizabeth Wallace et al.

growth. Inoculated agar can be placed into a loosely closed plastic
bag to increase the humidity inside the container and still allow
some gas exchange. Commercial media is readily available and
includes sufﬁcient quality controls and lowers lot-to-lot variability
than media made in the laboratory. For this reason, this option is
recommended.
1.3 Liquid Media Mycobacteria grow more readily in broth than on solid media.
Middlebrook 7H9 with ADC and Dubos Tween albumin broths
are commonly used (seeTable1). Isolation rates from clinical
samples are higher for broth than solid media, although it is
recommended that laboratories inoculate both. Solid media can
serve as a backup if broth growth fails. Turbid broths should be
plated on solid media to determine if the culture is mixed or
Table 1
Description of most important media used to isolate and grow mycobacteria
Organism Recommended media
Temperature
(

C)
Time
(days)
M. tuberculosisvar.
tuberculosis
Middlebrook 7H9 broth with ADC
Middlebrook 7H10 agar with OADC
L-J
37 28
M. tuberculosisvar.
bovis
Middlebrook 7H9 broth with ADC and 40 mM
sodium pyruvate
Middlebrook 7H10 agar with OADC and 40 mM
sodium pyruvate
37 28
M. avium Middlebrook 7H9 broth with ADC
Middlebrook 7H10 agar with OADC
L-J
37 14–28
M. smegmatis Middlebrook 7H9 broth with ADC
Middlebrook 7H10 agar with OADC
L-J
37 2–3
M. ulcerans Middlebrook 7H9 broth with ADC
Middlebrook 7H10 agar with OADC
L-J
30 30–90
M. abscessus Middlebrook 7H9 broth with ADC
Middlebrook 7H10 agar with OADC
L-J
37 3–5
M. kansasii Middlebrook 7H9 broth with ADC
Middlebrook 7H10 agar with OADC
L-J
37 7–42
M. marinum Middlebrook 7H9 broth with ADC
Middlebrook 7H10 agar with OADC
30 7–9
L-JLowenstein–Jensen,OADColeic albumin dextrose catalase supplement,ADCMiddlebrook albumin dextrose
catalase supplement. (Other liquid media such as Sauton’s, Glycine Alanine Salt (GAS) and Proskauer-Beck are com-
monly used for research purposes. Tween is usually added when dispersion of cell clumps is needed)
Culturing Mycobacteria 5

contaminated, as broth has a higher contamination rate than agar
[8]. Additives like Tween to liquid media can reduce cell clumping
but can also alter cell permeability and therefore susceptibility
patterns.
1.4 Slowly Growing
Mycobacteria (SGM)
SGM include the members ofMycobacterium tuberculosiscomplex,
a group which has recently been reclassiﬁed as a single species,
Mycobacterium tuberculosis, with all other group species being
designated as infrasubspeciﬁc variants [9]. SGM also include
M. leprae, the etiological cause of leprosy (Hansen’s disease).
Thus, SGM are of high concern as human pathogens. M. leprae
and “M. lepromatosis”(although not ofﬁcially accepted as a new
species) [10] are the only known species of mycobacteria that
cannot be cultivated in vitro. Nine-banded armadillos and mice
are suitable hosts. Growth of these organisms can take several
months and is detailed in Subheading3.9.
Frequently isolated SGM in clinical samples are:Mycobacterium
avium,Mycobacterium intracellularesubsp.intracellulare,Myco-
bacterium kansasii,Mycobacterium gordonae,Mycobacterium mar-
inum,Mycobacterium simiae,Mycobacterium xenopi, and
Mycobacterium intracellularesubsp.chimaera.Many NTM can be
found in the environment, and therefore, it is important to estab-
lish the isolate’s clinical signiﬁcance which is based on clinical,
radiologic, and microbiologic criteria [11]. NTM can cause lung
disease in patients with risk factors such as chronic obstructive
pulmonary disease (COPD), bronchiectasis, CF, dissemination in
AIDS patients with low CD4 cell count, and cervical lymphadenitis
in small children.
Fig. 3Growth ofMycobacterium abscessus, strain MA 1948 (NR-44263) on
Middlebrook 7H10 agar with OADC enrichment
6 Elizabeth Wallace et al.

1.5 Rapidly Growing
Mycobacteria (RGM)
RGM are common in the environment and include saprophytic
species as well as opportunistic pathogens, which may be a particu-
lar concern in immunocompromised individuals. They are currently
divided into six groups:Mycolicibacterium fortuitumgroup,Myco-
bacteroides chelonae/Mycobacteroides abscessuscomplex,Mycolicibac-
terium smegmatisgroup,Mycolicibacterium mucogenicumgroup,
Mycolicibacterium mageritense/Mycolicibacterium wolinskyigroup,
and pigmented RGM. Approximately 50% of known mycobacterial
species are RGM with three species comprising approximately 80%
of clinically known RGM pathogens:M. fortuitum,M. chelonae,
andM. abscessus[12]. RGM lack pigmentation and produce a
positive arylsulfatase at 3 days [13]. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) of mycolic acids, RFLP analysis of
genes includinghsp65, and sequencing could be used to identify
isolates down to the species level [13]. Many NTM can be found in
the environment, and therefore, it is important to establish the
isolate’s clinical signiﬁcance which is based on clinical, radiologic,
and microbiologic criteria [11,14].
1.6 Methods
for Continuously
Monitored Broth
Systems
There are several commercial platforms designed to help the clinical
mycobacteriologists to automate mycobacterial cultures. Here we
will describe three of these platforms. For all others, we encourage
users to refer to the speciﬁc manufacturer’s instructions and guide-
lines. The ﬁrst platform to be described is the BACTEC MGIT-
automated mycobacterial systems (BD Diagnostic Systems, Sparks,
MD). This system automatically detects tube placement, i.e., scan-
and-load technology; uses MGIT medium containing patented
sensors that detect oxygen consumption, indicating mycobacterial
growth; PANTA antibiotic mixture is added to the MGIT tube
prior to inoculation; and a ﬂuorescent compound, embedded in
silicone in the tube bottom, is quenched by the presence of oxygen.
When the oxygen is metabolized by mycobacteria or another
microorganism, the compound ﬂuoresces [15].
A second platform is the BacT/Alert Mycobacteria detection
system (bioMe´rieux, Durham, NC). It utilizes a colorimetric sensor
and reﬂected light to monitor the presence and production of CO
2.
The sensor changes color because of CO
2produced by the meta-
bolic activity of mycobacteria and other microorganisms; enrich-
ment ﬂuid containing bovine serum albumin, sodium chloride,
oleic acid, and saponin is added; bottles contain antibiotic mixture
of amphotericin B, azlocillin, nalidixic acid, polymyxin B, trimeth-
oprim, and additional growth factors.
A third commonly used platform is the VersaTREK (Thermo
Fisher Scientiﬁc, Waltham, MA). In this system, the bottles contain
antibiotic mixture of polymyxin B, vancomycin, nalidixic acid, and
amphotericin B. After inoculation, each bottle is continuously
monitored for changes in gas pressure, due to consumption of
oxygen by mycobacteria and production of gas by their metabolic
activity [15].
Culturing Mycobacteria 7

1.7 General Methods
for Mycobacterial
Growth
Most mycobacteria will grow on fairly simple substrates that
include glycerol as a carbon source, mineral salts and ammonia or
amino acids for nitrogen. Some species, includingM. aviumsubsp.
paratuberculosis,M. haemophilum, andM. genavense, are fastidious
and require supplements including hemin, hemoglobin, or other
iron compounds.M. lepraehas not yet been cultured on axenic
media and its growth requirements will be discussed separately.
Carbon dioxide and fatty acids such as those in egg yolk can
stimulate mycobacterial growth. Optimal growth temperature can
range from 28 to 45

C, with visible colonies being produced by
most species between 7 days and 6 weeks. However, most species
grow best between 35 and 37

C, althoughM. chelonaeand
M. ulceranshave lower optimal growth temperatures. RGM pro-
duce visible colonies between 3 and 7 days [8].
For optimal growth and especially primary isolation, CO
2sup-
plementation is necessary. 5–10% CO
2during incubation is recom-
mended. Candle jars do not lower the oxygen tension sufﬁciently
for mycobacteria to grow and are not recommended. If CO
2incu-
bators are not available, a commercial anaerobic system with tablets
or sachets that produce CO2can be used.
1.8 Staining
of Mycobacteria
Microscopic examination of mycobacteria is still widely used not
only to conﬁrm cell morphology and purity but also in clinical
settings to provide an initial bacteriologic evidence of the presence
of mycobacteria in a clinical specimen. The high concentration of
lipids in the mycobacterial cell wall makes them waxy and hydro-
phobic, which provides an impermeable layer to common routine
stain such as the Gram Stain. Another key characteristic of this cell
wall is its resistance to acid and alcohol, deﬁning these cells as AFB
or Acid Alcohol Fast Bacilli (AAFB). The two most widely used
methods for acid-fast staining are the carbol fuchsin-based meth-
ods, such as Ziehl-Neelsen and Kinyoun (that rely on light/bright-
ﬁeld microscopes) and the ﬂuorochrome-based procedures that use
ﬂuorescent dyes such as auramine-O or auramine-rhodamine (that
rely on ﬂuorescent microscopes).
The two main carbol fuchsin-based methods rely on two differ-
ent approaches to stain the cells. In the “hot” Ziehl-Neelsen tech-
nique, the phenol-carbol fuchsin stain is heated to enable the dye to
penetrate the waxy mycobacterial cell wall. In the “cold” Kinyoun
method, the stain penetration is enhanced by increasing the con-
centration of basic fuchsin and phenol and incorporating a “wetting
agent” chemical. Once the fuchsin binds to the mycolic acid in the
mycobacterial cell wall, an acid decolorizing solution is applied to
remove the red dye from the background cells, tissue ﬁbers, and
only mycobacteria will retain the dye. Then malachite green or
methylene blue is used as counterstaining reagent to provide con-
trast color against which the red AFB can be seen. Kinyoun staining
is recommended for culture staining, especially under BSL3
8 Elizabeth Wallace et al.

conditions. Kinyoun staining is not recommended for AFB smear
microscopy of clinical specimens, since its sensitivity is inferior to
Ziehl-Neelsen and ﬂuorescence staining.
Following decolorization, sputum smear is counterstained with
malachite green, or methylene blue which stains the background
material, providing a contrast color against which the red AFB can
be seen. Because some mycobacterial species have a higher content
of mycolic acid in their cell walls, sometimes the decolorizing
solutions need to be modiﬁed to avoid over-decolorizing weak
acid-fast cells. For example,M. tuberculosisandM. ulceransare
strongly acid-fast stained, and a 3% v/v acid alcohol is used to
decolorize the smear, while weak acid-fast staining species such as
M. lepraeshould use 0.5–1% v/v, and this should be also combined
to different staining and decolorizing time.
The auramine-O or auramine-rhodamine dyes bind mycolic
acids and ﬂuoresces yellow/orange when exposed to UV light,
while the background is almost black. This feature provides a
more sensitive detection of AFB, which is of great value especially
when using microscopy for diagnostic purposes. However, this
staining is not speciﬁc and other acid-fast cells (e.g., some sporo-
zoan parasites) will ﬂuoresce yellow, so the cellular morphology
(beaded rods) is critical in considering the stain positive. Another
downfall for this technique is that most RGMs may not appear
ﬂuorescent [16].
1.9 Processing
of Clinical Specimens
for Mycobacterial
Strain Isolation
and Culture
In order to avoid outgrowth of non-AFB fast-growing organisms
that may be present in clinical and environmental specimens over
mycobacteria, it is necessary to eliminate non-AFB and fungi before
culturing of the specimens. However, this process can also lower
mycobacteria viability and should be avoided if the specimen is
normally sterile, such as some sterile tissues and body ﬂuids. Sam-
ples should be concentrated to maximize the recovery of mycobac-
teria. Sputum and other viscous specimens apart from the
decontamination and concentration steps will require a liquefaction
step [15]. One of the most common decontaminants is sodium
hydroxide (NaOH), which also serves as a mucolytic agent; how-
ever, NaOH can affect mycobacterial viability if not used with
caution regarding the concentration and time of exposure. To
minimize a detrimental effect of NaOH, some laboratories recom-
mend addingN-acetyl-L-cysteine (NALC) to the liquefaction and
decontamination solution. In this case, the solution requires a
lower NaOH concentration. The most commonly used combina-
tion is 0.5% NALC–2% NaOH. For heavily contaminated speci-
mens, concentrations of up to 6% NaOH can be utilized, but the
risk of inhibiting mycobacteria is higher. There are other decon-
tamination agents used for speciﬁc specimen types, e.g., urine,
and/or known patient diseases, e.g., CF. In the case of individuals
with CF, NTM recovery from respiratory specimens is challenging.
Culturing Mycobacteria 9

These specimens can containPseudomonas aeruginosa,Staphylococ-
cus aureus, and other microbes [8,17–22].P. aeruginosais present
in 50–70% of the clinical CF specimens, which poses a challenge
because it can survive NALC–NaOH decontamination and con-
taminates 35–70% of subsequent cultures. For more details,seethe
reference of Forbes et al. [15].
Since enhanced decontamination protocols may signiﬁcantly
reduce NTM viability in samples [18], consensus guidelines recom-
mend a two-step approach to sample processing [17,18,21]. The
majority of U.S. and European clinical microbiology laboratories
currently use a NALC–NaOH decontamination step prior to myco-
bacterial culture [17,21,23,24]. This decontamination step
results in the killing of up to one-third of mycobacteria present in
a clinical specimen [25]. The addition of a second decontamination
step using oxalic acid permits the recovery of NTM from persis-
tently contaminated samples, at the expense of further reducing the
sensitivity of the culture for detecting low concentrations of myco-
bacteria [8,22]. Alternatively, the use of 1% chlorhexidine as a ﬁrst
step may improve the recovery of mycobacteria, but at the expense
of higher rates of residual sample contamination [20]. As chlorhex-
idine needs to be neutralized with lecithin, the use of chlorhexidine
negatively affects the performance of the MGIT-automated liquid
culture system, as lecithin generates random ﬂuorescence reactions
from the MGIT system sensor [20]. More recently, selective RGM
medium for the recovery of NTM has been developed [26], and in
single-center trials has been shown to enhance recovery of
M. abscessuscomplex from clinical samples, while virtually eliminat-
ing contamination by co-pathogens without the need for specimen
decontamination [27]. Others have reported that SGM, which are
found frequently in this population, can be recovered with RGM
medium when incubated for 28 days as a screening culture for all
NTM in CF patients [28]. It is likely that with further modiﬁcation
and validation, this method will eventually be implemented for
widespread clinical use.
1.10 Biosafety
and Biosecurity
Concerns
forMycobacterium
tuberculosisComplex
Species within the historically termed “Mycobacterium tuberculosis
complex” [9], which includeM. tuberculosisvar.tuberculosis,
M. tuberculosisvar.bovisincludingM. bovisBCG,M. tuberculosis
var.africanum, andM. tuberculosis var. microti, can cause tubercu-
losis in humans.M. bovisBCG is used to treat certain types of
bladder cancer, and as a complication can cause BCG-itis
[29]. More recently identiﬁed organisms likeM. tuberculosisvar.
capraeandM. tuberculosisvar. pinnipediihave been isolated from
goats and seals, respectively [30,31].
When working with mycobacterial organisms, follow all insti-
tutional biosafety and biosecurity regulations for handling of cul-
tures and contaminated waste, decontamination procedures, and
requirements for personal protective equipment (PPE). As outlined
10 Elizabeth Wallace et al.

below, cultured mycobacteria and potentially contaminated sam-
ples should be handled or processed in a biological safety cabinet
(BSC) following the containment recommendations of the CDC
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories
(BMBL) [7].
1.11 Occupational
Exposure
toM. tuberculosis
Laboratory exposures fromM. tuberculosisare known hazards for
laboratorians as well as workers in autopsy suites and healthcare
facilities who may be exposed to infection via aerosols.
M. tuberculosisinfection is three times higher for laboratory staff
working withM. tuberculosisthan for those not working with
it. Infected nonhuman primates also pose a risk for infection to
laboratory staff [7]. Rodents do not produce droplets via coughing
and so do not pose the same level of risk to human workers, but
material from cages can become aerosolized and pose a risk for
infection to staff. The risk of infection is greatly increased in immu-
nocompromised individuals.
Tuberculosis bacteria have been found in sputum, cerebrospi-
nal ﬂuid, urine, and tissues. Aerosols generated when handling
samples in the laboratory pose the greatest hazard. BSL-2 precau-
tions and facilities should be used when handling specimens for
staining or producing tissue sections. Aerosol-generating proce-
dures should be minimized or eliminated. For example, slides
should be methanol-ﬁxed (seeSubheading3.1) or heated on a
slide warmer, although heat-ﬁxed samples can still be infectious.
Heat-ﬁxing by ﬂame should be avoided. Handling of sputum for
staining can be done on an open bench after being treated with an
equal volume of 5% hypochlorite solution (undiluted household
bleach) and incubating at room temperature for 15 min before
handling outside a BSC [20].
Any growth of the organism or procedures that may generate
aerosols should be performed in a BSL-3 facility with BSL-3 safety
protections in place, including a respiratory protection plan and
BSCs. The ID
50ofM. tuberculosisis<10 bacteria [20].
Mycobacteria are capable of remaining viable on hard surfaces
for weeks or months when protected from sunlight. Some species,
including theM. tuberculosiscomplex, can survive on surfaces, in
soil, or animal waste for months and remain potentially infectious.
Mycobacteria are susceptible to UV light and heat (>65

C for at
least 30 min) but are resistant to freezing or desiccation. For
nonspore-forming bacteria, they are remarkably resistant to acids
and alkalines as well as some chemical disinfectants [19].
For large-scale cleaning, mycobacteria are sensitive to ethylene
oxide, formaldehyde vapor, chlorine compounds, 70% ethanol, 2%
alkaline glutaraldehyde, peracetic acid, phenol-based disinfectants,
and stabilized hydrogen peroxide. Caution should be taken when
selecting a disinfectant that contains an organic material. Agents
that have reduced efﬁcacy when used with organic matter,
Culturing Mycobacteria 11

including alcohols, are not effective with sputum or environmental
samples [8]. It is recommended that the efﬁciency of the selected
disinfectant be tested prior to routine use in the laboratory.
Laboratory staff working with mycobacterial pathogens or in
shared laboratory space can be tested annually or semiannually to
determine if any exposure has occurred. This testing can be paired
with pre-access tests to determine if exposure was from the
laboratory [8].
1.12 Biosafety
Concerns
with Nontuberculous
Mycobacteria (NTM)/
M. leprae
Beyond theM. tuberculosiscomplex, other facultative pathogenic
species of mycobacteria are common in the environment. Some of
these are of concern to immunocompromised people, particularly
those infected with HIV and a low CD4 cell count. These are
considered opportunistic but not communicable and may be
isolated from clinical samples but not necessarily associated with
disease. Laboratory acquired infections from NTM have not been
reported [8]. Some included species areM. avium,M. kansasii,
M. intracellulare,M. scrofulaceum, andM. ulcerans. Handling any
of the NTM in the laboratory setting should be done in a BSL-2
environment. BecauseM. lepraemust be grown in vivo, all work
must be performed in an ABSL-2 facility by staff trained to handle
armadillos and nude mice.
1.13 Growth
ofM. leprae
M. lepraecan be grown in vivo using armadillos or athymic nude
mice. All work conducted with animals requires prior protocol
approval by the Institutional Animal Care and Use Committee
(IACUC), or similar institutional governance body for the ethical
management of animals in biomedical research.
Athymic nude mice are used to obtain highly viable populations
ofM. lepraefor research use. Typically, a suspension (30μL) con-
taining 1γ10
7
liveM. lepraeis inoculated in each hind footpad.
After 5–7 months, more than 5γ10
9
viable bacilli can be harvested
from the footpads (seeFig.4). Athymic nude mice need to be
maintained in a speciﬁc pathogen-free ABSL-2 facility with ad
libitum food and water.
The nine-banded armadillos (Dasypus novemcinctus)(seeFig.5)
are natural hosts ofM. leprae, showing high infection rates (over
20%) in free ranging armadillos in the Southeast United States.
Their long life span (12 years), cool body temperature, and large
body size deﬁne them as excellent hosts for in vivo propagation of
M. leprae.Although armadillos have been shown to be susceptible
to experimental infection by a variety of routes, intravenous inocu-
lation is the route of choice since it will result in higher bacterial
yield in a shorter incubation period [32,33]. Once the armadillo
has been infected withM. leprae, the infection disseminates into the
liver and spleen and can be harvested from the tissues at 10
12
bacteria per animal [34–36].
12 Elizabeth Wallace et al.

In this chapter, the procedures to infect and harvestM. leprae
from athymic nude mice and armadillos will be described.
1.14 Identiﬁcation
of Mycobacteria
Once a mycobacterial culture is obtained, the genus and species of
the grown organism needs to be identiﬁed. This is particularly
important in the case of NTMs, where the identiﬁcation tools are
less developed than forM. tuberculosis. Species identiﬁcation of
mycobacteria can be difﬁcult. Phenotypic characteristics have been
used traditionally to identify mycobacteria. These include growth
rate, colony morphology, pigmentation, optimal growth tempera-
ture, and reactions in a battery of biochemical tests. However, most
of these are poorly reproducible and require grown cultures before
species-level identiﬁcation can be done. In addition, some of these
tests cannot differentiate many of the newly described species.
Furthermore, there is a known rate of variability between strains
belonging to the same species, and for these reasons, biochemical
assays are no longer recommended in the diagnostic laboratory. In
other settings, such as research laboratories and production
Fig. 4Nude mouse with enlarged footpad due toM. lepraeinoculation
Fig. 5Nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus)
Culturing Mycobacteria 13

laboratories, these assays can be of value. These assays still provide a
set of characteristics to describe an isolate, reason why they are still
used as part of the quality control testing.
Novel technologies have been developed as accurate tools for
species ID. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of
Flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is being used with
increasing frequency to identify mycobacterial isolates. MALDI-
TOF MS detects the abundance of proteins with speciﬁc mass-to-
charge ratios, which is displayed as a spectrum. The spectral data are
then compared to a database to determine the likely identity of the
organism. There are currently two commercially available MALDI-
TOF MS systems in the United States, the MALDI Biotyper (Bru-
ker Daltonics, Billerica, MA) and the Vitek MS system (bioMe´r-
ieux, Durham, NC). The Vitek MS system has an FDA-cleared
database, which includes mycobacteria. Laboratories using the
MALDI Biotyper must build their own databases or rely on
research-use-only databases for their laboratory-developed proto-
cols. Like 16S rRNA gene sequencing, the accuracy of MALDI-
TOF MS is dependent on both the robustness of the database and
the quality of the spectra obtained. Obtaining quality spectra can be
difﬁcult with mycobacteria due to their complex cell walls. There-
fore, whole-cell preparations (i.e., applying a colony directly on a
target plate) do not work for mycobacteria. A pre-extraction step
must occur, usually involving bead beating or vortexing in ethanol,
formic acid, and acetonitrile; the extracted proteins are then
spotted onto the plate. Importantly, the extraction procedure
should be performed in a BSL-3 laboratory (or a BSL-2 laboratory
using BSL-3 practices) and veriﬁed for its ability to effectively kill
M. tuberculosisprior to moving the target plate to the mass
spectrometer.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was ﬁrst
proposed for the identiﬁcation of mycobacteria by the CDC and
was offered as a standard test at the CDC Mycobacteriology Refer-
ence Laboratory in 1990 [37]. HPLC can identify RGM into
groups or complexes but is not speciﬁc enough to identify most
species. HPLC has been replaced in most laboratories by molecular
methods (e.g.,rpoBgene sequencing and MALDI-TOF) for more
accurate species identiﬁcation. A commercial HPLC system, the
Sherlock Mycobacteria Identiﬁcation System (MYCO-LS) (MIDI
Inc., Newark, DE), is an FDA-cleared HPLC method for the
identiﬁcation of mycobacteria. MYCO-LS identiﬁes 25 species of
mycobacteria by the analysis of mycolic acids. Like the CDC HPLC
method, mycolic acids are extracted from unknown mycobacteria,
and the HPLC mycolic acid proﬁle is then compared to a library of
reference strain proﬁles. The mycobacteria may be identiﬁed to the
species or to the species-complex group level. Several studies have
evaluated MYCO-LS and found that it is a rapid and accurate
alternative method for mycobacterial species identiﬁcation; how-
ever, it has a limited library of mycobacteria [38].
14 Elizabeth Wallace et al.

Immunochromatography-based lateral ﬂow assays using
monoclonal antibody against the MPB64 protein (Rv1980c or
RD2) secreted by theM. tuberculosiscomplex are reported to be a
reliable, rapid, and simple tool to identify theM. tuberculosiscom-
plex and differentiate its members from NTM in growth-positive
solid or liquid cultures. At present, three commercial tests are
available for routine clinical diagnostic use, the SD Bioline Ag
MPT64 Rapid assay (Standard Diagnostics, Kyonggido, South
Korea) (CE marked), the Capilia TB-Neo assay (Tauns, Numazu,
Japan) (CE marked), and the MGIT TBc Identiﬁcation test
(Becton-Dickinson Instrument Systems, Sparks, MD, USA)
(CE marked).
1.15 Biochemical
Tests for Mycobacteria
Once a culture is obtained, biochemical testing for strain character-
ization, as well as for identiﬁcation of genus and species, can start.
After determining whether a sample is an SGM or an RGM, there
are a number of biochemical tests that can narrow down the species
identiﬁcation (seeTables2and3). In addition, molecular methods
are becoming more critical as new closely related species are
discovered.
1.15.1 Nitrate and NiacinTwo of the most cost-effective and efﬁcient biochemical methods
for identifying mycobacteria are nitrate reduction and niacin test-
ing. Nitrate reduction will identify mycobacterium based on the
presence of nitrate reductase. Niacin plays a role in the oxidation–
reduction reactions that occur during metabolic syntheses of all
mycobacteria while all species of mycobacteria produce niacin,
M. tuberculosisaccumulates the largest amount in the medium on
which it is growing (usually L-J).
1.15.2 PyrazinamidaseThis assay was initially used to differentiateM. tuberculosisvar.bovis
fromM. tuberculosisvar.tuberculosisand theM. aviumcomplex, as
well asM. marinumfromM. kansasii[39]. Pyrazinamidase activity
was observed by inoculating pyrazinamidase agar with live culture.
However, based on Bergey’s manual [40] and the reclassiﬁcation of
theM. tuberculosiscomplex [9], this test was removed from the
current testing scheme used at ATCC (seeTable3).
1.15.3 Pigmentation Pigmentation can be useful in determining species identity. Inocu-
lated L-J media can be wrapped in foil and incubated in darkness. If
a color other than buff or cream is observed, the isolate may be a
scotochromogen. If no pigment is observed, remove the foil and
allow the media to sit in light for 1 h. If a pigment develops, the
isolate is a photochromogen. If no pigment is observed in darkness
or light, the isolate is a nonchromogen. In addition, polysorbate
80 hydrolysis and urea hydrolysis can be implemented to identify
scotochromogen and nonphotochromogenMycobacteriumspp.
Culturing Mycobacteria 15

Table 2 Most common differentiation tests used for mycobacterial characterization
Test Inoculation Incubation Reagents Positive reaction Negative reaction Nitrate Emulsify a loopful of growth
into 3–4 drops of water, add to 2 mL NaNO
3
2h,37

C, 5% CO
2
One drop of 1:2 HCl, two
drops AFB nitrate reagent A and AFB nitrate reagent B, if clear, add nitrate reagent C (zinc)
Red/pink (without
zinc)
No color development
(with zinc)
No color
development (without zinc)
Red/pink (with
zinc)
Niacin Add 1.5 mL water or saline to
culture grown on an L-J slant or Middlebrook agar. Scrape off surface growth with a pipette. Stab pipette through the growth into the medium to permit extraction of the niacin. Allow the ﬂuid to remain in contact with the culture by slanting the L-J or plate so the surface of the medium is in the horizontal position. Incubate ~30 min in this position. Remove 0.6 mL of the extract with a sterile pipette and transfer to the bottom of a 13

75 mm test tube
N/A Add one niacin test strip to
each 13

75 mm tube.
Read 12–15 min after strips are added
Yellow No color
development
Pyrazinamidase Streak two slants of Remel
pyrazinamidase medium with a loopful of colonies from solid media. The inoculum should be visible
37

C, 4 days.
Tube 1 is checked at 4 days. If
negative, check tube 2 at 7 days
Prepare reagent: Add 5 mL
water to one tube of granulated ferrous ammonium sulfate. Add 1 mL ferrous ammonium sulfate to slant. Refrigerate for 1 h
Red/pink No color
development
16 Elizabeth Wallace et al.

Pigmentation Inoculate 0.1 mL from the
primary growth tube into two L-J slants. Wrap foil around one tube and incubate both tubes under general growth conditions
Date growth is evident N/A Scotochromogen—
pigment development (color other than buff/ cream) in darkness.
Photochromogen—
pigment development in light
Nonchromogen—
no pigment development
Growth at
25, 37, 45, and 55

C
Inoculate 0.1 mL from the
primary growth tube into a Middlebrook 7H9 broth tube
Check growth on a weekly
basis, and record growth date on the date growth is evident. Record No Growth 1 week after initial growth date or 21 days, whichever is longer
N/A Growth No growth
TCH Prepare a barely turbid
suspension of the test isolate in sterile water or saline. Dilute suspension to 10

3
and 10

5
with sterile
water or saline. Add 0.1 mL of each dilution to a TCH plate
7, 14, and 21 days N/A Growth

1% of control
growth
Growth
<
1% of
control growth
Iron uptake Prepare a light suspension of
the test isolate from a pure culture. Transfer 0.1 mL to one L-J + 2.5% ferric ammonium citrate tube and one control tube of iron citrate-free L-J medium
Incubate in 5–10% CO
2
at
35–37

C with caps
loosened. Check weekly for up to 4 weeks
N/A Brown colonies No pigment
(continued)
Culturing Mycobacteria 17

Table 2 (continued)
Test Inoculation Incubation Reagents Positive reaction Negative reaction Growth on 5%
NaCl
Prepare a light suspension of
the test isolate from a pure culture. Transfer 0.1 mL to one L-J + 5% NaCl and one control tube of NaCl-free L-J medium
Incubate in 5–10% CO
2
at
35–37

C with caps
loosened. Check weekly for up to 4 weeks
N/A Growth No growth
MacConkey
w/out crystal violet
Inoculate 0.1 mL from a
growing test culture in broth that is at least 7 days old. Streak for isolation
Incubate in ambient air at
28–35

C for 5–11 days
N/A Growth No growth
Arylsulfatase
3 day/ 14 day
Add one drop actively
growing culture in a liquid medium to each tube (culture should be at least 7 days old)
35–37

C in ambient air for
3 and 14 days
Six drops of 2 N sodium
carbonate
Red/pink No color
development
Polysorbate
80 hydrolysis
Mix two drops of polysorbate
80 substrate to 1.0 mL of sterile demineralized water. Add one loopful of test isolate from a young, actively growing culture slant
Aerobically at 35–37

C.
Examine at 1, 5, and 10 days. Do not shake tubes while reading them
N/A Red/pink Amber color
Urea hydrolysis Inoculate a loopful of growth
from a young actively growing culture into urea broth. Vigorously mix against bottom and sides of tube
Aerobically at 33–37

C for
up to 7 days. Incubate an uninoculated tube as a negative control
N/A Red/pink No color change
18 Elizabeth Wallace et al.

Catalase Using a sterile inoculating
loop, remove a small amount of bacterial growth from agar and smear on a microscope slide
Performed when visible
growth is evident
Immediately before
performing the test, prepare a 1:1 mixture of 10% Tween and 30% H
2
O
2
. Add 1–2 drops of
the reagent to the test culture
Bubbles No bubbles
pH 7.0, 68

C
catalase
Emulsify several colonies in
0.5 mL of pH 7 phosphate buffer
68

C for 20 min, then
remove from heat and cool to room temperature
Immediately before
performing the test, prepare a 1:1 mixture of 10% Tween and 30% H
2
O
2
. Add 0.5 mL the
reagent to the test culture
Bubbles (within
20 min)
No bubbles
(within 20 min)
Culturing Mycobacteria 19

Table 3 Differentiation of most common mycobacterial species [
40
]
Species or Var.
Growth at 25

C Pigmentation
Nitrate reduction Niacin PYZ
Growth on 5% NaCl
Arylsulfatase 3/14 day
Polysorbate 80 hydrolysis Catalase
pH 7.0, 68

C
catalase
Urea hydrolysis
M. tuberculosis
NEG NON POS POS POS NEG NEG/NEG D ND NEG POS
M. bovis
NEG NON NEG NEG NEG NEG NEG/NEG NEG ND NEG POS
M. africanum I
NEG NON POS POS POS NEG ND/ND ND ND NEG POS
M. africanum II
NEG NON NEG POS NEG NEG ND/ND ND ND NEG NEG
M. caprae
NEG NON NEG NEG NEG NEG NEG/NEG ND POS NEG V
M. microti
NEG NON D POS POS NEG ND/ND ND ND NEG POS
M. pinnipedii
NEG NON NEG VAR ND ND ND/ND ND ND ND ND
M. canettii
NEG NON POS NEG ND ND ND/ND ND ND ND ND
M. avium
V NON NEG NEG POS D NEG/NEG NEG ND D NEG
M. xenopi
NEG S NEG NEG POS NEG V/ND NEG POS POS NEG
M. terrae
POS NON D NEG NEG NEG ND/ND POS ND POS NEG
M. intracellulare
POS NON NEG NEG POS NEG ND/ND NEG ND POS NEG
M. ulcerans
w –/S NEG D NEG NEG NEG/ND NEG ND POS NEG
M. haemophilium
POS NON NEG NEG POS NEG NEG/ND NEG NEG NEG NEG
M. kansasii
POS P POS NEG D NEG ND/ND POS POS POS POS
M. marinum
POS P NEG NEG POS ND NEG/ND POS ND NEG POS
M. gordonae
POS S NEG NEG NEG NEG NEG/ND POS ND POS D
M. scrofulaceum
POS S NEG NEG D NEG NEG/ND NEG NEG ND POS
M. abscessus
ND NON NEG ND POS POS POS/POS NEG ND ND POS
20 Elizabeth Wallace et al.

M. fortuitum
ND NON POS ND D POS POS/POS ND ND ND POS
M. chelonae
ND NON NEG ND POS NEG POS/POS NEG D ND POS
M. simiae
POS P NEG POS D NEG NEG/NEG NEG POS POS POS
M. szulgai
POS S/P POS NEG POS NEG ND/ND D ND POS D
M. smegmatis
ND NON POS ND ND POS NEG/ND ND ND ND ND
Symbols:
POS
positive,
NEG
negative,
V
variable.
+
90% or more of strains are positive,

90% or more of strains are negative,
D
11–89% of strains are positive,
V
variability of
reaction of strains within a given species,
W
weak reaction,
N
nonchromogenic,
S
scotochromogenic,
P
photochromogenic,
ND
not data available
Culturing Mycobacteria 21

1.15.4 TCH TCH agar (thiophen-2-carboxylic acid hydrazide) can be used to
differentiateM. bovisfromM. tuberculosis, as well as other non-
chromogenic SGM.M. bovisis typically sensitive to TCH
(at 1–5μg/mL), while most other SGM species (such asM. tuber-
culosis) are resistant.
1.15.5 Iron M. fortuitumand a few other rapid and slow growers can convert
ferric ammonium citrate to iron oxide. To do this, L-J media can be
supplemented with 2.5% ferric ammonium citrate to differentiate
mycobacteria on the basis of iron-uptake ability. To further differ-
entiate these rapid growers from slow growers, L-J media can also
be supplemented with 5% NaCl to differentiate based on salt toler-
ance.Mycolicibacillus trivialeandMycolicibacterium ﬂavescenscan
grow on salt-containing medium, howeverM. chelonaesubsp.che-
lonaewill not, distinguishing it from other members of the
M. fortuitumcomplex.
1.15.6 MacConkey
and Arylsulfatase
To further differentiate rapid growers, MacConkey agar without
crystal violet can be used. Two formulations of this agar allow for
better recovery of rapid growers such asM. fortuitum–chelonae
complex. Saprophytic strains of rapidly growing mycobacteria are
inhibited by the medium. In addition, the arylsulfatase 3- and
14-day test can be performed to differentiateM. fortuitumfrom
saprophytic mycobacteria by their ability to produce the arylsulfa-
tase enzyme at a detectable level after 3 days incubation. Other
species of mycobacteria may produce this enzyme but do so more
slowly; in this case, the 14-day test is implemented to identify SGM
species.
1.15.7 Catalase Lastly, a series of catalase tests can be used to identify and distin-
guish mycobacteria. AFB produce catalase; furthermore, a semi-
quantitative catalase test will divide mycobacteria into two groups:
the ﬁrst group beingM. kansasii,M. simiae, most scotochromo-
gens, the nonphotochromogenic saprophytes, and the rapid
growers, and the second group being M. tuberculosis,
M. marinum,M. aviumcomplex,M. xenopi, andMycobacterium
gastri. Additionally, catalase at 68
μ
C, pH 7.0, will distinguish the
thermostableMycobacterium scrofulaceum from the
scotochromogens.
1.16 Growth
ofM. tuberculosis
Under Hypoxic
Conditions
Several pathogenicMycobacteriumspecies, including members of
the tuberculosis complex, are capable of surviving during sustained
hypoxic environments. During that time, changes in metabolic
processes, including respiration and carbon utilization, structural,
including cell wall remodeling, and replicative process, occur as an
adaptation to hypoxia. Matched cultures of cells grown under
consistent, regulated, and monitored normoxic and hypoxic envir-
onments enable the study of these adaptations to advance research
22 Elizabeth Wallace et al.

in diagnostics and therapeutics. In this chapter, we will describe
how to growM. tuberculosisunder normoxic and hypoxic condi-
tions using a fermentor/bioreactor.
1.17 Quality Control
of Mycobacterial
Cultures
The laboratories that invest some time in practicing quality control
of their cultures ensure that their strains are what they expect them
to be, maximize reproducibility between cultures and experiments,
and minimize issues caused by using organisms that will not provide
the results needed or expected. In collections like ATCC and BEI
Resources, it has been observed that sometimes the material depos-
ited is not what the depositor described. This could be due to
human error, the use of outdated characterization techniques (for
example, next generation sequence allows to differentiate all spe-
cies, a feat not possible by other means) or simply by lack of basic
microbiological controls during the preservation and maintenance
in the laboratory. The main points to conﬁrm for every culture in
the lab should be:
1.17.1 Purity It is important to conﬁrm purity by analyzing the presence of a
single organism by standard macroscopic and microscopic observa-
tion, as well as molecular assays such as nucleic acid sequencing (for
example,hsp65 gene).
1.17.2 Viability The ability of the mycobacteria to grow once it has been preserved
is important to assure the strain can be used in the future. The
frequency and process to check viability varies depending on the
way the strain was preserved and stored. For example, cultures
stored in L-J slants might last only a few years, and viability should
be checked more often. A frozen glycerol stock or a lyophilized vial
might not require checking in long periods of time.
1.17.3 IdentiﬁcationConﬁrmation of the specimen identity down to the genus and
species level (if known) should be done for each lot. Accurate
identiﬁcation and characterization of the material is crucial for
compliance with regulations related to restricted agents.
1.17.4 Strain
Characterization
Some strains or isolates have unique characteristics that make them
useful or relevant for future work. These features should be con-
ﬁrmed prior use. Each laboratory might have deﬁned processes to
achieve this. For example, clinical isolates known to have deﬁned
antibiotic resistance patterns might require conﬁrmation of their
susceptibility proﬁles. Also, these characteristics might change dur-
ing laboratory passaging. For this reason, it is recommended that a
seed lot is made and preserved minimizing the number of passages.
Future lots will start from these seed lots, and not from cultures
passaged more times. One example of this is the cultures of
M. ulcerans, which are known to lose virulence by passaging
in vitro (usually after 3–4 passages in vitro). In this case, the
Culturing Mycobacteria 23

researchers need to infect animals, isolate the strain, and ensure the
resulting strain has “regained” its virulence. The derived culture
should be used immediately as a seed lot. This way, the researchers
will have access to a virulent strain without the need of animal work.
2 Materials
2.1 Preparation
of Bacterial Smears
1. Mycobacterial cells to stain.
2. Sterile water or broth.
3. Glass slides.
4. Bacteriological loop.
5. Methanol.
2.2 Gram Staining 1. Glass slides.
2. Gram stain reagents: including Gram crystal violet, decolorizer,
Gram staining iodine and safranin (Gram staining kit
from VWR).
3. Basin or sink.
4. Clean running water.
5. Microscope with 100oil immersion lens.
6. Immersion oil.
7. Culture of mycobacteria.
8. Sterile saline, water, or broth.
9. Methanol.
10. Bibulous paper.
2.3 Kinyoun Staining
(Cold Acid-Fast
Staining)
1. Kinyoun carbol fuchsin stain (seeNote 1): In 83.3 mL of
deionized (DI) water, dissolve 3.33 g basic fuchsin, 6.67 g
phenol, and 16.7 mL ethanol.
2. Decolorizer (3% acid alcohol) (seeNote 1): Combine 3.0 mL of
hydrochloric acid with 97 mL of ethanol.
3. Brilliant green counterstain (seeNote 1): Dissolve 1.0 g of
brilliant green in 100 mL of DI water.
4. Methylene blue counterstain (seeNote 1): Dissolve 0.3 g of
methylene blue in 100 mL of DI water.
2.4 Ziehl-Neelsen
Staining
1. Carbol fuchsin stain (seeNote 1): Dissolve in 90 mL of DI
water 0.3 g basic fuchsin, 5.0 g of phenol, and 10 mL of
ethanol.
2. Decolorizer (3% acid alcohol) (seeSubheading2.3,item 2).
3. Carbol fuchsin counterstain (methylene blue) (seeSubheading
2.3,item 4).
24 Elizabeth Wallace et al.

2.5 Auramine/
Rhodamine Staining
(SeeNote 1)
1. Auramine/rhodamine stain: In 75 mL of glycerol, dissolve
1.5 g of auramine O and 0.75 g of rhodamine B. Then add
10 mL of heated phenol crystals and 50 mL of DI water. Filter
through glass wool to clarify.
2. Decolorizer (0.5% acid alcohol): Combine 0.5 mL of HCl in
100 mL 70% ethanol.
3. 0.5% potassium permanganate counterstain solution. Dissolve
0.5 g of KMn04in 100 mL of DI water.
2.6 Fite-Faraco
Staining (SeeNote 1)
1. Serum phenol: Prepare a solution of 5% phenol w/v in DI
water + 2% v/v fetal bovine serum (FBS).
2. 37% v/v formaldehyde.
3. Gelatin phenol: In 90 mL DI water, add 0.5 g gelatin and
10 mL 5% w/v crystal phenol (seeNote 2).
4. Carbol fuchsin staining solution (seeSubheading2.4,item 1).
5. Acid alcohol: Combine 946.25 mL of DI water, 2.375 mL
ethanol, and 50 mL H
2SO
4(36 N).
6. Methylene blue or brilliant green counterstaining solution (see
Subheading2.3,items 3and4).
7. Reich counting slides.
8. Boiling water bath with ﬂat glass cover (large inverted Petri
dish) or hot plate at 100

C.
9. Microscope with known 100ﬁeld constant (seeNote 3).
10. 100objective immersion oil.
11. Platinum tip spreading tool.
12.M. lepraesuspension.
2.7 Small-Scale
Growth
1. ADC enrichment (seeNote 1): Aseptically, add 5.0 g bovine
albumin, 2.0 g dextrose, and 3.0 mg beef catalase to 100 mL of
DI water.
2. OADC enrichment (seeNote 1): To 100 mL of DI water, add
5.0 g bovine albumin, 2.0 g dextrose, 0.85 g sodium chloride,
4.0 mg beef catalase, and 50.0 mg oleic acid.
3. Middlebrook 7H9 broth + ADC: To 900 mL of DI water, add
2.5 g disodium phosphate, 1.0 g monopotassium phosphate,
0.5 gL-glutamic acid, 0.5 g ammonium sulfate, 0.1 g sodium
citrate, 50.0 mg magnesium sulfate, 40.0 mg ferric ammonium
citrate, 1.0 mg zinc sulfate, 1.0 mg copper sulfate, 1.0 mg
pyridoxine, 0.5 mg calcium chloride, 0.5 mg biotin, and
2.0 mL glycerol (seeNote 1). Heat and stir to dissolve. Auto-
clave at 121

C for 15 min. Once medium is at room tempera-
ture, add aseptically 100 mL of ADC enrichment.
Culturing Mycobacteria 25

4. Middlebrook 7H10 + OADC: To 900 mL of DI water, add
1.5 g disodium phosphate, 1.5 g monopotassium phosphate,
0.5 gL-glutamic acid, 0.5 g ammonium sulfate, 0.4 g sodium
citrate, 40.0 mg ferric ammonium citrate, 25.0 mg magnesium
sulfate, 1.0 mg zinc sulfate, 1.0 mg copper sulfate, 1.0 mg
pyridoxine, 0.5 mg calcium chloride, 0.5 mg biotin, 0.25 mg
malachite green, 5.0 mL glycerol, and 15.0 g agar (seeNote 1).
Heat and stir. Autoclave at 121
μ
C for 15 min. Cool agar to
45–50
μ
C before adding aseptically 100 mL of OADC enrich-
ment. Mix and pour into petri dishes. Cool and harden accord-
ing to instructional guidelines (seeNote 4).
2.8 Large-Scale
Growth
ofM. tuberculosis
for Research
1.M. tuberculosis, 1 mL frozen stock.
2. 7H11 + OADC large agar plate (15γ150 mm): To 900 mL of
DI water, add 5.0 mL glycerol, 1.5 g disodium phosphate,
1.5 g monopotassium phosphate, 1.0 g pancreatic digest of
casein, 0.5 gL-glutamic acid, 0.5 g ammonium sulfate, 0.4 g
sodium citrate, 50.0 mg magnesium sulfate, 40.0 mg ferric
ammonium citrate, 1.0 mg malachite green, 1.0 mg pyridox-
ine, 0.5 mg biotin, and 15.0 g agar (seeNote 1). Heat and stir
to dissolve. Autoclave at 121
μ
C for 15 min. Cool agar to
45–50
μ
C before aseptically adding 100 mL of OADC enrich-
ment (seeSubheading2.7,item 2). Mix and pour into Petri
dishes. For use with large-scale growth for research protocol,
pour into large 15γ150 mm plates. Cool and harden accord-
ing to instructional guidelines.
3. Inoculation loops, 10μL.
4. Plastic zip freezer storage bags.
5. 2.8 L Fernbach ﬂasks (seeNote 5).
6. 1 L sterile glycerol alanine salts (GAS) medium: To 900 mL of
DI water, add 0.3 g Bactocasitone, 0.05 g ferric ammonium
citrate, 4.0 g dibasic anhydrous potassium phosphate, 2.0 g
citric acid, 1.0 gL-alanine, 1.2 g magnesium chloride, 0.6 g
potassium sulfate, 2.0 g ammonium chloride, 1.8 mL sodium
hydroxide 10 M, and 10 mL glycerol (seeNote 1). Dissolve
components and bring volume up to 1 L. Adjust pH to 6.6.
Upscale recipe to larger volume as needed and distribute to
ﬂasks once pH adjusted. Autoclave ﬂasks with media on liquid
cycle at 121
μ
C for 45 min.
7. Cell scrapers.
8. Paraﬁlm.
9. Orbital platform shaker with appropriate metal clamps.
10. Serological pipettor with 10 and 50 mL pipettes.
11. 1 L roller bottles with solid plastic caps containing 400 mL
GAS medium (seeNote 6).
26 Elizabeth Wallace et al.

12. 4 L bottles (seeNote 5) sterile.
13. 0.2μm ﬁltration units for bottles (VacuCap with tubing).
14. 230 mL polycarbonate centrifuge conical that matches centri-
fuge rotor/insert.
15. Balances (equal arm/trip beam and top loading).
16. Sterile pyrogen-free, 0.2μm ﬁltered water.
17. 37
μ
C warm room (seeNote 7).
18. Sodium azide (NaN3).
19. Roller bottle apparatus.
2.9 Inoculation
of Athymic Nude
Mouse Footpad
withM. leprae
1. Athymic nude mice 4–6 weeks old (seeNote 8).
2. PPE: laboratory coats or surgical gowns, shoe covers, hair
bonnets, gloves, mask, and safety glasses.
3. Freshly harvested viableM. lepraesuspension adjusted to
1γ10
9
/mL (seeNote 9).
4. 0.5 mL graduated sterile syringes.
5. 27 or 28 G needles.
6. Alcohol swabs.
7. Absorbent bench liner.
2.10 Harvesting Live
M. lepraefrom
Athymic Nude Mouse
Footpads
1. RPMI-10: To sterile RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientiﬁc,
USA), add FBS aseptically to a ﬁnal concentration of 10% v/v.
2. Heat-inactivated FBS.
3. Ampicillin.
4. Gentamicin.
5. 70% ethanol.
6. Betadine (povidone-iodine 10%) solution.
7. Blood agar plates.
8. Chocolate agar plates.
9. Thioglycolate broth.
10. L-J agar slants (seeNote 1): To 367.5 mL of DI water, add
30.0 g potato ﬂour, 3.6 g asparagine, 2.4 g monopotassium
phosphate, 0.6 g magnesium citrate, 0.4 g malachite green,
0.24 g magnesium sulfate, and 7.5 mL glycerol. Heat and stir
to dissolve. Autoclave at 121
μ
C for 15 min. Cool to 50–60
μ
C
before aseptically adding 625 mL of egg base. The egg base is a
uniform suspension of fresh eggs prepared under aseptic con-
ditions. Avoid whipping air into suspension during the collec-
tion and mixing. Once the media and the egg base are
combined, pour into screw top slants. Place into slant position.
Heat to 85
μ
C for 45 min (seeNote 4).
Culturing Mycobacteria 27

11. Sterile hemostats.
12. Sterile forceps.
13. Sterile scalpels #10.
14. Sterile small surgical shears.
15. 50 mL Oakridge tubes.
16. Sterile cups.
17. Sterile Petri plates.
18. Sterile 10 and 5 mL glass pipettes.
19. 15 mL Tenbroeck handheld tissue homogenizer (glass).
20. Sterile 5 and 10 mL syringe.
21. Sterile 27 G needle.
22. Gauze.
2.11 Radio-
respirometry of Live
M. leprae
1. Whatman #42 ashless ﬁlter paper cut into 2γ4 cm strips.
2. Liquid scintillation concentrate (PPO-POPOP toluene con-
centrate) (seeNote 10).
3. PPO (seeNote 10).
4. Triton X-100.
5. NaOH-MeOH (8 g NaOH in 100 mL methanol) (seeNote
11).
6. Radiorespirometry media: To 99 mL of DI water, add 0.47 g
7H9 base, 0.1 g casein hydrolysate, 0.5 g BSA, 4000 IU cata-
lase, and 1.0 mL ampicillin (5 mg/mL). Filter sterilize using
0.2μm ﬁlter unit. DO NOT autoclave. Add 0.5μCi
14
C
palmitic acid. Store at 4
μ
C(seeNote 12).
7. Ampicillin (5 mg/mL).
8. Sterile ﬁlter units (0.2μm).
9. Palmitic acid [1-
14
C] (100μCi/mL) in ethanol.
10. Sterile 6.0 mL capacity glass vials with caps.
11. 20 mL liquid scintillation vials (plastic).
2.12 Infecting
Armadillos
withM. leprae
1. Inoculum: 1γ10
9
M. lepraein a maximum vol of 1 mL,
derived from athymic nude mouse footpads.
2. Ketamine, Vetone zetamine (100 mg/mL) dosage, 0.6 mL
given intramuscularly (IM).
3. Dexmedetomidine: Dexdomitor (0.5 mg/mL) dosage, 0.4 mL
given IM.
4. 70% ethanol.
5. Reagents to test anti-PGL-1 serum antibodies [41].
28 Elizabeth Wallace et al.

6. WBC and hematocrit are run in an Element HT5 veterinary
hematology analyzer (HESKA).
7. Liver enzymes (LDH, ALT, and AST) are run in an Element
DC veterinary chemistry analyzer (HESKA) using the manu-
facturer’s recommended reagents.
2.13 Harvesting Liver
and Spleen from
M. leprae-Infected
Armadillos,
and Puriﬁcation
ofM. lepraefrom
Harvested Tissues
1. Gentamicin: Vetone gentamicin (100 mg/mL), 1 mL.
2. Penicillin antibiotic solution: Aspen Bactracillin G benzathine
(Penicillin G Benzathine and Penicillin G Procain, 300,000 U/
mL), 2 mL (seeSubheading2.12,items 2and3).
3. Infected liver or spleen tissue (seeNote 13).
4. L-J agar slants (seeSubheading2.10,item 10).
5. 7H11 agar slants: Prepare Middlebrook 7H11 agar as in Sub-
heading2.8,item 2, under and prepare in slant pour into screw
top slants. Place in slant position.
6. 1 L sterile beaker (seeNote 14).
7. 400 mL sterile beaker.
8. 250 mL sterile beakers (seeNote 14).
9. 14 50 mL Teﬂon Oakridge (Nalgene) tubes (seeNote 14).
10. Homogenization chamber (seeNote 14).
11. Homogenizer (seeNote 14).
12. Sterile stir bars (seeNote 14).
13. Sterile scissors (seeNote 14).
14. Brain Heart Infusion (BHI) broth.
15. Milli-Q water.
16. Tryptic Soy Agar (TSA).
17. 100 mm Petri plates.
18. Inoculation loop.
19. 10 mM Na
2EDTA: Dissolve 3.72 g of Na
2EDTA in 900 mL of
DI water. Adjust pH to 7.1–7.2 and then complete to 1 L with
DI water. Autoclave, using a liquid cycle for 20 min. Store at
4

C, use cold.
20. 10 mM Na
2EDTA/0.1 M NaOH buffer: Dissolve 3.72 g of
Na
2EDTA in 900 mL of DI water. Adjust pH to 7.1–7.2.
Complete to 1 L with DI water. Add 4.0 g NaOH. Autoclave
using a liquid cycle for 20 min. Store at 4

C, use cold.
21. 0.1 M Tris–HCl (ph 7.2). Dissolve 15.76 g Tris–HCl in
800 mL DI water. Adjust pH to 7.2 and complete volume to
1 L. Autoclave using a liquid cycle for 20 min. Store at room
temperature.
Culturing Mycobacteria 29

22. 10γphosphate buffer: Dissolve 60.4 g Na
2HPO
4and 9.0 g
Na2HPO4in DI water. Take volume to 0.5 L. Autoclave using
a liquid cycle for 20 min. Store at room temperature.
23. 0.2% Tween 80 solution. Add 20 mL 10% Tween 80 to
980 mL DI water. Autoclave using a liquid cycle for 20 min.
Store at room temperature.
24. Buffered water (0.1% Tween 80, 0.1 M phosphate). To
800 mL DI water, add 100 mL of 10γphosphate buffer (see
above) and 10 mL of 10% Tween 80. Adjust pH to 7.1–7.2.
Complete to 1 L with DI water. Autoclave using a liquid cycle
for 20 min. Store at room temperature.
25. 0.01 M phosphate saline buffer: To 800 mL DI water, add
1.09 g KH
2PO
4. Adjust pH to 6.9. Dissolve 0.46 g NaCl.
26. 6% PEG/8% Dextran/0.01 M phosphate saline buffer: To
800 mL of 0.01 M phosphate saline buffer, add 48.0 g of
polyethylene glycol (PEG) and 64 g of dextran. Scoop dextran
and add slowly to the PEG/potassium phosphate solution
(do not pour in one go) for complete dissolution. DO NOT
complete the volume. Autoclave using a liquid cycle for
20 min. Store at room temperature. Solution will be clear
after autoclaving; shaking will cause cloudiness and separation
into layers.
27. 1 M calcium chloride. Dissolve 27.75 g of CaCl
2in DI water,
and then complete to a ﬁnal volume of 250 mL. Autoclave
using a liquid cycle for 20 min. Store at 4
μ
C.
28. Collagenase (lyophilized powder, from sterile-ﬁltered
solution).
29. Trypsin (lyophilized powder, bioreagent or cell culture grade).
30. Chymotrypsin (lyophilized powder, cell culture or USP grade).
31. 0.2μm Acrodisc syringe ﬁlters.
32. 1 mL syringes.
33. 500 mL separatory funnel.
34. Microslides.
35. Microscope.
36. Glass tubes (seeNote 14).
37. Spectrometer.
2.14 Culture
ofM. tuberculosis
Using a Fermentor/
Bioreactor Under
Normoxic and Hypoxic
Conditions
1. GAS media (seeSubheading2.8,item 6andseeNote 15).
2. Bioreactor compatible for the use of BioBLU fermentation
vessels (seeNote 16).
3. Two BioBLU, single-use bioreactor vessel, single-pitched
blade with up to 3.75 L working volume capacity and macro-
sparger (from Eppendorf North America, Inc).
30 Elizabeth Wallace et al.

4. Peristaltic pump.
5. Dissolved oxygen (DO) probe with proper calibration (see
Note 17).
6. pH probe with proper calibration (seeNote 18).
7.M. tuberculosislarge-scale inoculum (seeSubheading3.8).
8. 2.5% Vesphene solution.
9. 70% ethanol.
10. NEB Bioreactor incubator jacket.
11. NEB Bioreactor control unit.
12. 0.8/0.2μm syringe ﬁlter or Steriﬂip 50 mL conical ﬁlter.
13. 60 mL syringe.
14. Aerosol-resistant centrifuge with rotors and buckets for 15 and
50 mL conicals.
15. 50 or 230 mL centrifuge tube.
16. Sterile 4 L glass bottle.
17. VacuCap.
3 Methods
3.1 Preparation
of Bacterial Smears
1. To stain growth from liquid culture, place a drop on the
microscope glass slide.
2. For cultures grown on solid media, place a drop of water,
saline, or broth onto the slide. Select a single colony with a
loop and suspend it in the drop on the slide and let air-dry.
3. Fix the smear to the slide, either by means of heat or methanol
(seeNote 19).
(a) To heat-ﬁx the smear, place the slide over an open ﬂame
for a few seconds, or on a hot plate (100
μ
C) for up to a
minute.
(b) To ﬁx the smear using methanol, ﬂood the slide with cold
methanol for 5 min.
(c) Air-dry in the BSC. Slides can then be removed from the
BSC for staining.
3.2 Gram Staining 1. Place ﬁxed slide over basin or sink.
2. Add Gram crystal violet to cover slide.
3. Wait 60 s and rinse gently.
4. Add Gram iodine to cover slide.
5. Wait 60 s and rinse gently.
6. Hold the slide at an angle near running water.
Culturing Mycobacteria 31

7. Squeeze Gram decolorizer over the slide for a few seconds.
Slides with a thick ﬁlm of cells will need to decolorize longer
than those with only a few cells. Quickly rinse the decolorizer
off with clean water.
8. Add Gram safranin to cover slide. Wait 60 s and rinse gently.
9. Dry the slide with bibulous paper.
10. Examine under a microscope with a 100oil immersion objec-
tive without a phase ﬁlter. Mycobacteria are generally weakly
Gram positive (seeNote 20).
3.3 Kinyoun Staining1. Prepare the slide for staining as indicated in Subheading3.1.
2. Flood the slide with Kinyoun carbol fuchsin for 4 min.
3. Rinse slide with a gentle stream of tap water to remove fuchsin.
4. Flood the slide with decolorizer for 3–5 s.
5. Rinse slide with a gentle stream of tap water.
6. Counterstain with brilliant green or methylene blue for 30 s.
7. Rinse slide with a gentle stream of tap water.
8. Air-dry the slide.
9. Examine the slide on an appropriate light microscope, using a
100oil immersion objective without a phase ﬁlter (seeNote
21)(seeFig.1).
3.4 Ziehl-Neelsen
Staining (SeeFig.6)
[16]
1. Prepare the slide for staining as indicated in Subheading3.1.
2. Cover the smear with a piece of bibulous paper.
3. Flood with carbol fuchsin.
4. Heat the slide for 5 min while keeping the bibulous paper moist
with the carbol fuchsin. Heat can be achieved with a Bunsen
burner or a hot electric plate at 65–75

C (recommended).
During the process, avoid drying by addition of more stain as
needed.
5. Let the slide cooldown.
6. Remove the bibulous paper and gently rinse the slide with
distilled water to remove excess carbol fuchsin.
7. Decolorize by pouring acid alcohol onto the slide until the
runoff is clear.
8. Gently rinse the slide with distilled water to remove
decolorizer.
9. Counterstain with methylene blue for 1 min.
10. Rinse the slide with distilled water.
11. Blot (do not rub) the slide dry in a tablet of bibulous paper.
12. When the slide is dry, observe the bacteria under a microscope
with oil immersion.
32 Elizabeth Wallace et al.

3.5 Auramine/
Rhodamine Staining
1. Place slides on a staining rack so they are at least 1 cm apart, and
ﬂood with auramine/rhodamine stain and let stand for 20 min.
2. Rinse the stain away with chlorine-free water and tilt slide to
drain.
3. Flood the slide with 0.5% acid alcohol and let stand for 2 min.
4. Wash off the acid alcohol with distilled water.
5. Flood slides with 0.5% potassium permanganate for 1–2 min
(seeNote 22).
6. Wash off the stain with distilled water.
7. Allow slides to air-dry in the slide rack. DO NOT BLOT!
8. Protect smears from light and examine immediately using the
ﬂuorescent microscope. If unable to read right away, place
slides in dark box.
3.6 Fite-Faraco
Staining
and Enumeration
ofM. leprae
Suspension (See
Fig.7)
1. Make dilutions ofM. lepraesuspension (1:100, 1:1000, and
1:10,000) using sterile broth (7H9, RPMI-10, or
RPMI 1640).
2. Add 10μL of serum–phenol solution to each circle of the
counting slide, then add 10μL of theM. lepraesuspension to
each circle of the slide (seeNote 23).
Fig. 6Ziehl-Neelsen staining of puriﬁedM. lepraeharvested from an infected armadillo spleen, with no or little
tissue contamination (panelsa,b), or from liver with about 1% tissue contamination (panelsc,d)
Culturing Mycobacteria 33

3. Spread the serum–phenol/suspension thoroughly and evenly
throughout the circle on the Reich slide with the platinum
tip tool.
4. Allow the slide to air-dry on a level surface.
5. Fix the slide in formaldehyde vapor for 3 min.
6. Heat the slide over a boiling water bath with ﬂat cover or hot
plate (100

C) for 2 min.
7. Flood slide with gelatin-phenol solution then drain (seeNote
24).
8. Repeatstep 6.
9. Fix the slide in formaldehyde vapor for 2 min.
10. Repeatstep 6.
11. Allow the slide to cool.
12. Flood the slide with carbol fuchsin for 20 min.
13. Wash slide thoroughly in water.
14. Wash with acid alcohol for 10–15 s or until stains stop running.
15. Wash slide with water.
16. Counterstain with methylene blue or brilliant green for
1–2 min.
17. Wash slide with water.
18. Allow slide to air-dry.
19. Count AFB in 20 consecutive ﬁelds (3), in each circle (see
Note 25).
Fig. 7Fite-Faraco stain showing disperseM. lepraeclusters throughout the
parenchyma of the spleen of an infected armadillo. Magniﬁcation shown is 40
34 Elizabeth Wallace et al.

20. Calculate theM. leprae/mL using the following formula for
individual dilutions:
¼Count1þCount2þCount3?? 60??γ Microscope Constant
γDilution Factor:
21. Calculate the mean of the dilutions to get a more accurate
M. leprae/mL count.
3.7 Small-Scale
Culture
ofM. tuberculosis
1. Thaw frozen stock or rehydrate lyophilized stock according to
manufacturer’s instructions.
2. Transfer contents (up to 1.5 mL) to 6 mL of 7H9 + ADC broth
(seeSubheading2.7,item 3). Pipette up and down slowly to
mix without aerosolizing.
3. Transfer 0.1 mL each to selective media (Middlebrook 7H10
+OADC,seeSubheading2.7,item 4) and nonselective media
(usually TSA) and streak for isolation (seeNote 26).
4. Incubate according to species recommendations (seeNote 27).
3.8 Large-Scale
Growth
ofM. tuberculosis
for Research Purposes
For an overall description of this protocol, please see the diagram in
Fig.8. The production of mycobacterial cells and culture ﬁltrate
protein (CFP) in a large-scale format is necessary for the generation
of raw material used to generate reagents and standards for research
conducted by the scientiﬁc community at large.
1. Thaw a 1 mL frozen stock ofM. tuberculosis.
2. Pipette 200μL of the stock onto a large 7H11 + OADC agar
plate and streak to grow as a lawn with a sterile bent
plastic loop.
Fig. 8Diagram of large-scale culture.
*
An extra plate and extra Fernbach are optional but recommended as
back-up if needed.FBFernbach,RBRoller bottle,CFPculture ﬁltrate protein
Culturing Mycobacteria 35

Random documents with unrelated
content Scribd suggests to you:

Matti ajaa retuutti taas tuttua tietään rautatielle ja toi
sanomalehden, mutta ei siitä Jussila suureksi harmikseen löytänyt
sanaakaan Vuorenpään maanviljelyskokouksesta eikä puheestaan
kunniavieraalle.
11.
Vuorenpään koulujutussa olivat tarpeen hyvät keinot. Sen tiesi
Jussila ja sen tiesivät kaikki muutkin, jotka sivistyksen edistämistä
kunnassa harrastivat. Siinä ei saanut pitää liian isoa ääntä, sillä
siihen heräisivät taas kaikki vastustajat. Piti toimia hiljaisuudessa
ensin ja sitten äkkirynnäköllä ottaa voitto, joka keino monasti
ennenkin oli huomattu tepsivimmäksi.
Päätettiin pitää ylimääräinen kunnankokous keskellä kiireimpää
heinäaikaa, voittaa asialle puoltajia niin paljon kuin mahdollista ja
ottaa niiltä valtakirjat, sillä heidän suullinen lupauksensa ei
merkitseisi mitään. He joko jäisivät kokouksesta pois, tai jos sinne
tulisivatkin, kääntäisivät helposti kelkkansa ympäri.
Mutta juuri kun tätä asiaa parhaillaan alettiin puuhailla ja
valmistaa, sattui seikkoja, jotka joksikuksi ajaksi keskeyttivät koko
homman.
Ensinnäkin uhkasi kunnallista hallintoa ja hyvinvointia yhtäkkiä
ennen aavistamaton vaara, joka antoi paljon touhua ja pään vaivaa
niille, jotka valppaina ja etupäässä yhteisten asiain menoa vartioivat.
Ja kun siitä oli parahiksi selvitty, tuli toinen tärkeä juttu, joka syrjäytti
kaikki muut siksi kertaa.

Eräänä kauniina aamuna alku heinäkuusta ajaa karahutti lukkari
Kukkonen läähöttävällä hevosella Jussilaan, missä talon miehet kaikki
parhaillaan olivat koossa alapihalla, pannen isännän oman johdon
alla niittokonetta kuntoon. Se oli vedetty talviteloiltaan ulos lähes
vuotisen leponsa jälkeen näkemään kesäistä vihannuutta taas ja
tekemään siitä loppua. Sitävarten sen kanssa nyt puuhailtiin,
asetettiin paikoilleen pyöriä ja aisoja, pyyhkieltiin talvisia pölyjä pois,
rasvailtiin ja koeteltiin mitenkä kukin ratas ja vipusin teki tehtävänsä.
Terät olivat kirkkaiksi ja pureviksi tahkotut ja irvistelivät niinkuin
pedon välkkävät hampaat, odottaen hetkeä milloinka saisivat iskeä
heilimöivään heinään.
Tyytyväisellä mielellä katseli Jussila konetta, asettui istuimelle ja
antoi miesten nykäistä aisoista eteen ja taa, jolloin pyöräin rallista
lähti ratiseva naksutus. Hyvä se oli kone ja huokea vetää, eikä
painanut paljon hevosten niskoillekaan, niinkuin ne ovat uusimman
malliset koneet, joka vaan niitä ymmärtää ostaa, arveltiin
yksimielisesti.
— Eipä ole joka talossa sellaista viikatetta. Ruumiin hiellä saavat
vaan heinänsä poikki kalhuta, tuumaili isäntä. — Leikkiä se on meillä
heinänteko!
— Eikä ole monellakaan talolla missä tuollaista konetta edes
käyttäisi, täydensi Matti.
Samassa kuului nummelta ratasten räikinä ja lukkari laskettaa
mäkeä alas Jussilan kujan suuhun, ja samaa vauhtia pihaan. Kaikki
kääntyvät katsomaan, että mikä kiire miehellä, kun on hevonen
märkä kuin uitettu.

Jussila rientää vastaan ja aavistaa jo pahaa, kun näkee lukkarin
naaman tavallista vakavampana.
— No mikä kiire sinulla nyt? kysäsee hän, ennenkuin toinen on
astunut rattailta tai edes jumalaa maininnut.
Tulija hyppää maahan niin että lihava leuka vavahtaa, melkein
läähöttäen itsekin.
— Nyt on tainnut piru mennä mertaan, sanoo hän matalalla
äänellä, tervehtäissään isäntää.
— Mitä on tapahtunut?
— Kummia vallan. Mennäänpä huoneeseen niin kuulet. Seuraava
keskustelu syntyi jo portailla:
— Nyt se meidän maisterimme meni, ja luulenpa, että ovat asiat
varsin arveluttavalla kannalla. Sitävarten…
— Kuka maisteri? Vuorinenko?
— Sama herra.
— Onko hän kuollut, vai mitä tarkoitat hänen menollaan? tokaisi
Jussila, ymmärtämättä mistä oikeastaan oli kysymys.
— Pahemmin vielä. Hän on mennyt maasta pois, ulkomaille. Illalla
lähti ja taitaa nyt jo seilata Itämerta. Sitävarten riensin tänne. Millä
sen köyhän rotan luulet muulla menneen kuin kunnan rahoilla — ja
meijeriyhtiön rahoilla, kun hänen onnettomuudeksi piti vielä nekin
hoitoonsa saaman. Jussila ravisti päätään ja vihelsi.
— Hui hai! Eikö kukaan tiennyt hänen aikeistaan?

— Ei kukaan, ennenkun vasta eilen iltapäivällä minä. Niinkun
muistat, valittiin minut syksyllä sen hyväisen virkaatekevän
viransijaiseksi lautakunnassa. Eilen illalla hän sitten tuli meille,
mätkäytti tililaukun pöytään ja sanoi heittävänsä muutamaksi ajaksi
minun huostaani koko roskan, koska minut kerran oli viransijaiseksi
määrätty. Sanoi itse lähtevänsä syyskesäksi maailman rantoja
katselemaan. Renkinsä toi käsikärryillä kassakaapin ja väänsi sen
kamarini lattialle.
— Etkö lyönyt vastaan niin äkkipikaista lähtöä?
— Parhaani mukaan. Kysyin oliko hänellä kunnan lupaa, sillä ei
hän ilman sitä saisi noin vaan lähteä pyrähtää. Mutta mitä hän?
nauroi heittiö vaan vasten naamaani ja näytti röyhkeästi passiaan,
sanoen siinä olevan lupakirjaa tarpeeksi. Ja tuskin hän siltä
retkeltään enää palaa. Hohhoh! lopetti lukkari sylästen ja päätään
raapasten, anna velikulta sikaari suuhuni, en muistanut kiireessä
ottaa mukaani ja on pitänyt koko tien tupakan nälkää kärsiä, niin
että siihen paikkaan hiukenee.
— Täällä on. Jopa kuuluu kummia. Ja kuinka vähin äänin ja
salaperäisesti on veitikka toiminut, että jos passikin oli valmiina!
— Valmiina oli.
— Mutta vähätpä me mokomasta herrasmiehestä, kiitetään
päästyämme, kunhan olisi tuonut sinulle kassan kajoomattomana.
— Siinäpä sitä seistään. Toi niin vähän rahaa, että minä siitä sekä
hänen kiireellisestä lähdöstään heti aloin epäillä. Siltakassan hän
kyllä toi kokonaan, sen kaksituhatta, joka määrättiin talletettavaksi.
Pyysi minun sitä tallettamaan, koska ei ollut itse vielä ennättänyt,

mutta muissa kassoissa ei sanonut rahoja löytyvän kuin tuiki vähän,
eikä meijerikassassa penniäkään.
— No mitähän tuolla oli olevinaan tekoa ulkomaalla, kun ei ole
mitään tehnyt omassa maassakaan.
— Mitäkö tekoa? Kyllähän sen heti arvaa. Lähti tietysti asioitaan
pakoon, ja sano minun sanoneeni, että sille tielleen hän jää, jollei
tuomalla tuoda takaisin. Talo paha on velkana, ei ole joukkoa
suremassa, mikä oli mennessä.
Mies, jonka nyt luultiin lähteneen kassojen rahoja ulkomaille
tärväämään, oli väliaikainen kunnallislautakunnan esimies. Hän oli
aikaisemmin ollut lukutiellä, vaan kun yleisen arvelun mukaan ei ollut
kyennyt virkaa itselleen hankkimaan, oli hän hommannut pienen
maatilan itselleen kotipitäjässään ja sitä nyt viljeli. Hänet oli suotta
aikojaan valittu varaesimieheksi lautakunnassa, joka tietysti on
enemmän nimellinen kuin todellinen toimi kunnallisten asiain
hoidossa, mutta olikin niinkuin tapaturmassa saanut ottaa vastaan
koko lautakunnan johdon, kun vakinainen esimies oli kesken
virkaansa kuollut. Lähes vuosikauden oli hän jo sitä virkaa pitänyt, ja
hänen virka-ajakseen taas oli varamieheksi valittu lukkari Kukkonen.
Sitten oli hänen hommastaan perustettu osuusmeijeri seurakuntaan
ja pantu hänet tuon uuden liikkeen rahastonhoitajaksi. Mutta
vähävarainen kun oli, ei hän voinut saada kunnan mahtimiesten
luottamusta, eikä hän sitä toden teolla koettanutkaan saada kun
pysyi monissa asioissa erimielisellä kannalla näiden kanssa.
Ennen vuoden loppua tapahtuvissa uusissa vaaleissa olikin jo
päätetty hylätä hänet ja valita joku varakkaampi, luotettavampi mies
niin edesvastuun alaiseen toimeen kuin lautakunnan esimiehen virka
oli.

Ja haikeasti oli jo moni meijerinkin osakas, etupäässä lukkari
Kukkonen, katunut sitä, että sellaisen tyhjän miehen haltuun oli
osakerahansa ja meijerin hoidon uskonut.
Kyllähän sieltä aina jonkunlainen hinta tuli maidosta ja tekihän se
vuoden lopulla tilit, mutta voittoa ei tullut liikkeestä mitään, vaikka jo
kaksi vuotta oli käynnissä ollut. Olisihan sen meijerin voinut perustaa
kuka tahansa, päätettiin, tai jokainen käyttää rahansa itse
tuottavammin, ettei sitä olisi toisen käytettäväksi antanut. Omaksi
hyväkseen hän sen meijerin laittoi, itse hyötyäkseen, osaa hän
päältä kyllä koreasti ottaa osan omaan taskuunsa ja siltä tehdä
meille selvät tilit. Ja hänen on täytynyt ottaa, koska niin äkkiä oli
alkanut taloaan parannella, eikä tiettävää tuloa ole miehellä ollut
mitään!
Niin päätti lukkari nytkin katkeralla mielellä.
— Pahoja tekojaan karkuun hän lähti, ennenkuin joutuisi
kiinniottoon. Lähti kuin poika, julkisesti vallan, ja koppasi hyvät
matkarahat taskuunsa.
— Johan minä sitä sanoin, että siinä pantiin pukki kaalimaan
vartijaksi, sanoi Jussila. — Ja mitä ne sellaiset puolitekoiset herrat
muutenkaan ymmärtävät kunnan asioista. Ei niitä yliopistoissa
opeteta.
— Pyh, mitä ne! sylkäisi lukkari halveksuvasti. — Mutta kuule nyt
hyvä veli, tässä on kiireimmän kautta tarkastettava kaikki paperit,
tilit ja kassat, ennenkun tuo häpeämätön luistaa käsistämme
saavuttamattomiin. Sitävarten riensin tänne ensimmäiseksi. Lähde
nyt heti mukaani, minä haetutan varmuuden vuoksi pastorin ja
Mikkolan myös.

Ja niin saivat miehet paljon hommaa, paljon pään vaivaa, ja monta
kuumaa kesäpäivää siinä hikoiltiin lukkarin luona tarkastellen ja
selaillen papereita.
Illalla myöhään saapui Jussila kotiin ja aamulla lähti taas.
Mutta ei löydetty papereista mitään aihetta lähettää
vangitsemiskäskyä "karkurin" jälkeen, ja niin sai hän rauhassa
kuleksia, missä lie kuleksinut.
Meijerin suhteen pysyttiin sentään yhä epäilevällä kannalla, ja
yhteisestä suostumuksesta ottikin lukkari heti paikalla hoitoonsa ja
uudestaan tuottavammalle kannalle järjestääkseen koko liikkeen.
Nolostutti tämä juttu tosin tarkastusmiehiä vähän, varsinkin kun
siitä oli huhu ennättänyt levitä koko pitäjään, mutta he lohduttivat
itseään sillä että olivat täyttäneet velvollisuutensa ja valppaina
kuntalaisina panneet yhteisen edun valvonnan omien kiireellisten
toimiensa yläpuolelle sillä ainahan on syy pahaa pelätä ja tässäkin oli
parempi katsoa kuin katua, sillä eihän niihin kaikkiin poikaviikareihin
voinut täydelleen luottaa.
Ja vaikkei johtanutkaan mihinkään sellaisiin tuloksiin kuin oli
luultu, oli tuo tarkastus, varsinkin Jussilan mielestä, ollut erittäin
tervetullut. Sillä hän alkoi yhä enemmän kaivata julkista toimintaa.
Se oli varsinkin maanviljelyskokouksen jälkeen muuttunut hänelle
todelliseksi elintarpeeksi.
Kun hän toisena aamuna lähti kotoaan ja Matti ajoi hänelle
hevosen porrasten eteen, oli hänestä oikea nautinto nousta rattaille
mukavasti istumaan ja sanoa mahtavalla äänen painolla ja
kurkkuaan karauttaen, että "pitää tästä taas lähteä niitä kunnan

tilejä tutkimaan, koska ne nyt ovat niin sekaisin niiden poikain
hoidossa päässeet. Pitäkää vaan, Matti, hyvää komentoa täällä
kotitöissä."
Ja ajaessaan kirkolle päin, istuessaan yksinään rattailla hiljaisella
nummella, missä ei kukaan vastaantulija aatosta häirinnyt, mietiskeli
hän taas niitä monia parannuksia, joita tämän hänen
kotiseurakuntansa asiat kaipasivat. Ja niitä ilmestyi hänen terävään
huomioonsa uusia yhä, sellaisia, joita eivät uneliaat kuntalaiset olisi
osanneet aavistaakaan.
Rivakampaa toimintaa tarvittaisiin kaikkialla, päättää hän. Joka
kohta käy nykyään kuin nukkuvan rukous. Muista pitäjistä on
yhtenään luettavana lehdissä, kuinka on sellainen tai sellainen
parannus pantu toimeen ja ryhdytty mihin uuteen, yleishyödylliseen
yritykseen milloinkin.
— Mutta mitä meillä! äännähtää hän melkein kuuluvasti itsekseen.
Ei mitään! Ja koko syy on siinä, että tähän asti on ollut huonoja
toimitusmiehiä, kovin laimeita. Ei kansa itsestään ryhdy mihinkään.
Sitä täytyy pakottaa väkisellä huomaamaan se suoranainen vahinko,
minkä se tekee itselleen ja jälkeen tulevilleen laiminlyömällä monet
tuiki tärkeät ja ajan vaatimat toimenpiteet.
— Ajan vaatima, miettii hän ja toistaa vielä itsekseen sen sanan.
— Ajan vaatima! todellakin mainio sana… muistinkohan vaan käyttää
sitä puheessani sinatöörille? En tainnut muistaa, koska tuntuu
niinkuin nyt vasta sen syvä merkitys olisi iskenyt mieleeni.
Ja se sana alkaa herkeämättä soida hänen korvissaan ja lopulta on
kuin rattaan pyöräkin somerikolla maantiellä narskuttaisi samaa
sanaa, kunnes hän kirkonkylää lähestyessään laskee mäkeä alas

Ojalan sillalle, jossa pyörä vaikenee ja silloin tällöin vaan loksahtaa
epätasaisilla palkeilla, hänen ajaessaan siitä käyttöä ylitse.
— Tämäkin silta huutaa korjausta, ajattelee hän — ei riitä enää
korjauskaan, se on tehtävä uusi. Siitä on vallesmannikin jo tehnyt
muistutuksia, että se vaatisi uuden kannen, mutta tässä se yhä vaan
paikallaan huojuu, ja palkit notkuvat kuin polkuset. Eikä pidä
siitäkään kukaan huolta, ennenkun joku humahtaa hevosineen
jokeen.
Hän tulee siihen päätökseen, että silta on kiireimmän kautta
tehtävä uusi, ja sellainen, ettei sitä tarvitse paikkailla. Kivestä se on
tehtävä tai raudasta, niin kestää kautta sukupolvien, ja lastemme
lapset vielä kiittävät ja muistelevat sen tekijää. Voipihan siihen
kiviseen silta-arkkuun hakata nimet niinkuin on vanhan kirkonkin
päätyyn hakattu papin ja rakennusmestarin nimi. Ja koko tuo tie
kirkolta Vuorenpäähän, se on levennettävä ja uudestaan laitettava.
Mitähän se sinatöörikin ajatteli mokomaa polkua koluuttaessaan! Se
on kunnan yhteisesti laitettava sekin, ja minä ne laitatutan, sekä
sillan että koko tien, ne ovat laitettavat, jo ensi vuonna.
— Syksyllä ne valitsevat minut lautakunnan esimieheksi, varsinkin
nyt kun Vuorinen tämän temppunsa teki. Ja ketä täällä olisi toista
valittavaa, jollei juuri lukkaria äänestettäisi, mutta minä hommaan
hänelle muita pienempiä tehtäviä. Kokouksen otan tästä tiestä ja
sillasta heti, yhdessä kouluasian kanssa.
Ja hän jatkaa yhä mietteitään.
— Tuleehan tuon sillan ja tien laitos tosin maksamaan, sillan
varsinkin. Mutta mitä siitä! Kyllä rahaa aina löytyy kun tarvitaan.
Kaksituhatta on säästöä siltakassassa, asetetaan tie- ja siltakomitea,

ja vaikka lukkari esimieheksi siihen, hänenhän hallussaan ne jo rahat
parhaallaan ovat; pääsee niillä hyvään alkuun. Lisää kootaan
ylöskannolla. Tiehen saattaa mennä satakunta markkaa manttaalilta,
siltaan voidaan ottaa laina, sillä silta tulee kumminkin kalliimmaksi.
Hän sattui kääntämään katseensa pappilaan päin, jossa
parhaallaan nostettiin kattotuoleja uuteen päärakennukseen.
— Kas, johan pappilassa aletaan kattoa panna, tuumii hän. — Se
työ sentään menee kunnolleen kun saatiin mies toimeen, joka osaa
pitää kokouksia ja tukkia vastustajain suut. Niin, yhteinenhän se oli
meidän suunnitelmamme pastorin kanssa, mutta olisiko
helläluontoisempi mies ollut pappina, niin eipä kohoaisikaan pappilan
harja noin mahtavana kylärähjän ylitse näkyviin. On siinä mies, joka
ei hevillä hellitä, kun kerran asian ottaa ajaakseen. On häntä
kannatettava kaikella mokomin, tottapahan vastavuoron muistaa. Ja
muistaa varmaan, sitä en epäilekään…
— Niin, jos nyt menisi tien laitokseen satanen manttaalilta, palaa
hän taas äskeisiin mietteihinsä, niin mitä se manttaalimiesten
kukkarossa merkitsee! Minulta menisi viisikymmentä, koko ylöskanto
tekisi kahdeksan tuhatta ja se olisi ensi vuonna kannettava, jos asian
saisi käymään, siis minun ensimmäisenä esimiesvuotenani. Siitä
lankeaa minulle vaivoistani neljä prosenttia ylöskantoa, niinkuin
määrä on ollut tähänkin saakka. Se tekisi, tekisi, neljä kertaa
kahdeksan tekee, jaa, siitä tulisi minulle tasan kolmesataa
kaksikymmentä markkaa. Pitääpä alkaa valmistella asiaa jo täällä
miesten kanssa.
— Nooh! Hän läimäytti hevostaan ohjanperillä ja käänsi sen
maantieltä lukkarin pihatörmälle ylös.

12.
Pahat aavistukset huonosta syyskesästä toteentuivat. Loppupuoli
heinäaikaa muuttui tavattoman sateiseksi. Toinen aamu koitti yhtä
harmaana kuin toinenkin, yötä päivää tuhuutti kylmähköä vihmaa ja
toisinaan tuli vettä oikein kuuropäissä, varsinkin öillä. Hallan vaaraa
ei ollut, siitä edes sai olla huoletta niin kauvan kun sadetta kesti,
mutta yö alkoi pidetä ja märkyyttä tuli liiaksi. Kenellä vielä oli heinää
ulkona, se ruoissa markani. Eivätkä tuleentuneet viljat.
Hyvinä kesinä hankittiin tavallisesti jo Leenan päivistä rukiin
leikkuulle, mutta nyt värjötti vielä pehmeä jyvän alku kylmissään
vetisen tähkänsä sisässä, maahan painuneen oljen päässä, jonka
sadevesi oli roiskinut peltomullasta harmaaksi.
Ja sade jatkui yhä ja äityi vaan, huolimatta siitä, että maanmiehet
kävelivät alakuloisina katselemassa vainioitaan ja mätiä
heinärukojaan, toivoen hartaasti, että se jo lakkaisi. Mutta sillä ei
tuntunut olevan aijettakaan lakata. Joskus se kyllä härnäili ihmiset
kiposen kiirein huoneelta ulos, toivossa päästä töihin käsiksi, kun
taivas hetkeksi seestyi ja aurinko pilkisti vilaukselta näkyviin, mutta
samassa pudotti jo joku poistuva pilven häntä kohahtavan
vesisuihkun alas ja uusia pilviä nousi toisaalta taas peitteeksi
auringon eteen, joka tuskin oli ennättänyt saada komean
taivaankaaren näkyviin. Silloin ei muuta kuin juosta märkänä pirttiin
takaisin, ja vanhat ihmiset päättelivät, että kun noin henkäillen
sataa, niin kyllä sitä silloin riittää.
Rukiin hinta kohosi yhä ja oli kohonnut ulkomaillakin.
Viljakauppiaat ja ne kellä oli vanhaa säästöä tekivät mainioita
kauppoja. Moni varakkaampi isäntä, niiden joukossa Jussilakin,

hykerteli mielihyvästä käsiään astellessaan aitan avain kourassa,
takin kaulus pystyssä ja niska jysässä märkää pihapolkua
huoneeseensa, aprikoiden olisiko vielä paljonkin myötävää laarissa.
Ja se temppu uudistui joka päivä ja kartutti yhä kolikoita entisten
lisäksi.
Sillä ani harvoilla oli myödä. Useimmat ostivat. Ja tämä meni vielä
parhaasta päästä leiväksi, sillä harva ajatteli vielä siementä. Toivo
asuu sitkeästi ihmisessä, ja niinpä nytkin toivottiin päivästä päivään
uutisen tuleentuvan kylvöajaksi.
Vaan sitä se ei tehnyt ja silloin alkoi asia jo todellakin näyttää
arveluttavalta, ja monelle tuli hätä.
Kunnassa löytyi kyllä vanhoja, jo monena sadesyksynäkin kylvöä
tehneitä miehiä, jotka eivät tilaa pitäneet ollenkaan toivottomana,
vaan arvelivat levollisina, että "sitä on peltoon pantava, mitä pellosta
saadaan". — Se oli vanhain tapa, sanoivat he, ja onhan usein nähty
keyrirukiinkin puhaltavan olkea kuin korentoa ja terää kuin kissan
häntää. Toista on jos halla panisi, mutta eihän siitä nyt ole pelkoa.
Odotetaan vaan.
Mutta Jussila ja muut kunnanmiehet eivät kuulleet sellaista
puhetta. Tässä oli todellinen vaara tulossa ja tässä oli riennettävä
apuun niiden, jotka sen oivalsivat. Ja niinhän kehotti jo senaattorikin
kesäisessä kokouksessa, että toimikoot kunnat itse yhteisin voimin,
kun he silloin jo olivat huomanneet, että siemenen puute oli tulossa.
Nyt heidän oli pontevasti ja kiireellä toimittava, nyt heidän oli
yhteisesti hankittava viljaa muualta, sillä vaara oli todella jo ihan
kynnyksellä, näkihän sen. Heidän oli terävänäköisimpinä annettava
sille potku ulos.

Siinä oli Jussilalla taas uusi toiminta-ala, ihan etsimättä, kuin
käteen pistetty, ja muut asiat saivat hetkeksi jäädä tuonnemmaksi.
Ja hän oli varma siitä, että sinatöörikin on hyvillään, kun kuulee, että
hänen puheensa on otettu onkeen, että on edes yksi kunta, missä
osataan tulla omin neuvoin toimeen, sillä tietysti ne useimmat taas
käyvät hallituksen kimppuun niin kuin ennenkin katovuosina.
Kaikkein kernaimmin tosin olisi kunnanmiehistä jokainen auttanut
yhteistä puutetta myömällä omaa viljaansa ja siten auttanut hädästä
lähimmäisensä, pistänyt rahat omaan taskuunsa, ettei niitä olisi
tarvinnut kunnasta ulos muiden hyväksi antaa, mutta minkä sille
teki, että oma vilja loppui. Nyt oli toisella tavalla torjuttava vaara
niiden päältä, ketä se uhkasi, koska he itse eivät ymmärtäneet tikkua
ristiin panna asiansa eteen, odottelivat vaan peltojensa
tuleentumista.
Ennen Jussilaa oli kumminkin jo Mikkola ollut toimessa, vaikka
olikin hidas käänteissään. Hän oli ikänsä kaiken jyväkauppoja
hierustellut, ja oli hänellä nytkin ollut ennen ostettua halpaa viljaa
paljon, vaan se oli kaikki mennyt kaupaksi korkeasta hinnasta kuin
kuumille kiville. Se oli loppunut viimeiseen jyvään ja läjittäin oli
kertynyt seteleitä ja kovaa hopeata hänen rahalippaaseensa, jonka
sisältöä hän tavantakaa penkoi, käänteli ja laski, mielissään hyvistä
kaupoistaan.
Jyvän hakijoita tuli hänen luokseen yhä ja hänen täytyi
mielikarvaudella palauttaa ne tyhjinä takaisin. Siitä alkoi hän hautoa
uusia tuumia, mutta ei virkkanut kellekään niistä mitään. Istuskeli
vaan silmät kyynyllään, torkkuvan näköisenä kamarissaan,
kuunnellen sateen herkeämätöntä lotinaa räystäältä niinkuin
rauhoittavaa soittoa, ja aina välillä kääntäen rahaläjää lippaassaan,

mietiskellen ja laskien, miten paljon se lisääntyisi, jos sen uudestaan
rohkenisi panna liikkeelle.
Mutta hän ei rohkene tehdä sitä, kun ei tiedä, tuleentuvatko omat
laihot, vai ei. Hän on kuitenkin jo kysellyt viljaa entisiltä
liiketuttaviltaan, ja hieronut jo hiukan kauppojakin, mutta pelkää
näin epävarmoina aikoina ruveta yksin suurempiin yrityksiin. Ja
toisaalta viehättää häntä kuitenkin kauppainto. Olisi häpeä, ja ehkä
vahinkokin hänen vastaiselle liikkeelleen, jollei hän kauppa-alallaan
saisi tavalla tai toisella toimia. Hänen luottonsa vähenisi, ellei hän nyt
saisi jyväkauppaa toimeen, kun on suuria summia kysellyt. Ja se on
saatava toimeen, vaikkei siitä sitten tulisikaan voittoa mitään. Hän
hankkii yhtiömiehiä, tulkoonpa sitten vaikka tappiota, vähemmän
tulee päätä kohti, kun on useampia yhdessä, päättää hän.
Silloin muistaa hänkin senaattorin kehotuksen, jonka oli kesällä
Jussilassa kuullut, ja nyt valkenee asia hänelle kerrassaan.
Hän ajaa seuraavana pyhäaamuna lukkarin luo ja on pannut
pikaviestin Jussilalle, että hänkin saapuisi sinne. Tämä tuleekin heti
Mikkolan jälestä lukkarille ja ottaa saman asian puheeksi, josta toiset
jo hetkisen ovat kahteen kynteen keskustelleet.
Hän mainitsee ensin Mikkolalle aikoneensa piakkoin ottaa
kokouksen Vuorenpään koulusta ja parista muusta "ajan vaatimasta"
ja tuiki tarpeellisesta parannustoimesta, nimittäin Ojalan sillasta ja
heidän kylän tiestä, mutta että ne asiat täytyy lykätä vakinaiseen
kokoukseen syyskuulla, koska nyt on paljon kiireellisempi seikka
kysymyksessä, nimittäin siemenrukiin hankinta, joka tällä hetkellä
vaatii heidän tarmonsa ja valppautensa kokonaan.

Mikkolan suu on ollut aukeamassa jo siitä saakka kun Jussila tuli
huoneeseen, mutta toisen puhe on sen pitänyt puolivireessä,
päästämättä laukeamaan, vaikka hänen silmistään kyllä on kiilunut
unelias tyytyväisyys, kun hän on huomannut Jussilallakin jo olevan
asian koko tärkeyden selvillä.
Hän odottaa vaan hetkeä, milloinka tämä hengähtäisi puheessaan.
— Sitä siementä niin! Sitä on nyt välttämättä ja heti paikalla
kunnan yhteisillä varoilla ostettava, sanoo hän silloin jyrkän
päättävästi.
— Niinkö velikin luulee?
— Niin, vastaa Mikkola kireästi. — Muu ei auta nyt. Ihmispahat
eivät saa mistään siementä ja kylvö jää tekemättä. Mitä tulevana
vuonna syödään, kun makasiinikin on melkein tyhjä.
— Itsepä sen viime vuonna tyhjensit, naurahtaa Jussila leikillisesti.
— Niin kyllä teinkin, mutta teinhän minä korkeimman tarjouksen,
olihan se rehellinen kauppa. Ja mistä sitä olisi kunta silloin rahaa
saanut! Minulta sai, ja uljaana kohoaa nyt pappilan rakennus. Ei ole
tarvinnut lainoja ottaa.
— Eipä olekaan, ja veli teki hyvät kaupat, vaan eihän se kuulu
tähän asiaan mitään, tuumii Jussila.
— Nyt on tietysti hankittava uutta tilalle, kun vanhaa ei ole, mutta
kenenkä luulette täällä huolta pitävän tällaisista asioista? lisää hän
mahtavasti. — Vastustavatpa vielä koko tointa kun siitä kokouksen
otamme ja koetamme heidän parastaan valvoa, saattepa nähdä sen.

— Mutta siinä ei auta nyt vastustaminen, päättää Mikkola. Jos niin
sokeita kuntalaisten joukossa löytyy, ja ne voiton saisivat, niin
ostamme omalla uhallamme, omaksi voitoksi tai tappioksemme.
Suostutteko siihen?
Toiset suostuvat empimättä tämän jalon asian innostuttamina,
jossa näkevien oli sokeita talutettava, ja päättävät Mikkolan
kehotuksesta tilata rukiita jo etukäteen, koska ei ole enää aikaa
siekailla.
— Minulla olisi rukiita tiedossani kohtuuhinnasta, jatkaa Mikkola
matalalla, salavihkaisella äänellä. — Ja kuusisataa hehtoa niitä
ainakin pitää ottaa. Ei vähemmästä puhettakaan näin suureen
kuntaan.
— Niin, sanoo lukkari, — kyllä minä otan ne Mikkolan kanssa
hankkiakseni kunnan laskuun ja myydään ne sitten tietysti
ostohintaan. Sen verran vaan päälle, että me saamme vaivamme
korvatuiksi.
— Tietysti, vakuuttaa Jussila. Te annatte vaan laskun vaivoistanne
ja matkoistanne.
— Olisinhan minä voinut yrittää yksinänikin tätä, tehdä siitä
ahväärin, sanoo Mikkola lopuksi, mutta siitä olisi tullut liian paljon
vaivaa minulle yksityisesti, enkä olisi tahtonut näin kalliina aikana
suuria voittojakaan ihmisparoilta ottaa. Ja kuka tiesi, ehkei ne
yksityisen kädestä olisi menneet niin hyvästi kaupaksikaan.
Varmempaahan on, että kunta rahoillaan välittää koko kaupan.
— Mutta jollei menisikään kuutta sataa hehtoa kaupaksi, niin mitä
teemme lopuilla? arvelee Jussila. Eiköhän pitäisi etukäteen kysellä

paljonko kukin tarvitsee.
— Niitä tarvitaan kuusisataa, inttää Mikkola. — Mihin luulet
vähemmän riittävän? Tee kuulutus vaan, ensi pyhäksi kokous. Ja
voithan siihen lisätä, että tulkoot silloin ilmoittamaan kaikki, jotka
ovat tarpeessa. Ensi pyhäksi kokous, sillä tässä on kiire.
Ja he lähtivät miehissä kirkkoon, ja astuivat arvokkaasti kansan
lävitse, joka ei aavistanut mitään siitä erinomaisesta huolenpidosta,
joka näiden miesten mielissä oli heitä kohtaan herännyt ja tällä
hetkellä tehnyt koko heidän ulkonaisen ryhtinsäkin tavallista
vakavammaksi, kun he kaikin astuivat sakaristoon ilmoittamaan vielä
papillekin ennen kirkonmenoa tästä tärkeästä toimenpiteestä.
Hän sitten, rukoiltuaan maan kasvullisuudelle tarpeellista ilmaa ja
tultuaan kuulutuksiin, teroitti erityisesti seurakunnan mieleen sitä
koettelemusta, joka on meidän päällemme ylhäältä pantu meidän
synteimme tähden tämän liiallisen sateen muodossa, joka nykyään
uhkaa koko vuodentuloa.
— Mutta, lisäsi hän, — ettei tämä vitsaus tulisi liian suureksi ja
ulottaisi turmelevaa vaikutustaan vielä tulevaankin vuoteen, on Herra
valaissut muutamain kuntalaisten mielen huomaamaan vaaran
suuruuden ja lähimmäistensä tarpeen, ja sitten hän luki kuulutuksen
tulevana sunnuntaina pidettävästä kunnankokouksesta.
Mutta silloin törmäsi jyryytti jo suurin osa kansaa kirkosta ulos,
niin kuin tavallista kuuluutusten aikana — ja harva sai siitä mitään
tolkkua.
Eipä tullutkaan kokoukseen kunnan tuvalle seuraavana pyhänä
kuin ani harvoja pitäjän isäntämiehiä ja joitakuita leivän puutteessa

olevia mökkiläisiä, jotka olivat ymmärtäneet kuulutuksen siten, että
heille ostettaisiin kunnan yhteisillä varoilla viljaa.
Useimmat ukot ovat kirkosta astelleet vaan suoraan hevostensa
luo aitovierille ja lähteneet kotiinsa. Joku on kyllä arvellut toisille,
että "pitäisiköhän oikein mennä kuulemaan mikä niillä on meininki
kunnanmiehillä, kun nyt siemenrukiin ostoa kuuluvat hommaavan ja
viime syyssä möivät oman makasiinin säästöt puoleen nykyisistä
hinnoista jonninjoutaviin tarpeihin?"
Mutta kun toiset taas ovat päätelleet, että "mitä turhista toimista,
odotetaan omaa uutista vaan", niin ei ole viitsitty mennä
kurkistamaan koko ruiskokoukseen. On päätetty vaan, että "eiväthän
toki niin hulluja ole, että meille pyytämättämme viljaa ostavat".
Jussila istuu pöytänsä takana kirjat levällään, katsellen ikkunasta
ulos, että eikö niitä kuulukaan tarvitsevia tämän enempää.
Vaan niitä ei kuulu.
— Senkö verran ne omaa etuaan ymmärtävät, päättää hän, kun
on tarpeekseen odottanut.
— Olisivat nyt tulleet edes vastustamaan niin kuin aina
muulloinkin, kun heidän etuaan on koetettu valvoa, naurahtaa hän
lukkariin kääntyen.
— Aletaan kokous vaan, onhan se laillisesti ilmoitettu, päättää
lukkari.
Jussila lukee kovalla äänellä viime sunnuntaisen kuulutuksen tästä
kokouksesta, jota asian kiireellisyyden vuoksi ei ole ennätetty

kahdesti julkaista, ja lausuu loppuun päästyään erityisellä painolla
alla olevan nimensä.
— Sellainen on selvä kuulutus, sanoo hän. — Onko kellään mitään
lausuttavaa siihen?
— Tarvinneeko tällaista kokousta pitää ollenkaan, epäilee muuan
miehistä, Paukolan isäntä. — Ennättää sitä siementä vielä omastakin
pellostaan saamaan.
— Mitä me kunnan rahoilla viljaa ostamaan, ellei menisikään
kaupaksi.
Kyllä Paukola on oikeassa, arvelee eräs toinen kokoukseen
saapuneista.
— Ja kuinka sitä tietää mennä ostamaan, kun ei ole kukaan
pyytänytkään.
— No tännehän on juuri kehotettu saapumaan kaikkia, jotka ovat
siemenen tarpeessa. Syyttäkööt itseään kun eivät ole tulleet, päättää
Jussila.
— Mutta ehkeivät ne tarvitsekaan.
— Tarvitsevat kylläkin.
— Onhan täällä muutamia. Paljonko luulette tarvitsevanne te?
kysyy lukkari.
— En jyvääkään minä, vastaa Paukola, — kylvän omilla.
— Onko vanhoja säästössä vielä? kysyy Jussila.
— Ei ole, mutta uusia tulee kun ennättää.

— Sitte on sama vaikka kylvätte hiekkaa peltoonne, naurahtaa
Jussila, ja samaa mieltä ovat lukkari ja Mikkolakin.
— Omahan se on asiani.
— Eikö nämä toiset miehet ole tarpeessa? kysäsee Mikkola hiukan
hämmentyneen näköisenä.
— Eipä tiedä. Voisihan tuota vähän ottaa, kun tietäisi hyviä
saavansa.
— Hyviä tulee. Parasta Waasan ruista, raskasta ja itävää, menneen
vuoden satoa, vastaa Mikkola tavallista kiireemmin.
— Merkitse Kukkonen paperille sinä, paljonko nämä miehet
ottaisivat, komentaa Jussila.
Lukkari tekee työtä käskettyä, mutta paljonko ne muutamat
miehet tarvitsevat!
— Ei oteta ollenkaan, iskee Paukola vastaan.
— Mutta otetaan, väittää Mikkola. Kuusisataa hehtoa otetaan,
minä tiedän että se määrä makeasti tarvitaan.
— Mitä hullua te tuumaatte? Eihän tässä ole pyytäjiä kuin
muutamaan hehtoon, ja te kuutta sataa…
— Kyllä ne vielä ovat tarpeen, ennen kuin kylvö on tehty. Hätäpä
taitaisi tulla monelle, ellei nyt otettaisi, päättelee Jussila miehineen.
Paukola ja pari muuta miestä lyövät yhä ankarasti vastaan, mutta
he ovat vähemmistönä, ja rukiita päätetään ottaa kunnan laskuun
kuusisataa hehtolia "yksimielisesti", niin kuin Jussila kirjoittaa

pöytäkirjaan. Mikkola ja lukkari valtuutetaan hankkimaan ne
kiireimmän kautta.
Pöytäkirja on lyhyt ja selvä ja Jussila lukee sen hätäisesti lävitse.
— Tämä on kiireellisyyden vuoksi allekirjoitettava tässä samassa
tilaisuudessa, sanoo hän.
— Jassoo, että Mikkola ja kanttori saavat siis kunnalta vallan ostaa
ja kunta vaan menee niinkuin takuuseen heille. Jaaha, se onkin
vallan eri asia! puhukselee hiljalleen Paukola, joka on jollain tavoin
väärin ymmärtänyt pöytäkirjan ja niukan nolostuneena luulee
käsittäneensä väärin koko asian alusta pitäen.
— No, ovathan ne kunnan varakkaimpia miehiä, kuiskaa hän
toisiin kääntyen. Johan minä aattelinkin, että mitä se sellainen
homma. Kun ostavat niin ostakoot, tottapa asiansa tietävät! Tottapa
tietävät, sano!
— Niin, sellainen nyt on päätös kuin kuulitte, sanoo Jussila. —
Pankaapa, Paukola, tuohon puumerkkinne, kehottaa hän Paukolaa.
— Kyllähän minä sitten puumerkkini, mihinkä kohti se tähän
piirretään?
— Tuohon! osoittaa Jussila.
— Kyllähän minä sitten, sano! myönnyttelee Paukola, joka ei oikein
näy ymmärtävän mitä sana "valtuuttaa" merkitsee.
— Mutta kyllä he siinä kaupassa häviävät, takkiinsa saavat kuin
saavatkin, sillä mihinkä se sellainen jyväin paljous kauppansa tekee,

naurahtelee hän sivummalle tultuaan. — Vaan onhan se heidän oma
asiansa, kutenma jo sanoin, ja ovatpa tainneet aikoinaan voittaakin.
Mutta Mikkola mutistelee suutaan ja hykertelee käsiään,
astuessaan valtakirja taskussa lukkarin kanssa kunnanhuoneen
pihalle.
— Milloinkahan arvaisitte saavan sitä siementä? Pitäisi kohdakkoin
aloitella kylvöä, kysäsee pihalla eräs niistä, jotka ovat ilmoittaneet
ottavansa.
— Hm! Tuotanoin, niitä olisi alku siellä meillä nyt jo, vastaa
Mikkola matalalla äänellä, aivan kuin olisi tahtonut peitellä asiaa.
Ja kun kysyjä katselee häneen kummastuneen näköisenä, lisää
hän selitykseksi, että he kiireellisen tarpeen vuoksi hankkivat niitä
osan jo etukäteen.
Vallan vähän meni näitä kunnan rukiita kaupaksi, sillä ne olivat
äärettömän kalliita, roskaisia, ja suureksi osaksi huonosti itäviäkin.
Mitä lienee ollut Itämeren takaista, tuulikuivaa kesäruista.
Mutta useimmat odottivat oman peltonsa tuleentumista ja kylvivät
siitä saamallaan, huolimatta myöhäisestä ajasta. Ne olivat
enimmäkseen juurevia, kokeneita ukkoja ne, jotka eivät ensi
hopussa hätääntyneet, vaan luottivat vanhoihin kokemuksiinsa,
antaen niiden parhaansa mukaan intoilla ja touhuta, jotka jo luulivat
koko maan menestyksen olevan vaarassa.
Ja siihen jäivät Jussila ja kumppanit jyvineen ötköttämään. Niitä oli
Mikkolan ja lukkarin aitat täynnä, ettei ollut mihin omia panna.

Mutta olihan heillä selvä paperi taskussa, virheetön ja luja. Olihan
heillä laillisen kunnankokouksen kumoamaton päätös. Jyvät olivat
kunnan, tallettakoon omansa. Puhdas oli heidän tuntonsa, sillä
olivathan he parastaan koettaneet ihmisten hädän lieventämiseksi, ja
oliko se heidän syynsä, etteivät nämä tarjottua apua ottaneet, vaan
enemmin saattoivat itselleen tulevaksi vuodeksi kadon.
Niin päättelivät he ja ajattivat rukiit pitemmittä mutkitta kunnan
makasiiniin, romahuttivat siellä laariin vaan, ja kyllä sinne mahtui,
kun ei ollut entistä tiellä. Ja sinne ne jäivät, eikä suuri osa
kuntalaisista tiennyt ollenkaan, että he nyt olivat niin rikkaita viljasta.
13.
Tällaiset olivat ne kaksi välinäytöstä, jotka kesän kuluessa olivat
kunnallisten asiain jokapäiväisen menon oheen sattuneet. Varsinkin
jälkimmäisestä olivat Jussila ja hänen miehensä erittäin hyvillään,
kun olivat edes yhdessä asiassa ilman suurempaa vastustusta
saaneet tahtonsa perille.
Erittäinkin Mikkolan huulilla asui koko syyskauden muhoileva,
hiljainen tyytyväisyys. Hän oli saanut olla välittäjänä näin mainiossa
kaupassa, tehnyt sen niin kuin omissa nimissään vallan, ja maksanut
puhtaasti, käteisellä rahalla. Eikö siitä ollut hänelle suuri hyöty
vastaisten kauppojen varalle! Nimi kelpaa paperiin mihin tahansa,
luotto on kohonnut aika askelen!
Vaan tämän asian onnistumisesta olisi sen toimeenpanijain
oikeastaan tullut kiittää etupäässä sen pikaista toimeenpanoa ja

harvinaista laatua.
Vakinaisessa kuntakokouksessa syyskuulla tulee toisellaisia asioita
esille. Ne tunnetaan ja ne ovat kirkossa julaistavat jo kolmea viikkoa
ennen. Ja siksipä onkin Jussila ja hänen kannattajansa olleet pyrynä
liikkeessä, sillä asioita on paljon nyt ja kaikki ne ovat tähän samaan
kokoukseen lykkäytyneet.
Paitsi kunnallisia vaaleja, sattuu tähän samaan kokoukseen vielä
sellainenkin merkkitapaus, että siinä valitaan valtiopäivämiehen
valitsijat, niinkuin edustuslaitoksemme mutkikas kokoonpano meillä
joka kolmas vuosi vaatii. Ja siinä on seikka, joka kaiken muun
ohessa on alkanut pyöriä Jussilan päässä ja täyttää hänen
aivokamarinsa miltei kokonaan.
Hän tietää, että on syntynyt eri mieliä entisen edusmiehen
suhteen, joka on talonpoikain mielestä liian suurellisella
käytöksellään hiukan asiaansa pilannut. Hän tietää ja sisimmässään
myöskin tuntee olevansa ainoa omassa kunnassaan, joka jo on kyllin
kypsynyt ja täysin pätevä edustamaan koko tuomiokuntaa.
— Saadapa vaan oman pitäjän äänet kaikki, niin ei muuta
tarvitsisikaan, ajattelee hän.
Hän tuntee äänisuhteet, kun on itsekin ollut valitsemassa kerran.
Kahdeksan ääntä on omalla kunnalla, naapureilla vaan seitsemän, ja
kumminkin on naapurikunta aina saanut oman miehensä säätyyn
istumaan, se kun on päässyt ylhäisten tuttavuuteen ja ne hänet aina
ovat sanomalehdissä ehdokkaaksi asettaneet ja siten heidänkin
kunnan ääniä viekoitelleet. Jo se on häpeä, ettei heidän
suuremmassa seurakunnassa olisi miestä! Mutta annahan olla,
päättää hän rohkeana, ja alkaa laskea miehiä. Mikkola, kanttori,

Isonen, siinä kohta kolme, joista voi olla varma. Ja Perttula sitten,
joka vastikään talonsa hänelle intekkiin pani. Oo, kyllä niitä karttuu
miehiä, kunhan vaan se Kartano väkäleuka ei kääntäisi päitä. On
tässä todellakin asia, jonka eteen kannattaa jotain uhrata, uhrata
kaikki, päättelee hän itsekseen.
— Ja pastori, häneen on turvauttava myös, vaikkei hän itse
äänestämään kelpaakaan.
Lautakunnan esimiehyys, jonka hän varmaakin varmemmasti
tietää saavansa, on Jussilan mielestä pikku seikka tämän toisen asian
rinnalla, ja pieniä ne oikeastaan ovat kaikki muutkin hommat, mutta
toimia täytyy siltä niissäkin, ja kiivaammin juuri tällä hetkellä kuin
milloinkaan, että maine leviäisi, että tulisi kuuluksi kunnallisten asiain
innokkaana ja kokeneena ajajana, niinkuin hän aina on nähnyt
valtiopäivämiesehdokkaista mainittavan sanomissa. Jota enemmän
kokouspäivä lähenee, sitä korkeammalle nousee innostus. Ajetaan
kylästä kylään, rasvataan rattaan pyöriä, eikä säästetä hevosia. Ja
sitä ei katsota olisiko aikaa tai ei, asiat ovat siksi tärkeitä, että omat
toimet siinä saavat syrjäytyä. Kun tiedetään, että kuka tahansa, kellä
vaan niin paljon ääniä olisi, saa joko itse puolestaan tai valtakirjoilla
äänestää kuudennen osan koko kokouksen äänimäärästä, niin
koetetaan etupäässä saada valtakirjoja suuriäänisiltä. "Meidän täytyy
akiteerata", on Jussila sanonut, kun on pidetty pientä suljettua
neuvottelua siinä parisen viikkoa ennen varsinaista kokousta. Minun
ei sovi itseni äänestää, on hän sanonut, mutta jos teistä neljäkin
miestä voisi kokouksessa lyödä kuudennen osan pöytään kukin, niin
hätääkö silloin. Ja Mikkolahan äänestää jo omastakin puolestaan
viidelläkymmenellä, eikä sinne toki koko kunta äänestämään saavu.

Niin on päätetty ja kylillä ajaessa tähän tapaan asiaa isäntäin
kanssa aloiteltu:
— Mitä te sinne kokoukseen suotta, ei siellä hyvinkään tärkeitä
asioita tule kysymykseen, ja mitä sinne joka mies näin kiireisellä
ajalla. Satuin tästä kulkemaan ohitse muilla asioilla, niin poikkesin
taloon. Niin, niinhän se juuri on kuin isäntäkin sanoo, näin riihen
kuivuun aikana, mutta kun se nyt kokous on lain mukaan syyskuulla
pidettävä, ja ainahan tuota on maamiehellä kiirettä, aina sitä on. Niin
niin! No Jussilahan se hommaa koulua Vuorenpäähän, se siellä
pääasia tulevassa kokouksessa onkin. Mitähän tuon kanssa
tehtänee? Jaa, vai niin, isäntä tuumi. — No, onhan sekin totta,
onhan niitä menoja nykyaikana, mutta tulee se vielä aika, että ruunu
panee pakosta rakentamaan ja jos sattuu silloin kalliimmat ajat, niin.
Jaa, jaa, onhan se sitäkin, mutta pitäähän meidän toki
jälkeläistemmekin etua katsoa, varsinkin kun Jussila vielä on
luvannut ilmaisen maan ja viisikymmentä hirttä, jos heti riidatta
rakennetaan.
— Vai on luvannut, tuumii puhuteltu.
— Luvannut on, ja se on iso apu jo sekin. Ei siitä suurtakaan kulua
kunnalle tule. Jollette viitsi sinne itse lähteä, niin pistetään tässä
valtakirja. Mitäs isäntä suotta tuollaista pikku asiaa saivartelee,
varojahan teillä on kyllä.
— Eipä liikoja, ei liikoja yhtään. Nipin napin oma tarve. Vaan
enhän minä sinne taida viitsiä ajaa, tehkööt kunnanmiehet mitä
tahtovat. Eikä tässä olisi aikaakaan, kun on tuo riihen kuivuu. Kuinka
teillä rukiita karttuu?
— Huononpuoleisesti, ja imeltyä tahtovat riihessä.

— Leikkasitte liian aikaiseen, tai ehkä huonosti kuivaatte. Ei meillä
imelly. Niillä kylvinkin, ja hyvästi iti.
— Vai hyvin iti, hm! Kunhan vaan ehtii tarpeeksi orastua, hm!
— Kyllä ehtii, vaikka vielä nytkin kylväisin. Turhaa hölyä kuuluivat
pitäneen.
— No eiköhän tehdä sentään valtakirjaa, minä kun kumminkin
menen muissakin asioissa silloin kirkolle ja kokoukseen, niin
äänestäisin isännänkin puolesta.
— Niin, mitä tuo nyt olisi. Hyvää viljaa siitä tulee lopultakin tänä
vuonna, mutta on tarkasti kuivattava niinkuinma sen sanoin. Minä en
usko muille riihiäni, itse lämmitän.
Ja isäntä, jonka ajatus askartelee kokonaan riihessä, alkaa jo tulla
levottomaksi, kun vieras viivyttelee eikä näytä lähtöä hankkivankaan,
istuu vaan niin kuin ei olisi kiireen kierää. Ja hänen pitäisi nytkin
juuri lähteä ahdosta kohentelemaan ja heittämään pölkkyä uuniin.
Hän on juuri vähää ennen vieraan tuloa saanut valmiiksi uuden,
suippokärkisen seipään, jonka oikein höylällä on silitellyt, että hyvästi
menisi hikisten sitomien väliin. Sillä hän aikoo työntää reikiä
ahdokseen ja valuttaa hikilöylyä alas, aivan jo syyhytti kämmentä
päästä koettamaan sitä, vaan eihän tuolta toiselta päässyt.
— No pistetään nyt valtakirja, hokee toinen. Tai minulla onkin
täällä valmis taskussani, pistätte puumerkkinne vaan.
— Vai jo aivan valmis. Mikä teillä sellainen hätä sen asian kanssa?
Kuinka tiesitte minun varalleni jo valmiiksi tehdä? Mutta eihän tässä
ole kirjoitusverstaitakaan, kun en minä niitä ole tottunut pitelemään.

— On minulla mukanani, aina ne ovat taskussani, kun niitä
yhtenään tarvitsen. No niin, tässä menee sitten kaikki muutkin asiat,
mitä siellä tulee kysymykseen. Ne toiset eivät ole juuri suuren
arvoisia.
— Päätetäänkö siellä muistakin asioista? Kyllähän olin kirkossa
minäkin viime pyhänä, mutta eihän vanha mies niistä kaikista saa
tolkkua.
— Onhan se patistanut kuvernööri sakon uhalla korjaamaan Ojalan
siltaa ja samalla korjattaisiin hiukan Vuorenpään kylätietäkin. Sitten
valitaan siellä taas kunnanmiehiä entisten tilalle, joiden määrävuodet
nyt loppuvat.
— Mikseikä vanhat kelpaa, kun niitä yhä uusitaan?
— Lakipa määrää aina uudet vaalit, vaan ei niissä siltä tarvitse
miestä muuttaa.
— Vai on siinäkin laki.
— On, ja kova. Ja sitten määrätään siellä valtiopäivämiehen
valitsijat.
— Vai jo nekin taas ovat tulossa. Vaan mitäpä minä vanha mies
tuosta välitän ken siellä istuu. Tottapahan viisaammat tietävät kenen
asettavat. Josma häntä nyt sitten vedän puumerkkini.
— Mutta ei huoli isäntä puhua, että minulle valtakirjan annoitte,
siitä tulisi vaan turhia, ennenaikaisia löpinöitä.
Vetämällä puumerkkinsä valtakirjaan toisen osoittamaan paikkaan,
sai ukko vieraan lähtemään, ja oli hyvillään kovin, että vihdoinkin

pääsi kohentelemaan ahdostaan riihessä, joka hänestä sillä hetkellä
oli paljoa tärkeämpi asia kuin mitkään koulut tai valtiopäivät.
* * * * *
Kun kokouksessa sitten kaikki valtakirjat vedetään esiin, päättyvät
kysymykset, ankarasta vastarinnasta huolimatta aivan niin kuin oli
aijottukin.
Koulua päätetään ruveta paikalla rakentamaan Vuorenpäähän, ja
siihen valitaan eri toimikunta, Jussila esimiehenä. Kylätie
Vuorenpäästä kirkolle päätetään levittää ja panna koko kunnan
yhteiseen tiejakoon, ja senkin toimen valvominen uskotaan Jussilan
huostaan. Mutta Ojalan siltaa varten asetetaan ihan eri komitea,
lukkari päämiehenä, ottamaan heti ensi tilassa selkoa siitä, eikö olisi
parasta rakentaa siltaa kokonaan raudasta ja kivestä, ja sitten
laatimaan siitä kustannuslaskua.
Kaikki vaalit käyvät myöskin toivomuksen mukaan.
Jussila on tullut valituksi kunnallislautakunnan esimieheksi, jonka
palkkaa hänen omasta esityksestään on melkoisesti ylennetty. Ja
valtiopäivämiehen valitsijoiksi on tullut juuri samat miehet, joita hän
oli tarkoittanutkin.
Hän on ylen tyytyväinen kokouksen tuloksiin, huolimatta siitä, että
pääluvultaan suurin osa kokouksessa olijoita, Kartanon ukko
etupäässä, on vaatinut pöytäkirjan otetta ja luvannut valittaa
kuvernööriin, koska tällä tavalla muka karttuu yhtäaikaa aivan liikoja
ja tarpeettomia rasituksia kunnalle.

Moni katuu jo, että on puumerkkinsä antanut, ja aavistaa pahaa,
kuultuaan kokouksen päätökset, mutta ei sovi enää valittajiinkaan
yhtyä.
Eikä siinä valitus mitään auttanutkaan, sillä kuvernööri vahvisti
kokouksen päätökset, ja jo ennen rekikelin tuloa aletaan tulisella
kiireellä rakentaa koulua, sillä sen pitää välttämättä olla ensi kesään
valmiin, niin on päätetty.
Ja Jussila riennättää työtä.
Hänet on vastikään nähty antavan ohjeitaan koulun perustuksen
laskijoille ja osoittelevan kepillään mihin mikin kivi parhaiten soveltuu
— ja melkein samalla hetkellä ajaa hän jo taas, pyylevänä
kiessirattaillaan istuen aika vauhtia nummelle, mistä tien laittajain
panokset paukahtelevat häntä vastaan niin kuin kunnialaukaukset,
kun he siellä särkevät kiviä maantien sivusta pois.
Siihen hän seisattaa hetkeksi ja antaa rattailla istuen ja hevostaan
pidätellen työnjohtajalle ohjeita, mutta kohta ei hänestä taas nähdä
muuta kuin leveä selkä matkan päässä ja sivulle pöllähtelevä sikaarin
savu, kun hän jatkaa matkaansa ja katoo ensimmäisen tienmutkan
taa.
Hänen on ennätettävä kirkolle, Ojalan sillalle, katsomaan mitenkä
lukkarin tuottamat insinöörit mittailevat vettä ja tutkivat joen pohjaa
ja tekevät laskujaan vastaisesta rautasillasta.
Ja sitten on hänen ajettava uuteen pappilaan, johon apulaispappi
on väliaikaisesti muuttanut asumaan, kun hänen omassa
asunnossaan tehdään kunnan toimesta korjauksia. Siellä keskustelee
hän papin kanssa uudesta koulusta, sen hoidosta ja järjestyksestä,

ja pitää vireillä papin salaista toivoa, ettei hänen enää tarvitsisi
ollenkaan muuttaa takaisin vanhaan ahtaaseen asuntoonsa, vaan
saisi kirkkoherrana asettua ainaiseksi isännäksi siihen uuteen,
komeaan taloon.
Valittaen sitä ääretöntä huolta ja kiirettä, mikä hänellä on näissä
kunnan suurissa puuhissa, rientää Jussila pappilasta kotiin taas,
mutta jo seuraavana päivänä tekee hän saman kierroksen
uudestaan.
Kaikkien näitten matkainsa ja hommiensa ohessa kytee hänessä
aina yksi pohjamiete, tai niinkuin mahtava pohjasävel, jonka
ympärillä muut ajatukset kiertyvät vaan hiljaiseksi hyminäksi. Ja se
on tuleva valtiopäivämiehen vaali. Sen suhteen on hän levoton ja
tulee yhä levottomammaksi, jota enemmän vaalihetki lähenee, sillä
hän on saanut syytä epäillä parin vaalimiehensä kantaa, vaikka hän
niitä alussa piti täydelleen luotettavina. Hän on kuullut huhuja, että
ne ovat hänestä pahoja puheita lasketelleet, ja epäilee Kartanon
salaisesti toimivan hänen vahingokseen. Hän huomaa, että koko
puuha on ollut liian kiireellistä, sillä hänen olisi pitänyt kietoa miehet
itseensä niin kuin pikeen, josta ne eivät olisi ensi nykäisyllä
irtautuneet. Mutta eihän hän ole ennättänyt sitä tekemään, eikä ole
asiaa ennemmin oikein pohjia myöten ajatellutkaan.
Sanomalehdissä, joita hän nykyään entistä suuremmalla innolla
tutkii, on hän jo nähnyt asetetun ehdokkaita miltei kaikista
tuomiokunnista, ja muutamista useampiakin. Kuka kiittää yhtä, ken
toista, ja heidän etevämmyydestään on jo paikoin syntynyt riitojakin.
Vihdoin on omastakin tuomiokunnasta joku ehdottanut entistä
edustajaa, ja sen nähtyään saa Jussila ahtaan tunteen sydänalaan,

Welcome to our website – the perfect destination for book lovers and
knowledge seekers. We believe that every book holds a new world,
offering opportunities for learning, discovery, and personal growth.
That’s why we are dedicated to bringing you a diverse collection of
books, ranging from classic literature and specialized publications to
self-development guides and children's books.
More than just a book-buying platform, we strive to be a bridge
connecting you with timeless cultural and intellectual values. With an
elegant, user-friendly interface and a smart search system, you can
quickly find the books that best suit your interests. Additionally,
our special promotions and home delivery services help you save time
and fully enjoy the joy of reading.
Join us on a journey of knowledge exploration, passion nurturing, and
personal growth every day!
ebookbell.com

Mycobacteria Protocols 4th Tanya Parish Anuradha Kumar

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Mycobacteria Protocols 4th Tanya Parish Anuradha Kumar

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 18

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Slide 66

Slide 67

Slide 68

Slide 69

Slide 70

Slide 71

Slide 72

Slide 73

Slide 74

Slide 75

Slide 76

Slide 77

Slide 78