Myocardial Tissue Engineering 1st Edition Tatsuya Shimizu

Visit https://ebookultra.com to download the full version and
explore more ebooks
Myocardial Tissue Engineering 1st Edition
Tatsuya Shimizu
_____ Click the link below to download _____
https://ebookultra.com/download/myocardial-tissue-
engineering-1st-edition-tatsuya-shimizu/
Explore and download more ebooks at ebookultra.com

Here are some suggested products you might be interested in.
Click the link to download
Advances In Tissue Engineering 1st Edition Julia Polak
https://ebookultra.com/download/advances-in-tissue-engineering-1st-
edition-julia-polak/
Shimizu s dermatology Second Edition. Edition Hiroshi
Shimizu
https://ebookultra.com/download/shimizu-s-dermatology-second-edition-
edition-hiroshi-shimizu/
Bone Regeneration Growth Factors Augmentation Procedures
and Tissue Engineering Applications Growth Factors
Augmentation Procedures and Tissue Engineering
Applications 1st Edition Vincent Legard https://ebookultra.com/download/bone-regeneration-growth-factors-
augmentation-procedures-and-tissue-engineering-applications-growth-
factors-augmentation-procedures-and-tissue-engineering-
applications-1st-edition-vincent-legard/
Tissue Engineering Fundamentals and Applications 1st
Edition Yoshito Ikada (Eds.)
https://ebookultra.com/download/tissue-engineering-fundamentals-and-
applications-1st-edition-yoshito-ikada-eds/

Tissue Engineering Principles and Practices 1st Edition
John P. Fisher (Editor)
https://ebookultra.com/download/tissue-engineering-principles-and-
practices-1st-edition-john-p-fisher-editor/
Orthopedic Tissue Engineering Basic Science and Practice
1st Edition Victor M. Goldberg
https://ebookultra.com/download/orthopedic-tissue-engineering-basic-
science-and-practice-1st-edition-victor-m-goldberg/
Tissue Engineering and Regenerative Medicine A Nano
Approach 1st Edition Murugan Ramalingam
https://ebookultra.com/download/tissue-engineering-and-regenerative-
medicine-a-nano-approach-1st-edition-murugan-ramalingam/
Orthodontically Driven Corticotomy Tissue Engineering to
Enhance Orthodontic and Multidisciplinary Treatment 1st
Edition Federico Brugnami
https://ebookultra.com/download/orthodontically-driven-corticotomy-
tissue-engineering-to-enhance-orthodontic-and-multidisciplinary-
treatment-1st-edition-federico-brugnami/
Primary Angioplasty Mechanical Interventions for Acute
Myocardial Infarction 1st Edition David Antoniucci
https://ebookultra.com/download/primary-angioplasty-mechanical-
interventions-for-acute-myocardial-infarction-1st-edition-david-
antoniucci/

Myocardial Tissue Engineering 1st Edition Tatsuya
Shimizu Digital Instant Download
Author(s): Tatsuya Shimizu, Katsuhisa Matsuura
ISBN(s): 9789814411318, 9814411310
Edition: 1
File Details: PDF, 7.11 MB
Year: 2014
Language: english

Shimizu | Matsuura
Myocardial Tissue Engineering
Regenerative therapy has rapidly developed as one of the most promising treatments for
patients suffering from severe heart failure. Autologous bone marrow–derived cells and
cardiac stem cells have been clinically applied for cell injection therapy for heart failure. As
a next-generation therapy, tissue-engineered myocardial-patch transplantation has also been
started clinically. As further advanced therapy, several researchers have started to fabricate
three-dimensional beating myocardial tissues. One of the main problems in myocardial tissue
engineering is neovascularization within the tissues during scale-up. Several innovative
technologies have been developed to overcome the vascularization problem.
This book broadly summarizes myocardial tissue engineering and regenerative medicine,
which consists of myocardial cell sources, cell therapy for damaged hearts, and tissue
engineering technologies for fabricating beating hearts. With respect to myocardial cell
source, it focuses on cardiac cells differentiated from embryonic stem and induced pluripotent
stem cells. It describes the remarkable results obtained in the past and the present to control
neovascularization and presents the future challenges in myocardial tissue engineering
research.

Tatsuya Shimizu is a professor at the Institute of Advanced Biomedical
Engineering and Science (ABMES), Tokyo Women’s Medical University,
Japan. He received his PhD in medicine from Tokyo University, Japan. His
areas of expertise are myocardial tissue engineering based on cell sheet
technology, neovascularization in myocardial tissue grafts for scaling-
up, and tissue factory fabrication for industrialization of regenerative
medicine. He has 96 publications to his credit. He has received the Takagi
Award, Intelligent Materials and Systems Forum (2001); best poster award,
5th International Meeting of Tissue Engineering Society (2002); Young
Investigator’s Award, the Japanese Circulation Society (2002); The 2003
award of the Medical Association of Tokyo Women’s Medical University;
Best Oral communication Award, Annual TERMIS-EU Meeting (2006); The
Award of Cardiovascular Regenerative Medicine, the Japanese Circulation
Society (2007); The Commendation for Science and Technology by the
Minister of Education, Culture, Sports, Science and Technology (Research
Category) (2009); The 7th Monozukuri cooperation Award, Nikkan Kogyo
Shimbun Ltd. (2012); and Japan Heart Foundation Satoh Memorial Award,
The Japanese Circulation Society (2014). His current research interests are
vascularization and heart engineering.
Katsuhisa Matsuura is an associate professor at ABMES, and Department
of Cardiology, Tokyo Women’s Medical University. He received his PhD in
medicine from Tokyo Women’s Medical University. His areas of expertise are
cardiology, regenerative medicine, stem cell biology for scale-up and tissue
engineering. He has received Young Investigator’s Award, The Japanese
Circulation Society (2005); Inoue Memorial Foundation Research Award,
Inoue Research Foundation (2007); Yamakawa Hisako Research Award,
Tokyo Women’s Medical University (2008); and poster award, Molecular
Cardiovascular Conference (2007 and 2008). His current research interests
are stem cell expansion biology and technology and cellular sociology in
bioengineered tissue.
Myocardial Tissue
Engineering
edited by
Tatsuya Shimizu | Katsuhisa Matsuura
ISBN 978-981-4411-31-8
V348

Myocardial Tissue
Engineering

for the World
Wind Power
The Rise of Modern Wind Energy
Preben Maegaard
Anna Krenz
Wolfgang Palz
editors
Pan Stanford Series on Renewable Energy — Volume 2
Myocardial Tissue
Engineering
edited by
Tatsuya Shimizu
Katsuhisa Matsuura

CRC Press
Taylor & Francis Group
6000 Broken Sound Parkway NW, Suite 300
Boca Raton, FL 33487-2742
© 2013 by Taylor & Francis Group, LLC
CRC Press is an imprint of Taylor & Francis Group, an Informa business
No claim to original U.S. Government works
Version Date: 20150122
International Standard Book Number-13: 978-981-4411-32-5 (eBook - PDF)
This book contains information obtained from authentic and highly regarded sources. Reason-
able efforts have been made to publish reliable data and information, but the author and publisher
cannot assume responsibility for the validity of all materials or the consequences of their use. The
authors and publishers have attempted to trace the copyright holders of all material reproduced in
this publication and apologize to copyright holders if permission to publish in this form has not
been obtained. If any copyright material has not been acknowledged please write and let us know so
we may rectify in any future reprint.
Except as permitted under U.S. Copyright Law, no part of this book may be reprinted, reproduced,
transmitted, or utilized in any form by any electronic, mechanical, or other means, now known or
hereafter invented, including photocopying, microfilming, and recording, or in any information
storage or retrieval system, without written permission from the publishers.
For permission to photocopy or use material electronically from this work, please access www.
copyright.com (http://www.copyright.com/) or contact the Copyright Clearance Center, Inc.
(CCC), 222 Rosewood Drive, Danvers, MA 01923, 978-750-8400. CCC is a not-for-profit organiza-
tion that provides licenses and registration for a variety of users. For organizations that have been
granted a photocopy license by the CCC, a separate system of payment has been arranged.
Trademark Notice: Product or corporate names may be trademarks or registered trademarks, and
are used only for identification and explanation without intent to infringe.
Visit the Taylor & Francis Web site at
http://www.taylorandfrancis.com
and the CRC Press Web site at
http://www.crcpress.com

Contents
Preface xi
1. Introduction 1
Yuji Haraguchi, Katsuhisa Matsuura, and Tatsuya Shimizu
2a. Variety of Cell Sources 17
Katsuhisa Matsuura
2a.1 Introduction 17
2a.2 Paracrine Effects 18
2a.3 Bone Marrow Mononuclear Cells/Peripheral
Blood Mononuclear Cells/Endothelial
Progenitor Cells 18
2a.4 Mesenchymal Stem Cells 22
2a.5 Skeletal Myoblasts 23
2a.6 Cardiac Stem/Progenitor Cells 24
2a.7 ES Cells/iPS Cells 26
2a.8 Conclusion 27
2b. Cardiomyocyte Differentiation from Stem Cells 33
Shinako Masuda
2b.1 Introduction 33
2b.2 The TGFβ Superfamily in Cardiac
Differentiation 36
2b.3 The Wnt Signaling Pathway in Cardiac Differentiation
39
2b.4 FGF Signaling in Cardiac Differentiation 42
2b.5 Other Factors Involved in Cardiac Differentiation
43
2c. The Technologies for Stem Cell Expansion and Differentiation
55
Daisuke Sasaki
2c.1 Introduction 55

vi Contents
2c.2 Expansion of Undifferentiated Human
ESCs/iPSCs 56
2c.3 Induction of Cardiac Differentiation 60
2c.4 Enrichment of Cardiomyocytes 63
3. Cell Therapy for Myocardial Infarction in Clinical Trials 71
Stefano Pietronave and Dehua Chang
3.1 Introduction 71
3.2 Safety and Feasibility of Cell Transplantation 72
3.3 Route of Administration 76
3.3.1 Systemic Intravenous Infusion 76
3.3.2 Intracoronary Cell Infusion 76
3.3.3 Intracardiac Injection 76
3.4 Functional Results 77
3.5 Proposed Mechanisms 79
3.6 Problems and Answers 79
3.7 Summary and Conclusions 82
4a. Scaffold-Based Tissue Engineering 89
Soichi Takagi
4a.1 Introduction 89
4a.2 Natural Hydrogels 90
4a.2.1 Collagen 90
4a.2.2 Gelatin 91
4a.2.3 Fibrin 91
4a.2.4 Alginate 92
4a.2.5 Hyaluronic Acid 92
4a.3 Synthetic Hydrogels 92
4a.3.1 Poly(Ethylene Glycol) 93
4a.3.2 Poly(Glycolic Acid) 93
4a.3.3 Poly(Lactic Acid) 93
4a.3.4 Poly(Vinyl Alcohol) 94
4a.3.5 Poly(Lactic-co-Glycolic Acid) 94
4a.4 Decellularized Tissues and Organs 95
4a.4.1 Enzymatic Methods 95
4a.4.2 Chemical Methods 96
4a.4.3 Physical Methods 96
4a.5 Conclusion 97

vii Contents
4b. Cell Sheet–Based Tissue Engineering 107
Yuji Haraguchi, Noriko Yasuda, Tatsuya Shimizu, Masayuki
Yamato, and Teruo Okano
4b.1 Introduction 107
4b.2 Cell Attachment/Detachment of a Temperature-Responsive Culture Surface and Resulting Cell Sheets
108
4b.3 The Applications of Cell Sheet–Based Tissue Engineering for Regenerative Medicine
110
4b.3.1 Two Epithelial Cell Sheets for Corneal Surface Regeneration
110
4b.3.2 Several Adult Stem/Progenitor Cell Sheets for Cardiovascular Disease
111
4b.3.3 Periodontal Ligament Cell Sheets for Periodontal Tissue Regeneration
111
4b.3.4 Epithelial Cell Sheets for Esophageal Regeneration after ESD
112
4b.3.5 Chondrocyte Sheets for Articular Cartilage Repair/Regeneration
112
4b.3.6 Fibroblast Sheets as a Lung Air Leak Sealant
113
4b.3.7 Pancreatic Islet Cell Sheets for Curing Diabetes Mellitus
114
4b.3.8 Hepatic Cell Sheets for Functional Hepatic Tissue
115
4b.3.9 Thyroid Cell Sheets for Hypothyroidism
117
4b.4 Conclusion 117
5a Scaffold-Based Myocardial Patches 125
Tadashi Sasagawa
5a.1 Introduction 125
5a.2 Scaffold Selection for Engineering Cardiac Patches
126
5a.3 Synthetic Materials 128
5a.3.1 Poly(Glycolic Acid) 128
5a.3.2 Poly(Lactide-co-Glycolide) 128
5a.3.3 Poly(Glycolide-co-Caprolactone) 129
5a.3.4 Poly(Lactide-co-Caprolactone) 129

viii Contents
5a.3.5 Polyurethane 130
5a.4 Natural Materials 130
5a.4.1 Alginate 130
5a.4.2 Agarose 131
5a.4.3 Collagen Type I 131
5a.4.4 Gelatin 132
5a.4.5 Fibrin 133
5a.4.6 Decelleularized Tissue Matrices 133
5a.5 Conclusion 135
5b. Cell Sheet–Based Myocardial Patches 141
Yutaka Terajima, Yuji Haraguchi, Tatsuya Shimizu, Masayuki
Yamato, and Teruo Okano
5b.1 Introduction 141
5b.2 Temperature-Responsive Culture Surface and Cell Sheets
143
5b.3 Stem Cells and Cell Sheet Therapy 143
5b.3.1 Skeletal Myoblast Sheet Patch 143
5b.3.2 Mesenchymal Stem Cell Sheet Patch 146
5b.3.3 Cardiac Progenitor Cell Sheet Patch 147
5b.3.4 Cardiac Cell Sheet Patch 147
5b.3.5 Fabrication of More Functional Cell Sheet–Based Myocardial Patches
148
5b.3.6 Issues to Be Overcome 149
6a. Scaffold-Based Myocardial Tissue Engineering 157
Yuji Haraguchi and Waki Sekine
6a.1 Introduction 157
6a.2 Tissue Engineering 158
6a.3 In vitro Reconstruction and in vivo Transplantation of Pulsatile Myocardial Tissue by Using Scaffolds and Cardiac Cells
159
6a.4 Pulsatile Human Cardiac Cell Source 163
6a.5 Conclusion 164
6b. Cell Sheet–Based Myocardial Tissue Engineering 171
Yuji Haraguchi and Tatsuya Shimizu
6b.1 Introduction 171
6b.2 In vitro Fabrication of Pulsatile Myocardial Tissue by Layering Cell Sheets
173

ix Contents
6b.3 In vivo Transplantation of Layered Cardiac
Cell Sheets 174
6b.3.1 Rapid Neovascularization after Cardiac Cell Sheet Transplantation
174
6b.3.2 Histological Analyses of Transplanted Cardiac Cell Sheets
175
6b.3.3 Physiological and Mechanical Analyses of Myocardial Tissue Grafts after Implantation
175
6b.3.4 Comparison between Dissociated Cell Injection and Cell Sheet Transplantation
177
6b.4 Therapeutic Effect of Cardiac Cell Sheet Transplantation on Cardiovascular Disease
177
6b.5 Conclusion 178
6c. Vascularization within Engineered Myocardial Tissue 187
Sachiko Sekiya, Megumi Muraoka, and Tatsuya Shimizu
6c.1 Introduction 187
6c.2 Biology of Blood Vessel Formation 188
6c.3 Strategies for Fabricating Vascularized 3D Tissues
189
6c.4 Growth Factor Delivery 191
6c.5 Coculture System Using Blood Vessel–Composing Cells
192
6c.6 Technologies for Fabrication of in vitro Vascular Structures
194
6c.7 In vivo Myocardial Tissue Engineering 196
6c.8 Future Views of Vascularization Technologies 197
6d. Organ-Like Tissue Fabrication 203
Hidekazu Sekine
6d.1 Introduction 203
6d.2 Scaffold-Based Cardiac Pumps 204
6d.3 Cell Sheet–Based Cardiac Pumps 206
6d.4 Future Perspective 207
6e. Bioreactor Technologies for Myocardial Tissue
Engineering 211
Katsuhisa Sakaguchi
6e.1 Introduction 211

x Contents
6e.2 Bioreactors under Microgravity 212
6e.3 Hollow-Fiber Bioreactor 213
6e.4 Perfusion Bioreactor 214
6e.5 In vivo Perfusion Bioreactor and in vivo
Tissue Culture 215
6e.6 Summary 216
7. Future Developments 221
Yuji Haraguchi and Tatsuya Shimizu
Index 233

xi Contents
Cardiovascular disease is the leading major cause of morbidity
and mortality in the world and a social problem regarding health,
especially in our aging society, regardless of the sustained efforts
of various investigators and doctors. Tissue engineering and
regenerative medicine are highly anticipated to resolve these
difficult problems, and have been progressing rapidly. In fact,
various regenerative clinical therapies have been performed for
treating cardiovascular disease. Differentiated cells derived from
embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells
have been already applied clinically in the field of ophthalmology,
and human cardiomyocytes differentiated from those stem cells
have also been used in large animal models for aiming the clinical
usage. Spectacular progresses in the fields are reported on a daily
basis. This broadly summarizes and discusses the developing tissue
engineering and regenerative medicine. The future challenges
of tissue engineering and regenerative medicine have also been
discussed. We believe that the incessant efforts and collaborations
of various investigators/doctors with various backgrounds, basic
scientists, clinicians, engineers, etc. will realize the “bioengineered
heart” and cure cardiovascular disease of many patients in future.
Tatsuya Shimizu
Katsuhisa Matsuura
Preface

The human heart, which consists of a pair of left and right atriums
and a pair of left and right ventricles, provides continuous blood
circulation for supplying oxygen and nutrients to the whole body
and sending carbon dioxide to the lungs by its strong mechanical
pumping ability [1, 2]. The coronary artery, which runs elaborately
around the heart, supplies oxygen and nutrients to the heart muscle,
and the blood flow is essential for keeping heart tissue healthy.
Heart tissue consists of many beating cardiomyocytes, which are
the origin of the contractility of heart muscle. On the other hand, it
has been known that more than half of cardiac cells are constituted
of noncardiomyocytes, namely, (1) fibroblasts, (2) endothelial cells
(ECs), and (3) smooth muscle cells (SMCs) [3–5]. Fibroblasts play
a role in synthesizing and maintaining the mechanical scaffold for
cardiomyocytes. ECs and SMCs constitute blood vessels that supply
Chapter 1
Introduction
Yuji Haraguchi, Katsuhisa Matsuura, and Tatsuya Shimizu
Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science,
Tokyo Women’s Medical University, 8-1 Kawada-cho,
Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan
[email protected]
Myocardial Tissue Engineering
Edited by Tatsuya Shimizu and Katsuhisa Matsuura
Copyright © 2015 Pan Stanford Publishing Pte. Ltd.
ISBN 978-981-4411-31-8 (Hardcover), 978-981-4411-32-5 (eBook)
www.panstanford.com

2 Introduction
oxygen and nutrients to cardiac cells, including cardiomyocytes and
fibroblasts.
Heart disease is the leading major cause of morbidity and
mortality, especially in industrialized countries [6–8]. Infarction of
the coronary artery, which is caused by several reasons, leads to the
necrosis and loss of cardiac cells due to poor oxygen and nutrient
supply. The myocardial necrosis progresses sequentially ischemic
heart disease, which is found to show a phenomenon known as
negative cardiac tissue remodeling, which is (1) left ventricular wall
thinning in the infarction area, (2) ventricular chamber dilatation, (3)
compensatory hypertrophy of the noninfarcted portion of the heart,
and (4) heart tissue fibrosis [9, 10]. The remodeling decreases heart
function and may induce lethal heart disease and arrhythmia [11,
12]. Dilated cardiomyopathy (DCM) is a heart disease characterized
by ventricular (sometimes atrial) dilation, with reduced wall
thickness, and finally leads to varying degrees of impaired systolic
function [13, 14]. It is thought that DCM is caused by several reasons,
namely, (1) electrolyte abnormality, (2) endocrine abnormality, (3)
hypertension, (4) infection, and (5) ischemia, and familial DCM is
also known [15]. Inhibition and/or improvement of the negative
remodeling induces the improvement of cardiac performances. The
following therapies for curing heart disease, including ischemic heart
disease and DCM, have been performed clinically: (1) drug therapy
(cardiac unloading by antihypertension, anticardiac remodeling,
antiarrhythmia, etc.), (2) surgical therapy (coronary artery bypass
graft surgery, surgical ventricular restoration, heart transplantation,
etc.), (3) catheter-based therapy (balloon catheter, stent placement,
ablation, etc.), and (4) medical device–based therapy (ventricular
assist devices, cardiac pacemaker, etc.) [16–34]. Although these
therapies markedly increase the survival rate of various patients, the
mortality still remains high at present. Some therapies have several
problems, namely, side effects (adverse effects), the necessity of
special techniques, repeated therapy, immune rejection, donor
shortage, infection, thrombi, etc. Many investigators have been
making untiring efforts to solve the problems.
Conventional therapies cannot restore the damaged myocardium,
and at present, there is no therapy for patients with severe heart disease, other than heart transplantation. Recently, regenerative therapy has attracted increasing attention as an alternative therapy for heart transplantation (Fig. 1.1). Cytokine therapy for repairing

3
a damaged myocardium using angiogenesis-related growth factors,
including vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast
growth factor (FGF), and hepatocyte growth factor (HGF), and
hematopoietic cytokines, including granulocyte colony-stimulating
factor (G-CSF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating
factor (GM-CSF), has been performed clinically [35–39]. The
injection of angiogenesis-related cytokines is expected to promote
the development of novel and supplemental collateral blood vessels,
which can function as the “bypass” of an infarcted coronary artery.
Hematopoietic cytokines are expected to regenerate a damaged
myocardium via the mobilization of bone marrow–derived stem
cells. On the other hand, for more effective therapy, cell-based
regenerative therapy has also been started. Cell injection therapies
using autologous cells, including skeletal myoblasts, cardiac stem
cells, and bone marrow– and peripheral blood–derived cells, have
been performed clinically and have shown modest improvements
of cardiac functions in some clinical trials [40–46]. For overcoming
the drawbacks of the direct injection of dissociated cells, scaffold-
based myocardial tissue engineering has been appeared as a second-
generation cell therapy [47–55]. On the other hand, “cell sheet
Introduction
Cell therapy
Skeletal myoblasts, cardiac stem cells,
Bone marrow-and peripheral blood derived cells,
ESCs/iPSCs-derived cardiomyocy tes
Three-dimensional
scaﬀold
Direct
Injection
G-CSF
GM-CSF
Cytokine therapy
Damaged
heart
Tissue Engineering
Cell sheet
layering
Temperature-responsive
culture dish
VEGF, FGF
HGF
Bone marrow-
derived cells
Cell sheet
Figure 1.1 Regenerative therapy for heart disease.

4 Introduction
engineering,” which is a novel tissue engineering methodology,
can make possible the fabrication of three-dimensional (3D)
and functional tissues without any artificial scaffolds by using a
temperature-responsive culture dish [56–64]. In various animal
models, bioengineered 3D tissues using autologous cells can be
transplanted into various tissues, including heart tissue, without
cell loss, and the transplantation into damaged heart can give higher
enormous therapeutic effects than dissociated cell injection via the
production of several growth factors, which show paracrine effects,
such as (1) angiogenesis, (2) antifibrosis, (3) antiapoptosis, and (4)
stem cell recruiting. Clinical trials for curing heart disease using
these tissue engineering methodologies have already performed
[65–67].
For further advanced regenerative therapy, attempts to engineer
pulsatile myocardial tissue have been already started. In the native myocardium, electrical coupling between cardiomyocytes occurs via gap junctions (GJs), which mediate the exchange of small molecules and ions between neighboring cells and are critical to a synchronized and functional beating [1]. Therefore, electrical couplings between cardiomyocytes via functional GJ formation are essential for the reconstruction of functional myocardium. Tissue engineering methodology allows us to fabricate electrical communicative myocardial tissues, which pulse spontaneously, synchronously, and macroscopically [49, 57]. The transplantation of pulsatile bioengineered myocardial tissue is expected to assist directly in the mechanical pumping ability of damaged heart; therefore, the bioengineered tissue can give not only a paracrine effect but also a mechanical effect to the damaged heart, resulting in more strong therapeutic effects than that of nonpulsatile tissue, which can give only a paracrine effect. In fact, after being transplanted in animal models, bioengineered 3D cardiac tissue shows functional and electrical couplings with the host myocardium [50, 61]. For the realization of a bioengineered organ, some groups have challenged the fabrication of vascularized thicker myocardium and engineered tissues with a pumping function [68–72]. As a clinical available pulsatile cardiomyocyte source, human embryonic stem cells (ESCs) [73] and induced pluripotent stem cells (iPSCs) [74, 75] have attractive potentials because the stem cells can efficiently differentiate into beating cardiomyocytes [76–78]. Furthermore, several methods to enrich differentiated cardiomyocytes with a

5 Introduction
high purity (more than 90%) have also been developed [79–84].
Stem cell–derived cardiomyocytes survive for a long term in vivo,
these cardiomyocytes can integrate with the host myocardium, and,
furthermore, the transplantation of these cells shows improvement
of cardiac functions in damaged-heart animal models [85–90].
Although ESCs/iPSCs have several problems, for example, immune
rejection and an ethical problem in ESCs and tumorgenicity and the
chromosomal insertion of exogenous genes in iPSCs, which still have
to be solved before their clinical trials, these problems are going to
be solved by the various efforts of many investigators [91–98]. In the
near future, human ESC-/iPSC-derived cardiomyocytes will be and
must be used in clinical application.
FIn this textbook, we broadly summarize myocardial tissue
engineering and regenerative medicine, which consists of (1) cell sources, including ESCs/iPSCs, (2) the clinical trials of cell therapy, (3) scaffold-based and scaffold-free tissue engineering, (4) pulsatile bioengineered 3D myocardial tissue and tube, etc. Past and present remarkable results and their problems, and future planning, will be discussed. Our final goal is the realization of a “bioengineered heart.” We want to discuss the possibility and the realization, together with many readers, in this textbook.
Acknowledgments
These works were supported by grants from Formation of Innovation Center for Fusion of Advanced Technologies in the Special Coordination Funds for Promoting Science and Technology “Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)” from the Ministry of Education, Culture, Sports Science, and Technology (MEXT), Japan, and Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) through the “Funding Program for World-Leading Innovative R&D on Science and Technology (FIRST Program),” initiated by the Council for Science and Technology Policy (CSTP).
Conflict of Interest
Dr. Teruo Okano is a director on the board of CellSeed Inc. Dr. Teruo Okano, Dr. Tatsuya Shimizu, and Dr. Masayuki Yamato are stakeholders of the company and are inventors of cell sheet–related patents. Tokyo Women’s Medical University was receiving research

6 Introduction
funds from CellSeed Inc., Hitachi Ltd., Dai Nippon Printing Co.,
Ltd., Olympus Corporation, Terumo Corporation, Nihon Kohden
Corporation, Asahi Kasei Corporation, Panasonic Healthcare Co.,
Ltd., Nikon Corporation, and Kowa Co., Ltd.
References
F1.FBoron, W.F., Boulpaep, E.L. (2003). Medic al Physiology, eds. Radisic, M.,
Michael, V.M., “The cardiovascular system” (Philadelphia, PA: Elsevier
Science), pp. 421–590.
F2.FBrueckner, J.K., Carmichael, S.W., Gest, T.R., Granger, N.A., Hansen, J.T.,
Walji, A.H. (2006). Atlas of Human Anatomy. Fourth Edition, eds. Frank,
H., Netter, M.D. (Elsevier Science).
F3.FNag, A.C. (1980). Study of non-muscle cells of the adult mammalian
heart: a fine structural analysis and distribution, Cytobios, 28, pp.
41–61.
F4.FManabe, I., Takayuki, S., Nagai, R. (2002). Gene expression in fibroblasts
and fibrosis, Circ. Res., 91 , pp. 1103–1113.
F5.FGaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S.P., Rohr, S. (2003). Coupling of
cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin, Circ. Res., 93 , pp. 421–428.
F6.FMathers, C.D., Ezzati, M., Lopez, A.D. (2007). Measuring the burden of
neglected tropical diseases: the global burden of disease framework, PLOS Negl. Trop. Dis., 1, p. e114.
F7.FWorld Health Organization. (2008). The Global Burden of Disease, 2004
update.
F8.FLloyd-Jones, D., Adams, R.J., Brown, T.M., Carnethon, M., Dai, S., De
Simone, G., Ferguson, T.B., Ford, E., Furie, K., Gillespie, C., Go, A., Greenlund, K., Haase, N., Hailpern, S., Ho, P.M., Howard, V., Kissela, B., Kittner, S., Lackland, D., Lisabeth, L., Marelli, A., McDermott, M.M., Meigs, J., Mozaffarian, D., Mussolino, M., Nichol, G., Roger, V.L., Rosamond, W., Sacco, R., Sorlie, P., Stafford, R., Thom, T., Wasserthiel-Smoller, S., Wong, N.D., Wylie-Rosett, J. (2010). Executive summary: heart disease and stroke statistics—2010 update: a report from the American Heart Association, Circulation, 121 , pp. 948–954.
F9.FReimer, K.A., Jennings, R.B. (1979). The “wavefront phenomenon” of
myocardial ischemic cell death. II. Transmural progression of necrosis within the framework of ischemic bed size (myocardium at risk) and collateral flow, Lab. Invest., 40 , pp. 633–644.

7 References
F10.FPaul, S. (1995). The pathophysiologic process of ventricular
r
emodeling: from infarct to failure, Crit. Care. Nurs. Q , 18, pp. 7–21.
11. Frangogiannis, N.G., Shimoni, S., Chang, S.M., Ren, G., Dewald, O.,
Gersch, C., Shan, K., Aggeli, C., Reardon, M., Letsou, G.V., Espada, R., Ramchandani, M., Entman, M.L., Zoghbi, W.A. (2002). Active interstitial remodeling: an important process in the hibernating human myocardium, J. Am. Coll. Cardiol., 39, pp. 1468–1474.
F12.FKostin, S., Pool, L., Elsässer, A., Hein, S., Drexler, H.C., Arnon, E.,
Hayakawa, Y., Zimmermann, R., Bauer, E., Klövekorn, W.P., Schaper, J. (2003). Myocytes die by multiple mechanisms in failing human hearts, Circ. Res., 92, pp. 715–724.
F13.FMohan, S.B., Parker, M., Wehbi, M., Douglass, P. (2002). Idiopathic
dilated cardiomyopathy: a common but mystifying cause of heart failure, Cleve Clin. J. Med., 69, 481–487.
F14.FLi, X., Luo, R., Jiang, R., Chen, R., Hua, W. (2012). Human leukocyte
antigen-DQ beta 1 chain (DQB1) gene polymorphisms are associated with dilated cardiomyopathy: a systematic review and meta-analysis, Heart Lung, 41, pp. 360–367.
F15.FGrünig, E., Tasman, J.A., Kücherer, H., Franz, W., Kübler, W., Katus, H.A.
(1998). Frequency and phenotypes of familial dilated cardiomyopathy,
J. Am. Coll. Cardiol., 31 , pp. 186–194.
F16.FPfeffer, M.A., Braunwald, E., Moyé, L.A., Basta, L., Brown, E.J. Jr., Cuddy,
T.E., Davis, B.R., Geltman, E.M., Goldman, S., Flaker, G.C., Klein, M., Lamas, G.A., Packer, M., Rouleau, J., Rouleau, J.L., Rutherford, J., Wertheimer, J.H., Hawkins, M. (1992). Effect of captopril on mortality and morbidity in patients with left ventricular dysfunction after myocardial infarction, N. Engl. J. Med., 327, pp. 669–677.
F17.FCIBIS-II Investigators and Committees. (1999). The cardiac
insufficiency bisoprolol study II (CIBIS-II): a randomized trial, Lancet,
353, pp. 9–13.
F18.FPacker, M., Coats, A.J., Fowler, M.B., Katus, H.A., Krum, H., Mohacsi, P.,
Rouleau, J.L., Tendera, M., Castaigne, A., Roecker, E.B., Schultz, M.K., DeMets, D.L. (2001). Effect of carvedilol on survival in severe chronic heart failure, N. Engl. J. Med., 344, pp. 1651–1658.
F19.FCleland, J.G., Pennell, D.J., Ray, S.G., Coats, A.J., Macfarlane, P.W., Murray,
G.D., Mule, J.D., Vered, Z., Lahiri, A. (2003). Myocardial viability as a determinant of the ejection fraction response to carvedilol in patients with heart failure (CHRISTMAS trial): randomized controlled trial, Lancet, 362 , pp. 14–21.

8 Introduction
F20.FAthanasuleas, C.L., Buckberg, G.D., Stanley, A.W., Siler, W., Dor, V.,
Di
Donato, M., Menicanti, L., Almeida de Oliveira, S., Beyersdorf, F.,
Kron, I.L., Suma, H., Kouchoukos, N.T., Moore, W., McCarthy, P.M., Oz,
M.C., Fontan, F., Scott, M.L., Accola, K.A. (2004). Surgical ventricular
restoration in the treatment of congestive heart failure due to post-
infarction ventricular dilation, J. Am. Coll. Cardiol., 44 , pp. 1439–1445.
F21.FBaber, U., Kini, A.S., Sharma, S.K. (2010). Stenting of complex lesions:
an overview, Nat. Rev. Cardiol. , 7, pp. 485–496.
F22.FBeck, H., Boden, W.E., Patibandla, S., Kireyev, D., Gutpa, V., Campagna, F.,
Cain, M.E., Marine, J.E. (2010). 50th Anniversary of the first successful permanent pacemaker implantation in the United States: historical review and future directions, Am. J. Cardiol., 106 , pp. 810–818.
F23.FCohn, W.E. (2010). Advances in surgical treatment of acute and chronic
coronary artery disease, Tex. Heart Inst. J., 37, pp. 328–330.
F24.FHunter, R.J., Schilling, R.J. (2010). Long-term outcome after catheter
ablation for atrial fibrillation: safety, efficacy and impact on prognosis,
Heart, 96, pp. 1259–1263.
F25.FKaszala, K., Ellenbogen, K.A. (2010). Device sensing: sensors and
algorithms for pacemakers and implantable cardioverter defibrillators, Circulation, 122 , pp. 1328–1340.
F26.FKereiakes, D.J. (2010). Safety of drug-eluting stents, Rev. Cardiovasc.
Med., 11, pp. 187–199;
F27.FLábrová, R., Spinar, J., Honzíková, N. (2010). Radiofrequency ablation
in treatment of atrial fibrillation, Physiol. Res., 59 , pp. S43–49.
F28.FLardizabal, J.A., Deedwania, P.C. (2010). Benefits of statin therapy
and compliance in high risk cardiovascular patients, Vasc. Health Risk
Manag., 5, pp. 843–853.
F29.FNishimi, M., Tashiro, T. (2010). Off-pump coronary artery bypass
vs percutaneous coronary intervention. Therapeutic strategies for 3-vessel coronary artery disease: OPCAB vs PCI(PCI-Side), Circ. J., 74,
pp. 2750–2757.
F30.FPatel-Raman, S.M., Chen, E.A. (2010). Past, present, and future
regulatory aspects of ventricular assist devices, J. Cardiovasc. Transl. Res., 3, pp. 600–603.
F31.FZhang, G., Yin, X., Qi, Y., Pendyala, L., Chen, J., Hou, D., Tang, C. (2010).
Ghrelin and cardiovascular diseases, Curr. Cardiol. Rev., 6, pp. 62–70.
F32.FEisenreich, A., Rauch, U. (2011). PI3K inhibitors in cardiovascular
disease, Cardiovasc. Ther., 29 , pp. 29–36

9 References
F33.FKlotz, S., Scheld, H.H. (2011). Surgical approach to end-stage heart
failure, Curr. Opin. Anaesthesiol., 24 , pp. 86–91.
F34.FMcGlothlin, D., De Marco, T. (2011). Transplantation in adults with
congenital heart disease, Prog. Cardiovasc. Dis. , 53, pp. 312–323.
F35.FLosordo, D.W., Vale, P.R., Symes, J.F., Dunnington, C.H., Esakof, D.D.,
Maysky, M., Ashare, A.B., Lathi, K., Isner, J.M. (1998). Gene therapy for
myocardial angiogenesis: initial clinical results with direct myocardial
injection of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemia,
Circulation, 98 , pp. 2800–2804.
F36.FSeiler, C., Pohl, T., Wustmann, K., Hutter, D., Nicolet, P.A., Windecker,
S., Eberli, F.R., Meier, B. (2001). Promotion of collateral growth by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in patients with coronary artery disease: a randomized, double-blind, placebo- controlled study, Circulation, 104 , pp. 2012–2017.
F37.FTakano, H., Ueda, K., Hasegawa, H., Komuro, I. (2007). G-CSF therapy
for acute myocardial infarction, Trends Pharmacol. Sci., 28, pp. 512–
517.
F38.FWilliams, P.D., Kingston, P.A. (2011). Plasmid-mediated gene therapy
for cardiovascular disease, Cardiovasc. Res.., 91, pp. 565–576.
F39.FSanganalmath, S.K., Abdel-Latif, A., Bolli, R., Xuan, Y.T., Dawn, B. (2011).
Hematopoietic cytokines for cardiac repair: mobilization of bone marrow cells and beyond, Basic Res. Cardiol., 106 , pp. 709–733.
F40.FMenasché, P., Hagège, A.A., Scorsin, M., Pouzet, B., Desnos, M.,
Duboc, D., Schwartz, K., Vilquin, J.T., Marolleau, J.P. (2001). Myoblast transplantation for heart failure, Lancet, 357 , pp. 279–280.
F41.FMenasché, P., Alfieri, O., Janssens, S., McKenna, W., Reichenspurner,
H., Trinquart, L., Vilquin, J.T., Marolleau, J.P., Seymour, B., Larghero, J., Lake, S., Chatellier, G., Solomon, S., Desnos, M., Hagège, A.A. (2008). The Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) trial: first randomized placebo-controlled study of myoblast transplantation, Circulation, 117 , pp. 1189–200.
F42.FFuh, E., Brinton, T.J. (2009). Bone marrow stem cells for the treatment
of ischemic heart disease: a clinical trial review, J. Cardiovasc. Transl. Res., 2, pp. 202–218.
F43.FAstori, G., Soncin, S., Lo Cicero, V., Siclari, F., Sürder, D., Turchetto, L.,
Soldati, G., Moccetti, T. (2010). Bone marrow derived stem cells in regenerative medicine as advanced therapy medicinal products, Am. J. Transl. Res., 2, pp. 285–295.

10 Introduction
F44.FAlaiti, M.A., Ishikawa, M., Costa, M.A. (2010). Bone marrow and
circulating stem/progenitor cells for regenerative cardiovascular
therapy, Transl. Res., 156 , pp. 112–129.
F45.FAtala, A., Lanza, R., Thomson, J.A., Nerem, R. (2011). Principles of
Regenerative Medicine, 2nd ed., eds. Radisic, M., Michael, V.M., “Cardiac tissue” (Academic Press), pp. 877–909.
F46.FBolli, R., Chugh, A.R., D’Amario, D., Loughran, J.H., Stoddard, M.F., Ikram,
S., Beache, G.M., Wagner, S.G., Leri, A., Hosoda, T., Sanada, F., Elmore, J.B., Goichberg, P., Cappetta, D., Solankhi, N.K., Fahsah, I., Rokosh, D.G., Slaughter, M.S., Kajstura, J., Anversa, P. (2011). Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial, Lancet, 378 , pp. 1847–1857.
F47.FLi, R.K., Jia, Z.Q., Weisel, R.D., Mickle, D.A., Choi, A., Yau, T.M. (1999).
Survival and function of bioengineered cardiac grafts, Circulation, 100,
pp. II63–II69.
F48.FLeor, J., Aboulafia-Etzion, S., Dar, A., Shapiro, L., Barbash, I.M., Battler,
A., Granot, Y., Cohen, S. (2000). Bioengineered cardiac grafts: a new approach to repair the infarcted myocardium? Circulation, 102, pp.
III56–II61.
F49.FZimmermann, W.H., Schneiderbanger, K., Schubert, P., Didié, M., Münzel,
F., Heubach, J.F., Kostin, S., Neuhuber, W.L., Eschenhagen, T. (2002). Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct, Circ. Res., 90 , pp. 223–230.
F50.FZimmermann, W.H., Melnychenko, I., Wasmeier, G., Didié, M., Naito, H.,
Nixdorff, U., Hess, A., Budinsky, L., Brune, K., Michaelis, B., Dhein, S., Schwoerer, A., Ehmke, H., Eschenhagen, T. (2006). Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts, Nat. Med. , 12, pp. 452–458.
F51.FPiao, H., Kwon, J.S., Piao, S., Sohn, J.H., Lee, Y.S., Bae, J.W., Hwang, K.K.,
Kim, D.W., Jeon, O., Kim, B.S., Park, Y.B., Cho, M.C. (2007). Effects of cardiac patches engineered with bone marrow-derived mononuclear cells and PGCL scaffolds in a rat myocardial infarction model, Biomaterials, 28 , pp. 641–649.
F52.FTan, M., Zhi, Y.W., Wei, R.Q., Huang, Y.C., Zhou, K.P., Tan, B., Deng, L., Luo,
J.C., Li, X.Q., Xie, H.Q., Yang, Z.M. (2009). Repair of infarcted myocardium using mesenchymal stem cell seeded small intestinal submucosa in rabbits, Biomaterials, 30 , pp. 3234–3240.
F53.FZimmermann, W.H., Cesnjevar, R. (2009). Cardiac tissue engineering:
implications for pediatric heart surgery, Pediatr. Cardiol., 230, pp.
716–723.

11
F54.FVunjak-Novakovic, G., Tandon, N., Godier, A., Maidhof, R., Marsano,
A.,
Martens, T.P., Radisic, M. (2010). Challenges in cardiac tissue
engineering, Tissue Eng. B Rev., 16 , pp. 169–187.
F55.FZimmermann, W.H. (2011). Embryonic and embryonic-like stem cells
in heart muscle engineering, J. Mol. Cell Cardiol., 50 , pp. 320–326.
F56.FOkano, T., Yamada, H., Sakai, H., Sakurai, Y. (1993). A novel recovery
system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide), J. Biomed. Mater. Res., 27,
pp. 1243–1251.
F57.FShimizu, T., Yamato, M., Isoi, Y., Akutsu, T., Setomaru, T., Abe, K., Kikuchi,
A., Umezu, M., Okano, T. (2002). Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsive cell culture surfaces, Circ. Res., 90, pp.
e40–e48.
F58.FShimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. (2003). Cell sheet
engineering for myocardial tissue reconstruction, Biomaterials, 24, pp.
2309–2316.
F59.FMiyagawa, S., Sawa, Y., Sakakida, S., Taketani, S., Kondoh, H., Memon,
I.A., Imanishi, Y., Shimizu, T., Okano, T., Matsuda, H. (2005). Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: their integration with recipient myocardium, Transplantation, 80 , pp. 1586–1595.
F60.FMemon, I.A., Sawa, Y., Fukushima, N., Matsumiya, G., Miyagawa, S.,
Taketani, S., Sakakida, S.K., Kondoh, H., Aleshin, A.N., Shimizu, T., Okano, T., Matsuda, H. (2005). Repair of impaired myocardium by means of implantation of engineered autologous myoblast sheets, J. Thorac.
Cardiovasc. Surg., 130, pp. 1333–1341.
F61.FSekine, H., Shimizu, T., Kosaka, S., Kobayashi, E., Okano, T. (2006).
Cardiomyocyte bridging between hearts and bioengineered myocardial tissues with mesenchymal transition of mesothelial cells, J. Heart Lung Transplant., 25, pp. 324–332.
F62.FShimizu, T., Sekine, H., Yamato, M., Okano, T. (2009). Cell sheet-based
myocardial tissue engineering: new hope for damaged heart rescue, Curr. Pharm. Des., 15, pp. 2807–2814.
F63.FHaraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. (2011). Regenerative
therapies using cell sheet-based tissue engineering for cardiac disease, Cardiol. Res. Pract., 2011, 845170.
F64.FSekine, H., Shimizu, T., Dobashi, I., Matsuura, K., Hagiwara, N.,
Takahashi, M., Kobayashi, E., Yamato, M., Okano, T. (2011). Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior
References

12 Introduction
cell survival in comparison with dissociated cell injection, Tissue Eng.
A, 17, pp. 2973–2980.
65. Chachques, J.C., Trainini, J.C., Lago, N., Masoli, O.H., Barisani, J.L.,
Cortes-Morichetti, M., Schussler, O., Carpentier, A. (2007). Myocardial assistance by grafting a new bioartificial upgraded myocardium (MAGNUM clinical trial): one year follow-up, Cell Transplant., 16, pp.
927–934.
66. Chachques, J.C., Trainini, J.C., Lago, N., Cortes-Morichetti, M., Schussler,
O., Carpentier, A. (2008). Myocardial Assistance by Grafting a New Bioartificial Upgraded Myocardium (MAGNUM trial): clinical feasibility study, Ann. Thorac. Surg., 85 , pp. 901–908.
F67.FSawa, Y., Miyagawa, S., Sakaguchi, T., Fujita, T., Matsuyama, A., Saito,
A., Shimizu, T., Okano, T. (2012). Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case, Surg. Today, 42, pp. 181–184
F68.FShimizu, T., Sekine, H., Yang, J., Isoi, Y., Yamato, M., Kikuchi, A.,
Kobayashi, E., Okano, T. (2006). Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues, FASEB J., 20, pp. 708–710.
F69.FSekine, H., Shimizu, T., Hobo, K., Sekiya, S., Yang, J., Yamato, M., Kurosawa,
H., Kobayashi, E., Okano, T. (2008). Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts, Circulation, 118, pp.
S145–S152.
F70.FKubo, H., Shimizu, T., Yamato, M., Fujimoto, T., Okano, T. (2007).
Creation of myocardial tubes using cardiomyocyte sheets and an in vitro cell sheet-wrapping device, Biomaterials, 28, pp. 3508–3516.
F71.FSekine, H., Shimizu, T., Yang, J., Kobayashi, E., Okano, T. (2006). Pulsatile
myocardial tubes fabricated with cell sheet engineering, Circulation, 114, pp. I87–193.
72. Ott, H.C., Matthiesen, T.S., Goh, S.K., Black, L.D., Kren, S.M., Netoff, T.I.,
Taylor, D.A. (2008). Perfusion-decellularized matrix: using nature’s
platform to engineer a bioartificial heart, Nat. Med., 14, pp. 213–221.
F73.FThomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel,
J.J., Marshall, V.S., Jones, J.M. (1998). Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts, Science, 282 , pp. 1145–1147.
F74.FTakahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda,
K., Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131, pp. 861–872.

13
F75.FYu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane,
J.L.,
Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I.I.,
Thomson, J.A. (2007). Induced pluripotent stem cell lines derived from
human somatic cells, Science, 318 , pp. 1917–1920.
F76.FKehat, I., Kenyagin-Karsenti, D., Snir, M., Segev, H., Amit, M., Gepstein,
A., Livne, E., Binah, O., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. (2001). Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes, J. Clin. Invest., 108, pp.
407–414.
F77.FMummery, C., Ward-van Oostwaard, D., Doevendans, P., Spijker, R.,
van den Brink, S., Hassink, R., van der Heyden, M., Opthof, T., Pera, M., de la Riviere, A.B., Passier, R., Tertoolen, L. (2003). Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells, Circulation, 107 , pp. 2733–2740.
F78.FYang, L., Soonpaa, M.H., Adler, E.D., Roepke, T.K., Kattman, S.J., Kennedy,
M., Henckaerts, E., Bonham, K., Abbott, G.W., Linden, R.M., Field, L.J., Keller, G.M. (2008). Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population, Nature, 453,
pp. 524–528.
F79.FKita-Matsuo, H., Barcova, M., Prigozhina, N., Salomonis, N., Wei, K.,
Jacot, J.G., Nelson, B., Spiering, S., Haverslag, R., Kim, C., Talantova, M., Bajpai, R., Calzolari, D., Terskikh, A., McCulloch, A.D., Price, J.H., Conklin, B.R., Chen, H.S., Mercola, M. (2009). Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes, PLOS ONE, 4, p. e5046.
F80.FRust, W., Balakrishnan, T., Zweigerdt, R. (2009). Cardiomyocyte
enrichment from human embryonic stem cell cultures by selection of ALCAM surface expression, Regen. Med. , 4, pp. 225–237.
81. Hattori, F., Chen, H., Yamashita, H., Tohyama, S., Satoh, Y.S., Yuasa, S., Li,
W., Yamakawa, H., Tanaka, T., Onitsuka, T., Shimoji, K., Ohno, Y., Egashira, T., Kaneda, R., Murata, M., Hidaka, K., Morisaki, T., Sasaki, E., Suzuki, T., Sano, M., Makino, S., Oikawa, S., Fukuda, K. (2010). Nongenetic method
for purifying stem cell-derived cardiomyocytes, Nat. Methods, 7, pp.
61–66.
F82.FDubois, N.C., Craft, A.M., Sharma, P., Elliott, D.A., Stanley, E.G., Elefanty,
A.G., Gramolini, A., Keller, G. (2011). SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells, Nat. Biotechnol., 29 , pp. 1011–1018.
F83.FUosaki, H., Fukushima, H., Takeuchi, A., Matsuoka, S., Nakatsuji, N.,
Yamanaka, S., Yamashita, J.K. (2011). Efficient and scalable purification
References

14 Introduction
of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent
stem cells by VCAM1 surface expression, PLOS ONE, 6, p. e23657.
F84.FLin, B., Kim, J., Li, Y., Pan, H., Carvajal-Vergara, X., Salama, G., Cheng, T.,
Li, Y., Lo, C.W., Yang, L. (2012). High-purity enrichment of functional cardiovascular cells from human iPS cells, Cardiovasc. Res., 95, pp.
327–335.
F85.FKehat, I., Khimovich, L., Caspi, O., Gepstein, A., Shofti, R., Arbel, G., Huber,
I., Satin, J., Itskovitz-Eldor, J., Gepstein, L. (2004). Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells, Nat. Biotechnol., 22 , pp. 1282–1289.
F86.FCaspi, O., Huber, I., Kehat, I., Habib, M., Arbel, G., Gepstein, A., Yankelson,
L., Aronson, D., Beyar, R., Gepstein, L. (2007). Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes improves myocardial performance in infarcted rat hearts, J. Am. Coll. Cardiol., 50, pp. 1884–
1893.
87. Dai, W., Field, L.J., Rubart, M., Reuter, S., Hale, S.L., Zweigerdt, R.,
Graichen, R.E., Kay, G.L., Jyrala, A.J., Colman, A., Davidson, B.P., Pera, M., Kloner, R.A. (2007). Survival and maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes in rat hearts, J. Mol. Cell Cardiol., 43, pp. 504–516.
F88.FLaflamme, M.A., Chen, K.Y., Naumova, A.V., Muskheli, V., Fugate, J.A.,
Dupras, S.K., Reinecke, H., Xu, C., Hassanipour, M., Police, S., O’Sullivan, C., Collins, L., Chen, Y., Minami, E., Gill, E.A., Ueno, S., Yuan, C., Gold, J., Murry, C.E. (2007). Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts, Nat. Biotechnol., 25 , pp. 1015–1024.
F89.Fvan Laake, L.W., Passier, R., Monshouwer-Kloots, J., Verkleij, A.J., Lips,
D.J., Freund, C., den Ouden, K., Ward-van Oostwaard, D., Korving, J., Tertoolen, L.G., van Echteld, C.J., Doevendans, P.A., Mummery, C.L. (2007). Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction, Stem Cell Res., 1, pp. 9–24.
F90.FZwi-Dantsis, L., Huber, I., Habib, M., Winterstern, A., Gepstein, A., Arbel,
G., Gepstein, L. (2013). Derivation and cardiomyocyte differentiation of induced pluripotent stem cells from heart failure patients, Eur. Heart J., 34, pp. 1575–1586.
F91.FWakayama, T., Tabar, V., Rodriguez, I., Perry, A.C., Studer, L., Mombaerts,
P. (2001). Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer, Science, 292, pp. 740–743.

15
F92.FNakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Takahashi, K., Ichisaka, T.,
A
oi, T., Okita, K., Mochiduki, Y., Takizawa, N., Yamanaka, S. (2008).
Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse
and human fibroblasts, Nat. Biotechnol., 26, pp. 101–106.
F93.FKim, D., Kim, C.H., Moon, J.I., Chung, Y.G., Chang, M.Y., Han, B.S., Ko, S.,
Yang, E., Cha, K.Y., Lanza, R., Kim, K.S. (2009). Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins, Cell Stem Cell, 4, pp. 472–476.
F94.FNakagawa, M., Takizawa, N., Narita, M., Ichisaka, T., Yamanaka, S. (2010).
Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 107, pp. 14152–14157.
F95.FWarren, L., Manos, P.D., Ahfeldt, T., Loh, Y.H., Li, H., Lau, F., Ebina, W.,
Mandal, P.K., Smith, Z.D., Meissner, A., Daley, G.Q., Brack, A.S., Collins, J.J., Cowan, C., Schlaeger, T.M., Rossi, D.J. (2010). Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA, Cell Stem Cell, 7, pp. 618–630.
F96.FYe, L., Chang, J.C., Lin, C., Qi, Z., Yu, J., Kan, Y.W. (2010). Generation of
induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,107, pp. 19467–19472.
F97.FMaekawa, M., Yamaguchi, K., Nakamura, T., Shibukawa, R., Kodanaka,
I., Ichisaka, T., Kawamura, Y., Mochizuki, H., Goshima, N., Yamanaka, S. (2011). Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1, Nature, 474 , pp. 225–229.
F98.FMiyoshi, N., Ishii, H., Nagano, H., Haraguchi, N., Dewi, D.L., Kano, Y.,
Nishikawa, S., Tanemura, M., Mimori, K., Tanaka, F., Saito, T., Nishimura, J., Takemasa, I., Mizushima, T., Ikeda, M., Yamamoto, H., Sekimoto, M., Doki, Y., Mori, M. (2011). Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs, Cell Stem Cell , 8, pp. 633–638.
References

2a.1 Introduction
There are great expectations that cell transplant therapy using
various types of stem cells will serve as the next-generation therapy
for systemic disorders as well as cardiovascular diseases through
the regeneration of diseased organs. Both small-animal studies and
clinical studies have provided evidence that this therapy is effective
in ameliorating cardiac dysfunction in acute myocardial infarction
and chronic ischemic heart diseases. So, how does cell transplant
therapy work? It was initially thought that the improvement shown
occurred via direct repopulation of the heart by transplanted cell–
driven cellular constituents, such as cardiomyocytes and vascular
endothelial cells [1]. However, this is not now considered to be a
major mechanism, given that only a small proportion of transplanted
cells differentiate into cardiomyocytes [2] and that cell fusion is
involved in differentiation into cardiomyocytes [3]. An alternative
Chapter 2a
Variety of Cell Sources
Katsuhisa Matsuura
Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science,
Tokyo Women’s Medical University, 8-1 Kawada-cho,
Shinjuku-ku, Tokyo, 162-8666, Japan
[email protected]
Myocardial Tissue Engineering
Edited by Tatsuya Shimizu and Katsuhisa Matsuura
Copyright © 2015 Pan Stanford Publishing Pte. Ltd.
ISBN 978-981-4411-31-8 (Hardcover), 978-981-4411-32-5 (eBook)
www.panstanford.com

18 Variety of Cell Sources
mechanism suggested is paracrine signaling mediated by proteins
secreted from the transplanted cells. There is accumulating
evidence that paracrine actions mediate the beneficial effects of cell
transplantation on cardiac function. Here, we review the cell sources
for cell transplantation in cardiovascular diseases in terms of
paracrine effects, including cytokine secretion and vascularization.
2a.2
Paracrine Effects
Stem cell paracrine effects were originally thought to reflect the
actions of factors secreted by stem cells within the stem cell population
and on cellular constituents of the niches (microenvironments
around the stem cell) in order to regulate the properties and
functions of the stem cells in their niches. However, considering
the various types of host organs receiving stem cells, together with
changes in the niches after transplantation, paracrine effects are
now considered to include actions on host organs. Paracrine effects
in cell transplant therapy for cardiovascular diseases are the actions
of proteins secreted by the transplanted cells on cardiomyocytes,
vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, fibroblasts,
and endogenous cardiac stem cells in the host. Paracrine effects can
explain a variety of phenomena such as angiogenesis, suppression
of apoptosis, suppression of fibrosis, suppression of inflammation,
regulation of myocardial metabolism, improvement of myocardial
contraction, and promotion of migration and differentiation of
endogenous stem cells (Fig. 2a.1 and Table 2a.1). Transplanted cells
can produce different sets of proteins after transplantation. The
profile of secreted proteins changes in a spatiotemporal manner
in response to alternation in the niches, thereby exerting various
paracrine effects. Furthermore, these proteins appear to have
autocrine effects on the transplanted cells themselves, modulating
their function (Fig. 2a.1).
2a.3
Bone Marrow Mononuclear Cells/
Peripheral Blood Mononuclear Cells/
Endothelial Progenitor Cells
Large-scale clinical studies have been performed in Europe and
North America to examine the therapeutic use of bone marrow

19
mononuclear cells for acute myocardial infarction and chronic
ischemic heart disease. A recent meta-analysis demonstrated that
the therapy improved left ventricular ejection fraction by 5.4% and
reduced infarct scar size and left ventricular end-systolic volume by
5.5% and 4.8 mL, respectively [4]. Although in vivo differentiation
of bone marrow mononuclear cells into cardiomyocytes remains a
topic for debate, endothelial progenitor cells (EPCs) are found in
the bone marrow mononuclear cell population, and regeneration of
blood vessels from these EPCs is expected to improve blood flow.
A study using an animal model of myocardial ischemia showed the
presence of vascular endothelial cells derived from transplanted
EPCs, increases in capillary density, and improvements in cardiac
function after transplantation of EPCs [5]. Moreover, a model
using genetically engineered bone marrow mononuclear cells
carrying suicide genes revealed that the improvements in left
ventricular ejection fraction and increases in capillary density after
transplantation were reversed when bone marrow–derived vascular
endothelial or smooth muscle cells were selectively depleted through
the suicide mechanism [6]. These results suggest that cardiovascular
Bone Marrow Mononuclear Cells
Figure 2a.1 Scheme of paracrine effects in stem/progenitor cell transplan-
tation to the injured heart.

20 Variety of Cell Sources
Table 2a.1

Key molecules for paracrine effects in cell transplantation to the injured heart
Cardioprotection Angiogenesis Stem cell migrationAnti-inflammationContractility ECM reconstruction
sFRP1, 2VEGFSDF-1IL-6GHThymosin b4
Thymosin b4 HGFVEGFIL-11IGF-1 FGF-2
HGFFGF-2FGF-2MMP1, 2, 9
IGF-1Angiopoietin-1 MCP-1TIMP1, 2
LIFTGFb1 SCFCTGF
sVCAM-1IL-1 b, IL-6 sVCAM-1
Angiogenin
PDGF-A
sVCAM-1
Abbreviations : sFRP, secreted frizzled-related protein; HGF, hepatocyte growth factor; IGF, insulin-like growth factor; LIF, leukemia inhibitory factor;
sVCAM, soluble vascular cell adhesion molecule; VEGF, vascular endothelial growth factor; FGF, fibroblast growth factor; TGF, transforming growth
factor; IL, interleukin; PDGF, platelet-derived growth factor; SDF, stromal cell–derived factor; MCP, monocyte chemotactic protein; SCF, stem cell factor;
GH, growth hormone; ECM, extracellular matrix; MMP, matrix metalloproteinase; TIMP, tissue inhibitor of metalloproteinases; CTGF, connective tissue
growth factor.

21 Bone Marrow Mononuclear Cells
differentiation of the transplanted cells contributes, at least in part,
to improvement of cardiac function via the restoration of blood
flow. On the other hand, an experimental model of acute myocardial
infarct showed that injection of the supernatants of bone marrow
mononuclear cell culture into the heart resulted in improvement of
cardiac function, accompanied by increases in capillary density and
reduction of infarct scar size [7]. Since the supernatants contained
VEGF, FGF-1, IGF-1, and SDF-1 [8], these proteins are considered to
promote proliferation and migration of cardiovascular and vascular
smooth muscle cells in the host heart and consequently contribute
to neovascularization. In addition, there is evidence that the host
organ is not always the recipient of the cytokine actions, but host
cells activated by transplantation therapy can produce protective
proteins for self-repair. Cho et al. transplanted human EPCs into
infarcted hearts of immunocompromised mice and found that,
despite the rapid disappearance of human EPCs within one week,
the levels of expression of angiogenic factors such as VEGF, FGF-2,
HGF, and angiopoietin-1 remained high for more than two weeks,
and this prolonged expression was attributed to host (mouse) cells,
not transplanted (human) cells [9]. In other words, the secretion
of proteins from the transplanted cells, or direct contact with the
transplanted cells, promotes the production of angiogenic factors by
host cells, which restores blood flow and consequently ameliorates
cardiac dysfunction in myocardial infarct in mice. It was proven
that transplanted cells in patients with peripheral vascular diseases
promote angiogenesis, thereby alleviating subjective symptoms
and contributing to limb salvage. Tateno et al. reported that
transplanted peripheral blood-derived mononuclear cells promote
the regeneration of local skeletal muscle, which then secretes
angiogenic factors such as VEGF and IL-1b, thereby contributing
to improvement of blood flow in the lower limbs [10]. Recently
we have reported that Gr-1(+) myeloid cell–secreted GH mainly
contributes to the improvement of cardiac function in several
dilated cardiomyopathy models when bone marrow mononuclear
cells are intravenously infused [11]. However, GH expression in Gr-
1(+) cells was suppressed via humoral factor–mediated activin A
in heart failure, which leads to marginal effects after infusion. Thus
pretreatment to modulate the environmental cue in heart failure
might enhance the function of cells for transplantation.

22 Variety of Cell Sources
2a.4 Mesenchymal Stem Cells
Mesenchymal stem cells are stromal cells in mesenchymal tissues,
such as bone marrow and adipose tissues, and generally have
the potential to differentiate into adipocytes, osteocytes, and
cartilaginous cells. Several studies have demonstrated in vitro
differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes,
prompting high expectations for the differentiation of these cells
into the cardiomyocyte lineage after transplantation. However,
similar to other cells tested, while transplanted mesenchymal stem
cells did ameliorate cardiac dysfunction accompanied by increased
neovascularization and suppression of fibrosis in models of acute and
chronic myocardial infarct and dilated cardiomyopathy [12–14], only
a very small proportion of transplanted cells actually differentiated
into cardiomyocytes [15, 16]. Gnecchi et al. reported that the
supernatants of bone marrow–derived mesenchymal stem cell
culture, maintained under hypoxic conditions, suppressed hypoxia-
induced myocardial cell death in vitro and that this suppressive effect
was enhanced when a similarly conditioned medium recovered from
the culture of mesenchymal stem cells overexpressing Akt was used
[17]. The effects of this conditioned medium were also confirmed
in a model of myocardial infarction, suggesting the involvement
of paracrine effects in the mechanism for improvement of cardiac
function after transplantation of mesenchymal stem cells [18]. In
fact, the expression levels of VEGF, FGF-2, HGF, IGF-1, and thymosinβ4
were up-regulated in bone marrow–derived mesenchymal stem
cells exposed to hypoxic stimulation and in those overexpressing
Akt [18]. Comprehensive gene expression analysis, performed by
the same research group, showed that up-regulation of sFRP2 was
most noticeable in mesenchymal stem cells overexpressing Akt and
that the medium of mesenchymal stem cells overexpressing Akt lost
its ability to reduce infarction injury size when cells were treated
with short interfering ribonucleic acid (siRNA) against sFRP2 [19].
Taken together, transplantation of mesenchymal stem cells appears
to have direct cardioprotective and angiogenic effects by using
secreted proteins as mediators. On the other hand, paracrine effects
characteristic of mesenchymal stem cells include suppression of
fibrosis and anti-inflammatory actions. The suppression of fibrosis
by mesenchymal stem cell transplantation has been reported
in other organs, including lung [20], liver [21], and kidney [22].

23 Skeletal Myoblasts
Mesenchymal stem cells express proteins involved in ECM synthesis,
such as collagens, MMP, serine proteases, and serine protease
inhibitors [23], and suppress the proliferation of cardiac fibroblasts
and collagen synthesis [24]. Transplantation of these cells reverted
elevated expression of collagen type I, collagen type III, TIMP-1, and
TGFb in a rat model of myocardial infraction [25], suggesting that
transplanted mesenchymal stem cells contribute to suppression
of cardiac remodeling in an injured heart by directly regulating
the expression of ECM proteins in the host heart. In addition,
transplanted mesenchymal stem cells appear not to trigger host
immune responses, and allogenically transplanted cells survive in
the host without immunosuppressants [26], indicating their anti-
inflammatory effects. Onishi et al. reported that transplantation
of mesenchymal stem cells resulted in improvement of cardiac
function, accompanied by suppression of increases in CD68-positive
inflammatory cells and expression of MCP-1 in a rat model of acute
myocarditis [27].
2a.5
Skeletal Myoblasts
Skeletal myoblasts are considered to have therapeutic potential because they can be prepared from the host sources to allow autologous transplantation, they are ischemia resistant, and they are able to differentiate into nonmyocytes. Skeletal myoblasts do not differentiate into cardiomyocytes in vivo [28] and cannot support the myocardium for synchronous contraction, because connexin activity, which enables electrical coupling with surrounding cardiomyocytes, is absent in these cells. On the other hand, several studies have provided evidence that transplantation of these cells suppresses fibrosis and apoptosis and promotes angiogenesis, thereby ameliorating cardiac dysfunction caused by ischemic and nonischemic insult [29–31] and indicating the importance of paracrine effects. Various angiogenic factors such as VEGF, placental growth factor (PIGF), angiogenin, angiopoietin, HGF, and PDGF-BB, as well as antifibrotic factors such as MMP2, MMP9, and MMP10, have been found in the supernatants of human skeletal myoblast culture [32], suggesting the involvement of these factors in myocardial repair. The Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) trial, which investigated cases of depressed

24 Variety of Cell Sources
cardiac function in coronary diseases, revealed that injection of
autologous myoblasts in combination with coronary artery bypass
surgery significantly reduced left ventricular volume but did not
alter left ventricular ejection fraction any more than the control
treatment (surgery only) [33]. Considering that approximately
80% of directly transplanted myoblasts reportedly disappear 24
hours after transplantation [34], insufficient engraftment of skeletal
myoblasts and the resulting shortage of growth factors secreted
from these cells may account for the insufficient effects. In search
of a more efficient transplantation procedures, Dr. Sawa’s group
prepared skeletal myoblast sheets using culture dishes coated with a
temperature-responsive polymer and tested them in a rat myocardial
infarct model [31], dilated cardiomyopathic hamsters [30], and a
canine dilated cardiomyopathy-like model [29]. On the basis of the
myocardial repair and improvement of cardiac function observed
in these models, myoblast sheets are currently being investigated
in a clinical trial. Moreover, implantation of the myoblast sheets
was shown to be more effective than direct injection of myoblasts
into the myocardium in suppressing fibrosis and in improving left
ventricular ejection fraction in a rat model of ischemia [35]. These
findings suggest that efficient engraftment of the transplanted cells
is crucial for sustained paracrine effects.
2a.6
Cardiac Stem/Progenitor Cells
The notion of the heart as a terminally differentiated organ with no self-repair potential has been undermined by recent studies demonstrating the presence of cardiac stem/progenitor cells that can differentiate into cardiomyocytes in the heart of adult mammals, including humans. Also, since self-repair in the heart was recently observed in humans [36], the presence of self-repair mechanisms mediated by endogenous cardiac stem/progenitor cells is now becoming an accepted concept. Accordingly, cardiac stem/progenitor cells possibly improve cardiac function by differentiating into cardiomyocytes, and therefore they are thought to be a more promising candidate for transplantation than many other cells. There are several subtypes of cardiac stem/progenitor cells, including c-kit-positive cells [37], Sca-1-positive cells [38, 39], side population cells [40], isl-1-positive cells [41], and cardiac

25 Cardiac Stem/Progenitor Cells
sphere-forming cells [42], but their interrelations are not totally
clear. Because of their cardiomyogenic potential, transplanted
cardiac stem/progenitor cells are expected eventually to replace a
damaged/lost myocardium. Indeed, it has already been reported
that cardiac stem/progenitor cells, injected directly into the heart
tissue, differentiated into cardiomyocytes [37, 42]. We prepared
sheets of Sca-1-positive cardiac progenitor cells (CPCs) derived from
murine hearts by using culture dishes coated with a temperature-
responsive polymer and tested them for transplantation in a murine
model of myocardial infarction [43]. Results showed significantly
greater improvement in left ventricular systolic performance
four weeks after transplantation in mice that received CPC sheets
compared to control mice (no transplantation) and showed that
the number of cardiomyocytes differentiated from CPC sheets was
sufficient to replace approximately 5% of cardiomyocytes in a
murine heart. However, amelioration of cardiac dysfunction cannot
be explained solely by these findings. Since increases in capillary
density and suppression of fibrosis were confirmed in damaged sites
after transplantation of CPCs, the involvement of factors produced
by the transplanted cells was suggested. Comprehensive analysis
by cytokine antibody array revealed that the culture supernatants
of CPCs contained significantly higher levels of sVCAM-1 than those
of control cells. Also, sVCAM-1 expression remained high in mice
that had received CPCs but not in control mice. Furthermore, the
culture supernatants of CPCs were shown to have angiogenic effects,
suppress cardiomyocyte death, and promote migration of the CPCs
themselves in vivo. When expression of the sVCAM-1 receptor a4b1
integrin was suppressed after transplantation of the CPC sheets,
the effects of transplantation, including improvement in cardiac
function, enhanced angiogenesis, and suppression of fibrosis, were
diminished and the engraftment of CPCs was suppressed. Taken
together, it is considered that transplantation of CPCs improves
cardiac function in a complex manner, promoting angiogenesis,
suppressing fibrosis, protecting cardiomyocytes, and promoting cell
migration and survival. Recently, multiple groups have reported that
human CPCs secrete proteins such as VEGF, HGF, IGF-1, and TIMP-1
[44, 45]. VEGF and HGF are most likely to play a role in angiogenesis.
It was reported that HGF and IGF-1 injected directly into the border
zone of myocardial infarct promoted migration, proliferation, and
differentiation of endogenous cardiac stem cells [46], suggesting

26 Variety of Cell Sources
the possibility that transplanted human CPCs contribute to cardiac
repair through the activation of endogenous cardiac stem cells.
2a.7
ES Cells/iPS Cells
Since mouse and human embryonic stem cells (ESCs) are capable of unlimited proliferation and have been shown to differentiate into cardiovascular lineages [47, 48], they are considered to be the best candidate for repopulating a damaged myocardium, a major aim of regenerative medicine. Clinical use of ESCs is associated with several concerns such as ethical aspects and immune rejection attributed to allotransplantation, but these problems are now believed to be solvable following the discovery of inducible pluripotent stem cells (iPSCs) [49]. On the other hand, the problem of tumor formation associated with transplantation of ESCs/iPSCs has not been fully solved. Many studies across the world have sought methods for cardiovascular lineage–specific induction and techniques for cell selection [50–56]. There is accumulating evidence that transplanted ESCs or CPCs/cardiomyocytes derived from or ESCs/iPSCs were integrated in the cardiac tissue and improved cardiac function in an ischemic model [57–59]. In addition to cardiomyocytes derived from ESCs [60], undifferentiated ESCs and Nkx2.5-positive CPCs were
shown to differentiate into cardiomyocytes, vascular endothelial cells, and vascular smooth muscle cells when transplanted into the ischemic murine heart [57, 61], suggesting that these transplanted cells have certain effects on the replacement of lost cells in the damaged heart. On the other hand, Christoforou et al. reported that 12% of 1 × 10
6
mouse ESC-driven cardiomyocytes engrafted and
differentiated into cardiomyocytes four weeks after transplantation in a mouse model of myocardial infarct [57]. Reportedly, the mouse heart is formed with approximately 2 × 10
6
cardiomyocytes, so it
is impossible to explain improvement of cardiac function solely with regenerated cardiomyocytes. Also, it has been reported that the extent of neovascularization, but not the number of mouse ESC- driven cardiomyocytes transplanted, correlated with levels of cardiac function improvement in a mouse model of myocardial infarction [62], suggesting that the contribution of cardiomyocytes to the reduction in size of the host heart is small, while paracrine actions play a key role in transplant therapy using cardiomyocytes. In the rat model of ischemia reperfusion prepared by the Langendorff method,

27
improvement of left ventricular systolic function, together with
elevated expression of VEGF and IL-1b, was found in rats treated
with the supernatants of mouse ESC culture [63]. Considering
the elevated VEGF production by ESCs in hypoxic conditions, the
involvement of enhanced angiogenesis, through growth factors
secreted by ESCs, was suggested. In addition, it was reported that
the number of c-kit(+)/Flk-1(+) cells was increased in the heart
and neovascularization was promoted as the levels of HGF and IGF-
1were elevated [64]. These findings suggest that factors secreted by
the ESCs protect the heart in a direct manner and also through the
induction of endogenous stem cells in the host.
2a.8
Conclusion
As reviewed above, the main mechanism for the therapeutic effects of cell therapy involves paracrine signaling between transplanted cells and the host heart. However, transplanted cells reportedly disappear at an early stage, depending on the types of cells and methods used for transplantation. When cell therapy is regarded as a multiprotein cocktail therapy, procedures allowing for long-term engraftment of transplanted cells are necessary to achieve higher therapeutic effects. However, many patients with coronary artery disease are elderly and complicated by other diseases such as hypertension and diabetes. Impairment of the migration and proliferation of stem cells and of in vivo neovascularization were evident in these cases [65], suggesting that production of cardioprotective factors by the transplanted cells is insufficient in many cases of cardiac disease. Elucidating the precise mechanism of paracrine effects in cell transplant therapy will improve therapeutic outcomes and help to explain the pathology of heart disease. It will also lead to the development of new therapeutic strategies. Further studies are therefore warranted.
References
F1.FOrlic, D., et al. (2001). Bone marrow cells regenerate infarcted
myocardium, Nature, 410 , pp. 701–705.
F2.FMurry, C.E., et al. (2004). Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts, Nature, 428, pp. 664–668.
References

28 Variety of Cell Sources
F3.FNygren, J.M., et al. (2004). Bone marrow-derived hematopoietic cells
generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but
not transdifferentiation, Nat. Med., 10, pp. 494–501.
F4.FAbdel-Latif, A., et al. (2007). Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis, Arch. Intern.
Med., 167 , pp. 989–997.
F5.FKawamoto, A., et al. (2003). Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia, Circulation, 107, pp. 461–
468.
F6.FYoon, C.H., et al. (2010). Mechanism of improved cardiac function after bone marrow mononuclear cell therapy: role of cardiovascular lineage commitment, Circulation, 121 , pp. 2001–2011.
F7.FTakahashi, M., et al. (2006). Cytokines produced by bone marrow cells can contribute to functional improvement of the infarcted heart by protecting cardiomyocytes from ischemic injury, Am. J. Physiol. Heart
Circ. Physiol., 291 , pp. H886–893.
F8.FUemura, R., et al. (2006). Bone marrow stem cells prevent left ventricular remodeling of ischemic heart through paracrine signaling, Circ. Res., 98 , pp. 1414–1421.
F9.FCho, H.J., et al. (2007). Role of host tissues for sustained humoral effects after endothelial progenitor cell transplantation into the ischemic heart, J. Exp. Med., 204, pp. 3257–3269.
F10.FTateno, K., et al. (2006). Critical roles of muscle-secreted angiogenic factors in therapeutic neovascularization, Circ. Res., 98, pp. 1194–
1202.
F11.FFukushima, N., et al. (2011). A crucial role of activin a-mediated growth hormone suppression in mouse and human heart failure, PLOS ONE, 6,
p. e27901.
F12.FAmado, L.C., et al. (2005). Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction, Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102, pp. 11474–11479.
F13.FDai, W., et al. (2005). Allogeneic mesenchymal stem cell transplantation in postinfarcted rat myocardium: short- and long-term effects, Circulation, 112 , pp. 214–223.
F14.FNagaya, N., et al. (2005). Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy, Circulation, 112 , pp. 1128–1135.

29
F15.FSilva, G.V., et al. (2005). Mesenchymal stem cells differentiate into an
endothelial phenotype, enhance vascular density, and improve heart
function in a canine chronic ischemia model, Circulation, 111, pp. 150–
156.
F16.FNoiseux, N., et al. (2006). Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation, Mol. Ther., 14, pp. 840–850.
F17.FGnecchi, M., et al. (2005). Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells, Nat. Med., 11, pp. 367–368.
F18.FGnecchi, M., et al. (2006). Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement, FASEB J. , 20, pp. 661–669.
F19.FMirotsou, M., et al. (2007). Secreted frizzled related protein 2 (Sfrp2) is the key Akt-mesenchymal stem cell-released paracrine factor mediating myocardial survival and repair, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,
104, pp. 1643–1648.
F20.FOrtiz, L.A., et al. (2003). Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 100, pp. 8407–8411.
F21.FOyagi, S., et al. (2006). Therapeutic effect of transplanting HGF-treated bone marrow mesenchymal cells into CCl4-injured rats, J. Hepatol., 44,
pp. 742–748.
F22.FNinichuk, V., et al. (2006). Multipotent mesenchymal stem cells reduce interstitial fibrosis but do not delay progression of chronic kidney disease in collagen4A3-deficient mice, Kidney Int., 70, pp. 121–129.
F23.FOhnishi, S., et al. (2007). Effect of hypoxia on gene expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and mononuclear cells, Stem Cells, 25, pp. 1166–1177.
F24.FOhnishi, S., et al. (2007). Mesenchymal stem cells attenuate cardiac fibroblast proliferation and collagen synthesis through paracrine actions, FEBS Lett., 581 , pp. 3961–3966.
F25.FXu, X., et al. (2005). Effects of mesenchymal stem cell transplantation on extracellular matrix after myocardial infarction in rats, Coron. Artery Dis., 16 , pp. 245–255.
F26.FAggarwal, S. and Pittenger, M.F., (2005). Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses, Blood , 105, pp.
1815–1822.
References

30 Variety of Cell Sources
F27.FOhnishi, S., et al. (2007). Transplantation of mesenchymal stem cells
attenuates myocardial injury and dysfunction in a rat model of acute
myocarditis, J. Mol. Cell. Cardiol., 42, pp. 88–97.
F28.FReinecke, H., Poppa, V., Murry, C.E., (2002). Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting, J. Mol. Cell. Cardiol., 34 , pp. 241–249.
F29.FHata, H., et al. (2006). Grafted skeletal myoblast sheets attenuate myocardial remodeling in pacing-induced canine heart failure model, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 132, pp. 918–924.
F30.FKondoh, H., et al. (2006). Longer preservation of cardiac performance by sheet-shaped myoblast implantation in dilated cardiomyopathic hamsters, Cardiovasc. Res., 69 , pp. 466–475.
F31.FSekiya, N., et al. (2009). Layered implantation of myoblast sheets attenuates adverse cardiac remodeling of the infarcted heart, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 138, pp. 985–993.
F32.FPerez-Ilzarbe, M., et al. (2008). Characterization of the paracrine effects of human skeletal myoblasts transplanted in infarcted myocardium, Eur. J. Heart Fail., 10, pp. 1065–1072.
F33.FMenasche, P., et al. (2008). The Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy (MAGIC) trial: first randomized placebo- controlled study of myoblast transplantation, Circulation, 117, pp.
1189–1200.
F34.FSuzuki, K., et al. (2004). Dynamics and mediators of acute graft attrition after myoblast transplantation to the heart, FASEB J., 18, pp.
1153–1155.
F35.FMemon, I.A., et al. (2005). Repair of impaired myocardium by means of implantation of engineered autologous myoblast sheets, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 130, pp. 1333–1341.
F36.FBergmann, O., et al. (2009). Evidence for cardiomyocyte renewal in humans, Science, 324 , pp. 98–102.
F37.FBeltrami, A.P., et al. (2003). Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration, Cell, 114, pp. 763–776.
F38.FOh, H., et al. (2003). Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100, pp. 12313–12318.
F39.FMatsuura, K., et al. (2004). Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes, J. Biol. Chem., 279, pp.
11384–11391.

31
F40.FOyama, T., et al. (2007). Cardiac side population cells have a potential
to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo, J.
Cell Biol., 176, pp. 329–341.
F41.FLaugwitz, K.L., et al. (2005). Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages, Nature, 433 , pp. 647–653.
F42.FMessina, E., et al. (2004). Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart, Circ. Res., 95 , pp. 911–921.
F43.FMatsuura, K., et al. (2009). Transplantation of cardiac progenitor cells ameliorates cardiac dysfunction after myocardial infarction in mice, J. Clin. Invest., 119 , pp. 2204–2217.
F44.FChimenti, I., et al. (2010). Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of human cardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice, Circ. Res., 106 , pp. 971–980.
F45.FMaxeiner, H., et al. (2010). New insights into paracrine mechanisms of human cardiac progenitor cells, Eur. J. Heart Fail., 12 , pp. 730–737.
F46.FUrbanek, K., et al. (2005). Cardiac stem cells possess growth factor- receptor systems that after activation regenerate the infarcted myocardium, improving ventricular function and long-term survival, Circ. Res., 97 , pp. 663–673.
F47.FReinecke, H., et al. (2008). Cardiogenic differentiation and transdifferentiation of progenitor cells, Circ. Res., 103, pp. 1058–1071.
F48.FPassier, R., van Laake, L.W., Mummery, C.L., (2008). Stem-cell-based therapy and lessons from the heart, Nature, 453 , pp. 322–329.
F49.FTakahashi, K., et al. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Cell, 131, pp. 861–872.
F50.FHattori, F., et al. (2010). Nongenetic method for purifying stem cell- derived cardiomyocytes, Nat. Methods, 7, pp. 61–66.
F51.FHidaka, K., et al. (2010). The cellular prion protein identifies bipotential cardiomyogenic progenitors, Circ. Res., 106 , pp. 111–119.
F52.FKouskoff, V., et al. (2005). Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102, pp. 13170–13175.
F53.FYan, P., et al. (2009). Cyclosporin-A potently induces highly cardiogenic progenitors from embryonic stem cells, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 379 , pp. 115–120.
F54.FYuasa, S., et al. (2005). Transient inhibition of BMP signaling by Noggin induces cardiomyocyte differentiation of mouse embryonic stem cells, Nat. Biotechnol., 23, pp. 607–611.
References

32 Variety of Cell Sources
F55.FDubois, N.C., et al. (2011). SIRPA is a specific cell-surface marker for
isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells,
Nat. Biotechnol., 29, pp. 1011–1018.
F56.FUosaki, H., et al. (2011). Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression, PLOS ONE, 6, p. e23657.
F57.FChristoforou, N., et al. (2010). Implantation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac progenitor cells preserves function of infarcted murine hearts, PLOS ONE, 5, p. e11536.
F58.FLaflamme, M.A., et al. (2007). Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts, Nat. Biotechnol., 25, pp. 1015–1024.
F59.FNelson, T.J., et al. (2009). Repair of acute myocardial infarction by human stemness factors induced pluripotent stem cells, Circulation,
120, pp. 408–416.
F60.Fvan Laake, L.W., et al. (2010). Extracellular matrix formation after transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes, Cell. Mol. Life Sci., 67 , pp. 277–290.
F61.FSingla, D.K., et al. (2006). Transplantation of embryonic stem cells into the infarcted mouse heart: formation of multiple cell types, J. Mol. Cell. Cardiol., 40, pp. 195–200.
F62.Fvan Laake, L.W., et al. (2009). Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size, Stem Cell Res., 3, pp. 106–112.
F63.FCrisostomo, P.R., et al. (2008). Embryonic stem cells attenuate myocardial dysfunction and inflammation after surgical global ischemia via paracrine actions, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 295,
pp. H1726–H1735.
F64.FFatma, S., et al. (2010). Factors Released From Embryonic Stem Cells Stimulate c-kit-FLK-1(+ve) Progenitor Cells and Enhance Neovascularization, Antioxid. Redox Signal, 13, pp. 1857–1865.
F65.FDimmeler, S. and A. Leri, (2008). Aging and disease as modifiers of efficacy of cell therapy. Circ. Res., 102 , pp. 1319–1330.

Another Random Scribd Document
with Unrelated Content

lykkäytyi, mutta sen hetkeä oli heidän aina odotettava, yöllä ja
päivällä. Neljästi kuljetutti herttua Aksel Kurjen jo mestauslavallekin
katsomaan, miten toisten Sigismundia kannattaneiden ylimysten
päät putosivat piilun iskusta, mutta neljästi hän palautti hänet sieltä
takaisin vankilaan. Kuoleman haamu ei siis ollut Kurjelle näihin
aikoihin harvinainen vieras, päinvastoin hän juuri sen seurassa vietti
aikansa. Ja vaikka hänen polvensa eivät tutisseet lavalle noustessaan
ja vaikka hänen katseensa siellä tyynesti seurasi piilukirveen
heilahdusta, niin kerta kerralta puhalsi kuitenkin kalman henki yhä
kylmemmin hänen sydämeensä ja kerta kerralta hän yhä
hartaammin toivoi, että kirves jo edellisellä käynnillä olisi katkaissut
hänenkin kaulansa. Kuoleman hyväily on tuskaa sillekin, joka siihen
on taistelutantereella tutustunut. Mutta karaistu soturi kesti sen
pitkän kidutuksen.
Kerrotaan, että kun Stålarm ja Kurki kerran, jolloin oikein
valtakunnan säädyt olivat vahvistaneet heidän kuolemantuomionsa,
olivat mestauslavalta katselleet niiden valtaneuvoksien viimeistä
polvistumista, joiden perästä heidän oli vuoro laskea päänsä pölkylle,
niin ratsasti siihen silloin herttuan sihteeri julistamaan mestauksen
keskeytettäväksi, — sitä jo verenvuodatukseen kyllästynyt kansakin
vaati. Tyyneesti silloin Suomen herrat käännähtivät ympäri, kaivoivat
taskustaan kultarahan pyövelille, joka näin oli menettänyt osan
tuloistaan, — hänen palkkansa laskettiin näet pääluvun mukaan, —
ja läksivät rauhallisesti kävelemään takaisin vankilaansa. Mutta
ennenkuin he sen ovella erosivat eri koppeihinsa, virkahti aina iloinen
Stålarm vakavalle kohtalotoverilleen:
— Mitähän arvelevat nyt herrat valtaneuvokset tullessaan
taivaaseen, kun ei meitä rupea sinne kuulumaankaan?

— Ihmettelevät kai meidän suomalaisten sitkeää henkeä, vastasi
Kurki.
— Elleivät epäile, että me olemme petoksella itsellemme armon
hankkineet.
— Ei, sitä he eivät voi epäillä, vakuutti Kurki, toverinsa kättä
puristaen. — He tietävät kyllä oman kohtalonsa johtuneen juuri siitä,
että he väliin pitivät kuninkaan, väliin herttuan puolta, —
viimemainittu ei heihin luottanut. Me taas emme ole vaihdelleet
isäntiä. — Mutta, lisäsi hän huoahtaen, melkeinpä kadehdin noita
viittä ylimystä. Heidän kärsimyksensä ovat nyt lopussa. Meidän
jatkuvat!
— Rohkeutta, veikko! Kun on henkeä jälellä, silloin on vielä
toivoakin. Näkemiin!
— Näkemiin, — ehkä samalla lavalla…
Vieläkin tapasivat toverukset todella toisensa mestauslavalla,
mutta lopuksikin säästi kuninkaaksi kruunattu herttua heidän
henkensä. Varsin todennäköisesti siihen vaikuttivat Aksel Kurjen
olettamat syyt, mutta ponnistivatpa vankien kotona olevat
maamiehetkin parhaansa pelastaakseen nämä Suomen jaloimmat
soturit. Näinä sorron aikoina olivat Suomen vallassuvut entistä
lujemmin liittyneet yhteen. Kun Kaarlo kuningas sitten, melskeiden
lakattua, taas kerran kävi rauhan miehenä Suomessa, piti hän
Helsingissä kokouksen maan aateliston kanssa. Siellä nämä muistivat
vangittuja entisiä johtajiaan, todistivat heidän hyväkseen ja anoivat
heidän vapauttamistaan. Vielä pysyi kuningas kyllä ankarana, mutta
lopultakin hän heltyi.

Kolmatta vuotta vankilassa viruttuaan ja mestauskirveen iskua
yhtä kauan odotettuaan pääsi sitten Aksel Kurki sieltä vihdoin
lähtemään vapaana miehenä. Ja taas kerran hiveli raikas merituuli
Ahvenan selällä karaistun soturin nyt kalpeita kasvoja, kun hän
jälleen keinuvan laivan kannelta suuntasi hyrskyvien laineitten ylitse
ikävöivät katseensa kotimaan lähenevää rannikkoa kohden.
* * * * *
Tähän voisikin jo päättyä Aksel Kurjen tarina. Hänen toimeliasta ja
vaiherikasta elämäänsä jatkui kyllä vielä lähes 30 vuotta ja
soturinakin oli hän vielä mukana monilla tuimilla retkillä Liivinmaalla
ja Venäjällä. Ratsastelipa hän vielä lähes 60-vuotiaana ukkona
opettajansa Pontuksen pojan, Laiskan Jaakon, vaivaloisilla matkoilla
kauas Novgrorodiin ja Moskovan tienoille asti, usein voittoisana
lipullistaan johtaen, usein häviöllekin joutuen. Mutta nämä retket
kävivät jo toisten, nuorempain sankarien nimessä. Kaarlo kuningas
pysyi näet edelleen verrattain kylmänä ja karsaana tätä entistä
vastustajaansa kohtaan, kutsuttipa hänet vieläkin pari kertaa
Ruotsista, vastaamaan häntä vastaan tehdyistä kapinahankkeista,
jotka kuitenkin osoittatuivat perättömiksi. Ja sen verran epäluuloa
asui aina Kaarlo herttuan jaloluontoisessa pojassakin niitä Suomen
miehiä vastaan, jotka Sigismundin horjuvaa valtaistuinta olivat
tukeneet, ettei heille enää Kustaa Aadolfin sodissakaan
ylipäällikkyyttä uskottu. Sotajohdossa kelpasivat kyllä edelleen monia
kokeneen Aksel Kurjen neuvot, ja kun hän rohkeine suomalaisine
ratsumiehineen karautti taistelutantereelle, niin he olivat vielä kuin
nuoria urhoja kaikki. Mutta vähitellen rupesivat sentään monissa
liemissä keitetyn sotavanhuksen voimatkin pettämään, ja
Novgrodista, jossa Jaakko Delagardie kävi kovin pitkään viipymään,

sai hän vihdoin "ruumiinsa raskauden ja sairauden takia" luvan
palata kotimaahansa.
Vihdoinkin rauhassa ja levossa Anolan ja Tottijärven kotoisilla
mailla! Sieltä päin suoritti hän kyllä vielä monia pienempiä, Kustaa
Aadolfin hänelle uskomia, luottamustoimia Suomessa ja oli
kokeneena neuvonantajana mukana kaikissa Suomen miesten
silloisissa neuvotteluissa. Mutta paljo käytetyt sotavarustuksensa
ripusti hän nyt kunniapaikalle suurtupansa seinälle ja niitä hän sitten
usein, istuessaan vanhana ja jalkavaivaisena räiskyvän takkavalkean
ääressä, katseli menneisiin muistoihinsa vaipuneena. Hän katseli
niitä kaipauksella, kun sotatorvet soivat ulkona maailman
tappotantereilla, joihin hän ei enää kyennyt mukaan, mutta katseli
niitä myös aina tyynellä ylpeydellä, sillä hän tiesi, että niihin liittyi
tahraton soturikunnia.
Vihdoin, juuri kun uusien, suurten sotain torvet taas rupesivat yhä
rajummin soimaan, vetäytyi Aksel Kurki pois elävien mailta (vuonna
1630). Hänen luunsa kätkettiin Ulvilan kirkon sillan alle, missä hänen
kuvitettu hautakivensä vieläkin osottaa monivaiheisen soturin
lepopaikan.
Santeri Ivalo.

ILOINEN KUOLEMAN
PORTEILLAKIN.
ARVID STÅLARN.
Harmaina ja ikävystyneen näköisinä olivat Turunlinnan muurit jo
vuosisatoja seisoneet siinä virran suulla, eikä kummakaan, sillä
eiväthän ne olleet sisällään nähneet muita kuin synkeitä
linnanvouteja yrmyine palkkasotureineen. Toista se oli nyt, kun
elämänhaluinen Juhana herttua iloisine hovineen oli asettunut niiden
suojiin. Siellä leikittiin, tanssittiin, kuiskutettiin ja armasteltiin
aamusta iltaan, siellä kaikuivat sekaisin suomen, ruotsin ja puolan
kielet ja helähtelivät iloiset naurun purkaukset. Ahtaissa käytävissä ja
kiertoportaissa kohisivat silkkihameet ja porttiholveissa kajahtelivat
torven toitaukset, kun nuoret ritarit huojuvin töyhdöin ajoivat
metsästysretkelle tai saattelivat herttuallisia vaunuja
Katarinanlaakson ihanaan tammipuistoon.
Sellaiseksi oli äkkiä muuttunut elämä Turunlinnassa, ja
saaristolaisista, jotka Airiston selän yli soutaen tulivat kalojaan
myömään, näyttivät nuo vanhat muurit ikäänkuin elpyneen ja
menettäneen entisen jäykkyytensä.

Mutta syrjässä tästä nuorekkaasta ja iloisesta elämästä vietti
päivänsä vanha Gunilla-muori. Hän oli herttuan entinen imettäjätär,
oli seurannut häntä Suomeen ja asuen siinä vanhan linnan
porttiholvin päällä olevassa huoneessa, jota nykyään kutsutaan
Jordanin kamariksi, hoiteli hän niitä kolmea pienokaista, jotka kaunis
Kaarina Hannuntytär oli herttualle synnyttänyt. Kaiken aikansa vietti
hän huoneessaan kutoen sukkaa, nyökytellen päätään ja puhuen
itsekseen. Hänen sanottiin tietävän tulevaisia ja ahkerasti käyttivät
hovinaiset häntä ennustajanaan.
Kerran iltahämyssä, kun kynttilöitä ei oltu vielä sytytetty ja
herttuan huoneista kaikuivat kaihomieliset luutun sävelet, pujahti
joukko hovipoikia Gunillan huoneeseen.
"Hyvä, kiltti Gunilla, ennustakaa meille", pyytelivät he valkoisia
kämmeniään ojentaen.
"Hm, hm, noin paljon nuoruutta ja iloa ja suuria toiveita", hymisi
Gunilla päätään nyökyttäen. "Miksi tahdotte nähdä tulevaisuuteen.
Elämä kyllä haihduttaa ilonne ja särkee toiveenne ja parempi on olla
siitä edeltäpäin tietämättä."
Kuitenkin tarttui hän etummaisena seisovan hovipojan käteen ja
alkoi selvitellä kämmenen viivoihin kätkettyjä salaisia asioita. Mutta
ennenkuin hän ehti loppuun, kiintyi hänen katseensa poikaan, joka
seisoi toisten keskellä, kujeillen ja vallattomasti silmiään vilkuttaen.
Se oli noin kaksitoistavuotias, kaunis, ruskeakiharainen ja
sirovartaloinen veitikka, joka ei hetkeäkään pysynyt alallaan. Kun
Gunilla oli lopettanut, ojensi ruskeakiharainen häikäilemättä kätensä
isompien toveriensa ohitse muorin eteen. Gunilla tarttui siihen oitis
ja alkoi kämmenviivoja silmäillen hiljaa viheltää ja päätään kallistella.

"No sanokaa nyt toki jotakin", hoputti poika kärsimättömästi,
"enhän minä vihellyksestä mitään ymmärrä."
"Siinä on niin paljon iloa, niin paljon, että sitä riittää vielä
kuoleman portaillakin", puhkesi viimein Gunilla.
"Ja sitä te ette raskineet heti sanoa."
"Mutta sillä ilolla on synkät varjonsakin ja parasta on, etten niitä
sinulle paljasta."
Nyt tuli koko poikajoukko kärsimättömäksi ja alkoi yhteen ääneen
vaatia
Gunillalta selitystä.
"Sinulle on Herramme antanut iloisen ja kevyen luonteen, mutta
siitä huolimatta peittyy taivaasi usein synkkiin pilviin ja sinä saat
osaksesi niittää katkeria hedelmiä toisen miehen kylvöstä. Viidesti
saat sinä katsoa kuolemaa silmästä silmään" —
"Enkä kuitenkaan kuole, sepä oivallista", keskeytti hänet poika
iloisesti.
"Hohoi, miksi lasket leikkiä niin vakavista asioista. Niin, niin,
nuorihan sinä vielä olet ja iloinen. Entäpä sinun nimesi, enhän ole
sinua ennen täällä nähnytkään?"
"Arvid Eerikinpoika Stålarm. Mutta ettehän ole vielä sanonut,
miten kuolen ja vanhanako?"
"Miksi tahdot kaikki tietää? No niin, kas tähän on kirjoitettuna
Arvid Eerikinpojan kuolema. Rauhassa vuoteellasi sinä kuolet

iäkkäänä miehenä, mutta synkkä pilvi verhoo elämäsi viimeisiä
vuosia."
"Ei, minä tahdon kuolla taistelutantereella torvien soidessa ja
voittohuutojen kaikuessa ja elämäni parhaassa kukoistuksessa.
Huonostipa ennustitte, Gunilla-muori. Mutta kiitoksia kuitenkin", ja
poika kumarsi veitikkamaisen sirosti.
"Ihminen päättää, Jumala säätää, niin, niin."
Kun pojat telmien ja meluten olivat poistuneet huoneesta, puhui
Gunilla itsekseen ja päätään nyökytellen:
"Niin kaunis ja niin iloinen, että vanhakin tuntee häntä
katsellessaan nuortuvansa. Ja kuitenkin oli hänen elämänviivaansa
merkitty niin synkeitä kohtaloita. Kyllä hän tarvitseekin kaiken
iloisuutensa niitä kantaessaan. Niin, niin. Jumala hänen askeleensa
siunatkoon."
* * * * *
Kuumasti paahtoi elokuun aurinko ja santa pöllysi hiekkaisella
tiellä, kun nääntynyt sotajoukko ponnisteli eteenpäin. Mutta siinä
ihan edessä oli jo kyläkin, pieni viheliäinen inkeriläiskylä
olkikattoisine autioksi jätettyine hökkeleineen. Siinä oli yksi ainoa
kaivo tanhualla kylänraitin päässä ja sen ympärillä syntyi suuri
tungos, kun janoon nääntyvät miehet ja hevoset tahtoivat yhtaikaa
päästä osallisiksi virkistävästä vedestä. Siinä huudettiin, riideltiin ja
tyrkittiin ja päälliköt ärjyivät käheät äänensä vieläkin käheämmiksi.
Sitä mukaa kuin miehet saivat janonsa sammutetuksi, heittäysivät
he herpaantuneina tanhualle. Pian makasi koko sotajoukko sikin

sokin maassa, hevosten hajaantuessa kaluamaan kuivia
ruohonkorsia.
"Eipä jumaliste nyt viitsisi jäsentäkään väräyttää, vaikka itse
paholainen karkaisi niskaamme", sanoivat sotamiehet.
"Mutta pian tässä alkaa hiuka entistä vimmatummin likistellä ja
silloin on pakko panna töppösensä jälleen liikkeelle", lisäsivät toiset.
Ja muonan puutteen mieleen muistuessa levisi ärtynyt mieliala yli
maassa makaavan sotajoukon. Karkeita haukkumasanoja lausuttiin
päällystöä ja esivaltaa vastaan ja äkäisimmät viittailivat jo kapinan
mahdollisuuteen, samalla kun toiset palauttivat mieliin viimetalvisen
kurjan retken Novgorodia kohti, jolloin tuhansia miehiä paleltui
kuoliaaksi.
"Siihen ei kuitenkaan meidän Arvidimme ollut syypää, yhtävähän
kuin tähän nykyiseen kurjuuteemmekaan", kuului ääniä joukosta.
"Eipä ei, mutta jokuhan tähän kuitenkin on syypää."
"Kuka joku?"
"Tietysti se vanha hamppuparta Tukholmassa."
Hamppuparralla he tarkottivat Juhana kuningasta, joka tuiki
puutteellisista varustuksista huolimatta itsepäisesti ja sovitteluihin
taipumatta jatkoi sotaa Venäjää vastaan. Tyytyväisinä siitä, että
olivat päällikköjen läsnäollessa uskaltaneet hieman sättiä kuningasta,
vaikenivat miehet, heittäytyen velttoon horrostilaan. Kuului vaan
kuorsausta täältä ja ähkimistä tuolta ja etäämpänä pärskyivät
ratsuhevoset.

Niin kului jokunen hetki. Silloin kajahti yhtäkkiä kaivon luota mitä
iloisinten luritusten koristamana "kukku-luu-luu!"
Uupuneiden ja äkämystyneiden sotamiesten suut vetäytyivät
väkisinkin naurunhymyyn. He kohosivat kuka istualleen, kuka
kyynärpäänsä varaan ja käänsivät katseensa kaivolle. Sen kannella
seisoi pölystä valkeissa ratsassaappaissaan heidän päällikkönsä,
herra Arvid Eerikinpoika, päivän paahtamilla pyöreillä kasvoillaan
mitä iloisin hymy ja ruskeissa silmissään ainainen vallaton veitikka.
Hänen koko olemuksensa aivankuin säteili hyväntuulisuutta, mikä
vastustamattomasti tarttui myrtyneeseen miehistöönkin.
"Mihinkähän se nyt aikoo meitä puijata?" kuiskasi muuan
palkkasoturi toverilleen.
"Se aikoo kai taas täyttää meidän maarumme kokkapuheillaan ja
kiitokseksi seuraamme me häntä vaikka helvetin porstuaan", vastasi
toveri.
"Hyvät veljet ja taistelukumppanit, voitteko arvata, miksi minä tällä
haavaa olen niin hyvällä tuulella?" alkoi Stålarm ja uteliaisuus sai
viimeisetkin miehistä kohoamaan istualleen. "Siksi, miehet, että
meillä on asiat niin paljon paremmin kuin niillä venäläisillä, jotka
kymmenen vuotta sitten puolustivat Paatisten linnaa. Olettehan
kuulleet, kuinka he saivat syödä heiniä, olkia, saappaita, satuloita, ja
— hyi olkoon! — kuolleita tovereitaan."
"Kohta kai tässä mekin saamme ruveta saappaitamme
nakertamaan, sillä pehmeämpää muonaa meistä ei ole kukaan sitten
eilispäivän suuhunsa pistänyt", kuului miesten joukosta uhkaava ääni
ja hymynoireet hävisivät kaikkien kasvoilta.

"Olkoon se kaukana meistä, että me moskovalaisten tavalla
rupeisimme tässä saapasnahkaa hillomaan, kun yhden ainoan
päivämarssin päässä vartoo meitä pitkät vankkurijonot, täynnä
suomalaista ruisleipää, palvattua lihaa ja kuohuvia oluttynnyreitä."
Tässä pysähtyi Stålarm ja tarkkasi hymyillen, kuinka miesten
silmiin syttyi odottava hehku ja kuinka monet heistä nielivät tyhjiä
nielauksia.
"Onkohan tuo totta vai aikookohan se ravita meitä pelkillä
tarinoilla?" huomautti puoliääneen äskeinen palkkasoturi.
"Tässä on mies, joka todistaa sanani oikeiksi", ja Stålarmin
viittauksesta astui esiin repaleihin puettu inkeriläinen talonpoika.
"Anna kuulua, mitä sinulla on tiedossasi", kehotti Stålarm ja mies
alkoi tehdä selkoa, kuinka yhden päivämatkan päässä tästä Narvaan
päin oli leirissä marski Klaus Fleming, joka vasta oli sotajoukon sekä
suuren muonakuormaston kanssa saapunut Suomesta ja odotti nyt
Virosta saapuvaa Arvid Stålarmia.
"Mutta asialla on toinenkin puolensa", lausui nyt Stålarm, "ja
ennenkuin pääsemme tuosta muonakuormastosta osalliseksi, on
meidän tehtävä huikea nappaus. Mutta mitä sanovat siihen teidän
tyhjät vatsanne?"
"Me hajotamme vaikka kohonaisia vuoria maahan, päästäksemme
ruokaan käsiksi", huusivat miehet.
"No sitten ei hätääkään ja meidän asiamme ovat kuin ovatkin
paremmin kuin niiden Paatisten linnan venäläisten."

"Mutta mitä meidän on tehtävä?" utelivat sotamiehet
maltittomasti.
"Pyyhkäistävä tieltämme venäläinen sotajoukko, joka on kiilana
tunkeutunut meidän ja Flemingin väliin, estääkseen meitä
pääsemästä siunatun leivän kimppuun."
Stålarm viittasi sanantuojalle, joka kertoi omin silmin nähneensä
ison venäläisen sotajoukon muutaman tunnin matkan päässä tästä
Flemingin leiriä kohti.
Siinä tuokiossa oli koko sotajoukko jalkeillaan. Raivostuneet äänet
huusivat:
"Pois edestä tien tukkeet! Hiiteen ryssät! Maahan joka sorkka!"
"Te olette siis valmiit taisteluun?" kysyi Stålarm.
"Vaikka pirua vastaan tässä tapauksessa", vastasivat sotamiehet.
"Ei muuta kuin eteenpäin vaan!"
Hetken kuluttua alkoivat rummut päristä, päälliköt ja ratsuväki
asettuivat satuloihinsa ja nälän vimmaama sotajoukko lähti liikkeelle
täydessä taistelujärjestyksessä.
"Enpä olisi uskonut, että muonan puute ja nälkäkin voivat väliin
näin suuria matkaan saattaa, sillä ilman sitä olisimme varmaankin
paljon pienemmillä voiton toiveilla marssineet tähän taisteluun",
virkkoi Stålarm rinnallaan ratsastavalle Otto Ykskylälle.
"Mutta oikeasta langasta sinä osasitkin nykiä heitä taisteluun",
vastasi Ykskylän parooni.

Äskeinen palkkasoturi taasen virkkoi vieruskumppanilleen, heidän
marssiessaan pölyistä tietä eteenpäin:
"Arvasinhan minä, että jotain tällaista sillä oli mielessä, kun se
sieltä kaivonkannelta alkoi meille kompailla."
"Ja arvasinhan minäkin, että me olemme heti valmiit häntä
seuraamaan", kehasi hänen kumppaninsa.
Taistelu ei kestänyt kauan, mutta se oli sitä raivoisampi. Kun
aurinko oli painunut puiden latvojen tasalle oli venäläinen sotajoukko
hajoitettu ja kokonaista kuusituhatta miestä makasi heistä
kaatuneina tantereella. Heidän päällikkönsä, ruhtinas Wladimir
Dolgoruki, oli joutunut vangiksi ja voittajain haltuun oli myöskin
jäänyt venäläisten kuormasto, jonka kimppuun nyt Stålarmin
sotamiehet kävivät nälkäisen ihmisen koko silmittömyydellä.
Tämän loistavan voittonsa saavutti Arvid Stålarm elokuussa v.
1591. Hän oli silloin neljänkymmenenkahden vuotias ja oli kokenut jo
monia soturivaiheita sekä maalla että merellä. Jo vähän päälle
parinkymmenen vanhana oli hän ratsumestarina ottanut osaa
Venäjän sotaan, kohoten sen jälkeen aste asteelta yhä ylempiin
sotilasarvoihin. Vuosi tämän Inkerissä saamansa voiton jälkeen hänet
nimitettiin Narvanlinnan komentajaksi. Mutta niistä ajoin alkoivat
hänelle ne vastatuulet ja pilviset säät, joista vanha Gunilla-muori
Turunlinnassa oli ennustanut.
"Kaalia ja limppua! Limppua ja silavaa!" huutelivat ryssät
Ivangorodin eli Jaanin linnan muureilla, ärsyttääkseen niitä
suomalaisia palkkasotureita, jotka joen takana Narvan linnan
muureilla käyskelivät vartioina.

"Koira syököön teidän viheliäisen kaalinne, te saapasnahkan
nielijät!" huutaa rämähytti pitkäviiksinen arpipää suomalainen. "Jollei
teillä ole sen parempaa suuhun pantavaa, niin tulkaa tänne, täällä
saatte mahanne täyteen häränpaistia ja hernerokkaa ja kurkkunne
saatte viruttaa ruskealla oluella."
"Mitä, vieläkö teillä on jälellä sitä homehtunutta leipää ja niitä
mädäntyneitä sillejä?"
"Suus kiinni, koirankuonolainen, ja muista, että sinua odottaa
illalliseksi vanhoista satulavöistä keitetty liemi."
Vuotta aikaisemmin kuin Stålarm tuli Narvan linnan isännäksi oli
vieressä oleva Jaaninlinna pakkosovinnon kautta joutunut
venäläisille. Milloin ammunta ja muut sotatoimet aselevon tai muiden
seikkojen takia olivat seisauksissa, silloin kuluttivat sotilaat
kummallakin puolen aikaansa härnäilemällä ja haukuskelemalla
toisiaan joen yli. Se kuvasi pienoiskoossa koko tätä Juhana
kuninkaan pitkällistä ja tuhoisata venäläissotaa. Vuorotellen tehtiin
kummaltakin puolen laajoja hävitysretkiä toistensa alueille, sitten
oltiin uupuneina joitakin aikoja alallaan ja sillä aikaa vaihtelivat
molemmat hallitsijat, Juhana kolmas ja Iivana Julma, sapekkaita
haukkuma- ja sinuttelukirjeitä.
"Hitostako nuo koirat tuolla toisella puolen tietävät, että meillä on
syötävänä homehtunut leipä ja mädäntyneet sillit?" murahti
pitkäviiksinen suomalainen toverilleen.
"Kysyä sitä", vastasi toinen, "kun meiltä miltei joka yö lähtee
miehiä karkuun. Ja mitä siihen homehtuneeseen leipään sekä
silleihin tulee, niin kuulinpa kuiskeita, että sitäkään herkkua ei ole
enää moneksi päivää jälellä."

"Ja palkkamme on kohta puolelta vuodelta saamatta. Saatana,
jollei tästä pian tule loppua, niin tuonne kaalikeiton ja limpun ääreen
tästä minäkin livistän, sen totta jukolisti teenkin, ennenkuin rupean
niiden Paatisten ryssäin tavalla järsimään vanhoilla saappailla
höystettyjä heiniä."
Kun pitkäviiksinen tovereineen palasi vartiovuoroltaan, tapasi hän
linnanpihalla miltei koko varusväen hyvin kiihtyneessä mielentilassa.
Sotilaat olivat saaneet kuulla, että se viheliäinen muona, jolla heitä
oli viime viikot ruokittu, oli loppumaisillaan. Turhaan kokivat
saapuvilla olevat alemmat päälliköt saada heitä tyyntymään
lupauksilla pian saapuvista muona- ja rahalähetyksistä. Nälistyneet ja
ärtyneet miehet huusivat kiroillen, että heitä oli jo tarpeeksi asti
syötetty tyhjillä lupauksilla. He uhkasivat huomispäivänä jättää joka
sorkka linnan, ellei heille siihen mennessä maksettaisi saamatta
olevia palkkoja sekä hankittaisi parempaa muonaa. Ja siten hetken
huudettuaan ja meluttuaan ryhtyivät he keskuudestaan valitsemaan
miehiä, joiden piti mennä esittämään linnankomentajalle nämä
heidän vaatimuksensa.
Tällä kertaa istui komentaja paksuseinäisessä tornikammiossa,
jonne ei pihalta kaikuva melu päässyt tunkeutumaan. Hän istui
laajan kirjoituspöydän ääressä ja sinetöitsi parhaillaan kolmea
kirjettä. Suuren uunin lähellä toisella puolen pöytää istuivat hänen
veljensä Akseli sekä tämän ikätoveri Klaus Boije, jotka palvelivat
linnassa Stålarmin alapäällikköinä.
"Kolmas toden tekee, sanotaan, ja tässä on nyt lähdössä
kolmannen kerran kolme kirjettä kolmelle eri henkilölle, siis
kolmikertainen kolmen luku", alkoi Stålarm. "Kolme kertaa kolme on
yhdeksän, ja niin monella naulallahan meidän Herramme, joka on

yksi jäsen kolmiyhteydessä, kiinnitettiin ristinpuuhun. Meillä on siis
kaikki syyt odottaa mitä suosituimpia tuloksia avunhuudoistamme.
Jos vanha kolmiluku pitää paikkansa, niin me saamme apuvaroja
oikein koron kanssa ja silloin nämä paastopäivät ovat lopussa."
"Luulenpa, että nälkä on tehnyt sinut taikauskoiseksi", huomautti
nuorempi veli. "Mutta oletko laatinut kirjeesi kyllin tepsivään
muotoon?"
"Niinpä luulisin. Kas tässä ensimäisessä, joka on osotettu Noki-
Klaulle — sillä nimellähän talonpojat siellä kotona häntä
hemmottelevat — kerron minä, että meillä parin päivän perästä on
syötävänä saapasnahka ja satularemmit ja ellei tänne toimiteta
pikaista apua, tahdon minä mieluummin elää susilaumassa kuin olla
nälästä kiukkuisen ja kapinallisen linnan väen päällikkönä. Tässä
toisessa taas, joka menee herttualle Ruotsiin, minä kuvailen
hätäämme yhtä synkeäksi sekä samalla nurisen, ettei Fleming
Suomesta ole toimittanut meille minkäänlaista apua. Ja
kolmannessa, joka on kirjoitettu hänen korkeasti katoliselle
majesteetilleen Puolaan, minä jatkan nurinaa siitä, ettei meidän
herttua Ruotsissa ole välittänyt mitään meidän auttamisestamme.
Tämä minun nurinani se on, hyvät herrat, johon minä kaiken toivoni
perustan."
Hän hymyili ja katsoi vuoroin kumpaakin silmiin.
"Mutta jospa he joskus lukisivat toisilleen nuo kirjeesi, niin saisitpa
totisesti laittaa kaulaluusi valmiiksi", huomautti hänen veljensä.
"Sitä he eivät tässä elämässä tee, sillä siksi suuri juopa on heidän
välilleen asetettu, ja toisessa elämässä taas heillä itsekullakin lienee

siksi paljon tilitettävää, etteivät he jouda muistelemaan erään
piskuisen herra Arvidin kirjeitä."
"Mutta entäpä joku jälkeentulevaisistamme saisi käsiinsä nuo
kaikki kolme kirjettä, niin kyllä maar hän pudistaisi päätään ja
arvelisi, että olipa siinä kiero mies."
"Kun vatsamme on pintehissä, niin emmepä jouda juuri
jälkimaailman arveluita ottamaan laskuihimme. Ja tämä oli kaiketikin
paras keino saada heidät liikkeelle, sillä paljon mieluisampaa heille
on saattaa harmia toisilleen kuin muistaa meitä poloisia täällä
maailman nurkkapielessä. Nyt sinun on toimitettava nämä
kiiruimmiten matkalle ja sitten meillä ei ole muuta tehtävää kuin
viskata sääremme seinälle ja odottaa avuntuloa."
Stålarm ojensi kirjeet veljelleen. Samassa kuului kolinaa oven
takaa ja sisään astui viisi palkkasoturia, joista jokainen edusti eri
kansallisuutta. Stålarm kohotti kysyvästi kulmiaan, mutta ennenkuin
miehet ennättivät suutaan avata, alkoi hän hymyillä ja virkkoi:
"Minä arvaan, että te tulette pyytämään eroa palveluksestanne.
Sen te saattekin kahden viikon perästä, sillä silloin saapuu tänne
apuväkeä, muonaa ja rahaa. Ja koska teillä on monen kuun palkka
saamatta, niin tahdonpa tehdä jotakin siinä suhteessa, että tulisitte
vielä nämä kaksi viikkoa toimeen."
Hän poistui kiiruusti huoneesta ja sotamiehet alkoivat hämillään
kuiskailla keskenään.
"Kas tässä", virkkoi Stålarm palattuaan ja viittasi leveään
tarjottimeen, jonka hänen perässään tullut palvelija laski pöydälle.
"Tässä ovat kaikki minun pöytähopeani ja muut kalleuteni. Niitä

katselemalla minä viime aikoma olen ravinnut itseäni, mutta nyt
luovutan minä ne teille. Viekää ne kaupunkiin, vaihettakaa rahaksi ja
jakakaa rahat keskenänne. Sillä te tulette kaksi viikkoa hyvin
toimeen. Kas niin, menkää nyt toverienne luokse ja onneksenne
olkoon."
Hän työnsi tarjottimen etumaisen miehen syliin ja avasi oven.
Neuvottomina ja mutisten poistuivat sotilaat.
"Sic transit gloria mundi", virkahti Stålarm ja istahti pöydän
viereen. "Siellä menevät nyt kilisten ja kalisten minun aarteeni ja
tämän jälkeen me saamme syödä tyhjää tinavadeista. Mutta käyhän
se laatuun sekin, luulen ma."
Hänen silmistään vilkkui ainainen hymy ja toiset katsoivat häneen
ihmeissään.
"Mutta entäpä kahden viikon kuluttua kaikki onkin ennallaan ja
nuo samat miehet ilmestyvät jälleen tuohon oven suuhun, mitä sinä
silloin heille tarjoat odottajaisiksi?" kysyi hänen veljensä.
"No vaikkapa esimerkiksi pääni, ja elleivät siihen tyydy, lähtekööt,
sitten herran nimeen matkoihinsa. Minä itse pudistan myös Narvan
tomut jaloistani ja lähden Warsovaan tekemään herralleni
kuninkaalle tiliä toimistani."
Stålarm sai kun saikin hyvissä ajoin apua ja vaikka nuo
avunlähetykset aina olivatkin puolinaiset ja riittämättömät, voitiin
Narvanlinnassa, kiitos päällikön liukkauden ja keinokkuuden,
jotenkuten elää kihnutella päivästä toiseen. Puutetta ja sotaväen
kinasteluja jatkui edelleenkin, mutta aina tiesi niistä Stålarm
joustavuudellaan selviytyä.

Rauha Venäjän kanssa oli tehty Täyssinässä v. 1595, mutta se ei
suurestikaan lieventänyt Stålarmin ja hänen linnaväkensä asemaa
niinkauan kuin rauhanehtoja ei Ruotsin puolelta täytetty
luovuttamalla Käkisalmen linnaa läänineen takaisin venäläisille. Kun
Stålarm odotukseen kyllästyneenä vihdoin kevättalvella 1597 lähti
itse Suomeen, jouduttaakseen Käkisalmen luovuttamista, kohtasi
häntä Viipurissa sanoma Klaus Flemingin kuolemasta. Turkuun
rientäessään tapasi hän siellä Suomen aateliston neuvottelemassa
asiain tilasta. He eivät laskeneet Stålarmia enää takaisin Narvaan,
vaan pyysivät häntä asettumaan marski-vainajan tilalle johtamaan
Suomen asioita. Niin oli myöskin kuninkaan tahto, sillä myöhemmin
kesällä saapui häneltä kirjelmä, jolla Stålarm määrättiin Suomen
käskynhaltiaksi ja ylimmäksi sotapäälliköksi.
"Nyt alkoi siis se aika, jolloin minun on korjattava karvaita
hedelmiä toisen miehen kylvöstä", virkkoi Stålarm tämän
määräyksen saatuaan. "Mutta eipä minua ole Narvassa juuri makean
leivän päiville totutettu."
* * * * *
Oli sydänyö syyskuun yhdeksättä päivää vasten vuonna 1599.
Turunlinna, jonka muureilla pitkin päivää olivat tykit jyrähdelleet,
lepäsi äänetönnä pimeän peitossa. Uuden linnan pihaa valaisivat
kuitenkin useat lyhdyt ja siellä paukkuivat vasarat sekä kitisivät
sahat, kun sotilaat rakensivat puisia varustuksia siltä varalta, että
herttuan väen onnistuisi tunkeutua linnan etuvarustusten läpi. Pihan
reunasta kohosi vanhan linnan pääty jylhänä ja pimeänä,
lukuunottamatta yhtä tornihuoneen ikkunaa, josta pilkotti tuli.
Mainitussa huoneessa olivat koolla Arvid Stålarm, marski-vainajan
poika, Juhana Fleming, skotlantilaisten palkkasoturien päällikkö

William Rutwen, sekä joukko muita päälliköitä. Stålarm istui pöydän
ääressä ja kiidätti kuumeisella kiireellä hanhenkynää leveällä
paperiarkilla. Toiset keskustelivat kuiskaamalla.
"Amen!" virkkoi Stålarm ja laski kynän kädestään. "Kuulkaahan nyt
tätä viimeistä avunhuutoamme."
Hän luki kuningas Sigismundille osotetun kirjeen, jossa tehtiin
selkoa heidän tukalasta asemastaan ja luvattiin, jos Viipurista käsin
odotettu apujoukko piammiten saapuisi, puolustaa linnaa, kunnes
hänen majesteettinsa suuremmilla voimilla ehtisi heidän avukseen.
Kun kaikki olivat hyväksyneet kirjeen, kirjoittivat he toinen toisensa
jälkeen nimensä sen alle.
"Ellei apua ajoissa saavu, niin —"
"Silloin me räjähytämme linnan ilmaan, kuten olemme
päättäneet", täydensi nuori Fleming Stålarmin lauseen.
"Niin juuri."
Kaikkien kasvoilla näkyi synkkä päättäväisyys. Tällöin kuului oven
takaa arka koputus. Stålarmin käskystä astui sisään jalkamiesosaston
päällikkö Sipi Sipinpoika, kasvoillaan hätääntynyt ilme. Hänen
kintereillään seurasi kalpea ja nääntyneen näköinen huovi.
"Akseli Kurjen ratsupalvelija!" huudahti Stålarm. "Kuinka sinä
tänne olet päässyt ja minkälaisia sanomia sinä tuot?"
Ratsumies kertoi, kuinka herttua toista viikkoa sitten oli Marttilassa
voittanut ja hajoittanut Akseli Kurjen johtaman suomalaisten
pääjoukon. Itse Kurki oli paennut Viipuria kohti ja hän, palvelija oli

monien yritysten jälkeen onnistunut piirittäjäin läpi hiipimään tänne
linnaan.
"Kurjen häviö Marttilassa oli siis sittenkin totta", lausui Stålarm
synkästi ja kaikkiin heihin näkyi tieto vaikuttavan herpaisevasti.
"Entäs apujoukko, eikö sinulla sen saapumisesta ole mitään
tietoa?" kysyi Stålarm hetken kuluttua.
"Sellaisesta minä en ole mitään kuullut", vastasi huovi, "ja jos se
olisikin tulossa, niin ei se voisi tänne päästä, sillä herttua on
sotaväellään tukkinut kaikki Viipuriin johtavat tiet."
Seurasi painostava äänettömyys. Yhtäkkiä kohotti Stålarm päänsä
ja sanoi Sipi Sipinpoikaan kääntyen:
"Ovatko työt linnanpihalla päättyneet vai miksi moukaroiminen ja
sahaaminen on yhtäkkiä laannut."
Puhuteltu riensi ulos ja kun hän jälleen ilmestyi ovensuuhun, oli
hänen kasvoillaan askeistakin hätääntyneempi ilme.
"Sotamiehistä on osa karannut piirittäjäin puolelle ja toiset ovat
työnsä jättäen kokoontuneet neuvottelemaan", ilmoitti hän.
"Päällikköjen käskyistä eivät he ole millänsäkään."
Stålarm nousi seisomaan ja alkoi vihellellä. Hän otti kuninkaalle
aiotun kirjeen ja punnittuaan sitä hetken kädessään kysyi Juhana
Flemingiltä:
"Eikö teistäkin rex crastinus ole sattuva nimitys kuningas
Sigismundille? Kuningas huomispäivä eli huomispäivän kuningas, sillä

hän myöhästyy aina ja joka paikasta. Meitä poloisia, jotka olemme
niin uskollisesti palvelleet sellaista etanamajesteettiä!"
Flemingin hienopiirteisille ja kalpeille kasvoille levisi heleä puna ja
hän oli antamaisillaan kiivaan vastauksen, mutta Stålarmin silmiin
ilmestynyt synkkä tuli, jota niissä ei oltu ennen nähty, pidätti häntä.
Mitään puhumatta repi Stålarm kirjeen pieniksi palaisiksi, minkä
jälkeen hän rauhallisesti lausui:
"Hyvät herrat, käykää levolle, sillä muuta tekemistä meillä ei tässä
enää ole. Minä itse menen alas puhuttelemaan sotamiehiä."
Saatuaan miehiltä lupauksen pysyä uskollisesti asemillaan
huomiseen saakka, palasi Stålarm huoneeseensa ja vietti koko
loppuyön kävelemällä edestakaisin lattialla. Kun hän päivän
valjetessa tuli ulos vilvotellakseen raskasta päätään, osui hänen
katseensa ensimäisenä Salomon Illen mestattuun päähän, joka näkyi
seipään nenässä Korpolaisvuorella. Samassa paikassa oli kuusi
muuta päätä. Ne olivat Kastelholmassa aikaisemmin vangiksi
joutuneita päälliköitä, jotka amiraali Scheel muutamia päiviä sitten
oli herttuan käskystä mestauttanut ja asettanut päät tuonne
vuorenlaelle linnalaisten pelotteeksi.
"Kas siinä viittaus, mikä palkka meitä poloisia odottaa
uskollisuudestamme kuningasta kohtaan", virkkoi Stålarm itsekseen.
Kun linnan puolustamista ei käynyt enää ajatteleminen, ryhdyttiin
samana päivänä keskusteluihin piirittäjäin kanssa. Tuloksena oli, että
linnan puolustajat toista viikkoa kestäneen aselevon jälkeen
antautuivat herttuan armoille.
* * * * *

Seuraavan maaliskuun 20:tena päivänä astui Lindköpingin
linnanportista ulos surullinen saattue. Sen muodostivat joukko
ruotsalaisia valtaneuvoksia, jotka Sigismund Stångjoen tappelun
jälkeen oli jättänyt uhriksi Kaarlo-herttuan vihalle, sekä suomalaiset
Arvid Stålarm ja Akseli Kurki. Tiheän piikkimetsän saartamana
kulkivat he kohti kaupungin toria, jossa heitä odotti punapukuinen
pyöveli apureineen ja leveäteräisine miekkoineen. Saattuetta
seurasivat valtakunnan säädyt, jotka herttuan painostuksesta paria
päivää aikaisemmin olivat tuominneet edellämainitut herrat
kuolemaan. Kun mitkään esirukoukset ja kyyneleet eivät olleet
saaneet herttuata taivutetuksi antamaan armon käydä oikeuden
asemesta, piti tuomio tänään pantaman täytäntöön.
Tämä oli jo neljäs kerta, kun Stålarm sai keihäsmetsän keskellä
astua mestauspaikalle. Ensi kerran oli hänet tuomittu kuolemaan
Turussa linnan antauduttua. Hän oli silloin herttuan eteen polvistuen
pyytänyt, että herttua tyytyisi yksinomaan hänen päähänsä, sillä
toiset Suomen herrat olivat ainoastaan noudattaneet hänen,
ylimmän päällikön, käskyjä. Tästä huolimatta oli heidät kaikki
tuomittu kuolemaan ja telotettu — paitsi Stålarmia ja Kurkea, jotka
oli vankeina kuletettu Ruotsiin enempiä tutkimuksia varten. Kahdesti
heidät oli sitten Tukholmassa viety mestauslavalle, mutta
kummallakin kerralla olivat he niine hyvineen saaneet palata takaisin
vankilaan. Jälkimäisellä kerralla oli Stålarmin vanha iloisuus
odottamatta pulpahtanut esiin. Nähdessään kaikissa ikkunoissa
katsomaan kerääntyneitä naisia, oli hän ottanut hatun päästään ja
sirosti kumarrellen lausunut: "Minä olen aina etsinyt naisväen
suosiota. Jos te nyt esirukouksillanne hänen ruhtinaallisen armonsa
edessä voisitte minut pelastaa tästä pälkähästä, niin olisin minä ikäni
kaiken teidän nöyrin palvelijanne."

Mutta saattue saapui pienen kaupungin torille, joka oli ääriään
myöten täynnä katsojia. Rukoiltuaan, veisattuaan ja hyvästeltyään
onnettomuustoverinsa polvistui maahan levitetylle punaiselle
vaatteelle ensimäisenä vanhin valtaneuvoksista, Gustaf Banér.
Kerrotaan, että kun hänen päänsä putosi, teki hänen ruumiinsa
liikkeen ikäänkuin tahtoen kavahtaa vielä kerran seisoalleen. Kun
neljäs valtaneuvoksista, komea ja uljas Tuure Bjelke, joka ilman
pienintäkään pelonvärettä kasvoissaan tai äänessään piti kauas
kaikuvan puheen omansa ja toveriensa syyttömyyden puolesta, oli
päätönnä vaipunut punaiselle matolle, oli Arvid Stålarmin vuoro
astua esiin. Mutta kun hän vuorostaan varustausi puhetta pitämään,
astui herttuan kirjuri Erik Göransson esiin ja luki herttualta juuri
saapuneen kirjelmän, jossa Stålarmille ja Kurjelle luvattiin armahdus,
jos säädyt siihen suostuvat. Silloin huusi ympärillä seisova
kansanjoukko: "On jo kylliksi verta, kylliksi verta! Armoa! Armoa!"
Stålarm otti hatun päästään ja kumarrellen joka puolelle kiitti
kansanjoukkoa. Sitten pisti hän kätensä taskuun ja ojentaen
pyövelille kymmenen taaleria lausui:
"Kas tässä ystäväni, pieni korvaus siitä ansion vähennyksestä,
mikä sinua kohtasi, kun et saanut minun päätäni listiä."
Astellessaan suomalaisen kohtalotoverinsa kanssa vartiain keskellä
takaisin linnaan, tähysti Stålarm kohti keväisiä pilviä ja puhkesi
yhtäkkiä surumielisen iloisesti sanomaan:
"Siellä mahtavat nyt herrat valtaneuvos-vainajat ihmetellä, että
minnekä se Stålarm jäi, kun ei tullutkaan meidän perässämme
taivaaseen."
* * * * *

Kaksi vuotta vielä vankeudessa istuttuaan pääsivät Stålarm ja
Kurki Suomen aateliston esirukousten johdosta vihdoin vapaaksi ja
edellinen sai Itä-Suomen laamannin viran. Mutta kun hän vähän sen
jälkeen toimi sotapäällikkönä Liivinmaalla, joutui hän erään
onnettoman taistelun takia uudestaan herttuan vihoihin ja kuljetettiin
vankina Tukholmaan, jossa hänet nyt viidennen kerran tuomittiin
kuolemaan. Tällöin pyysi Stålarm, ettei häntä, vanhaa soturia
telotettaisi, vaan annettaisiin sotaväenosaston hänet ampua ja että
hänen ruumiinsa pääsisi silpomatta hautaan. Niinikään pyysi hän,
ettei hänen omaisuuttaan anastettaisi kruunulle, vaan että se
käytettäisiin hänen velkojensa maksamiseen. Kuolemantuomiota ei
kuitenkaan pantu tälläkään kertaa toimeen, vaan muutettiin se
elinkautiseksi vankeudeksi.
Kokonaista kuusitoista vuotta sai hän sitten virua Gripsholman
linnassa — samassa, jossa onneton Eerik-kuningaskin oli vankina
istunut. Elämä kulki edelleen, maailman tapaukset seurasivat
toisiaan, ankara Kaarlo-kuningas muutti manan majoille ja hänen
poikansa Kustaa Adolf hankki sotapäällikön taitonsa niillä samoilla
kentillä, joilla Arvid Stålarm nuoruusvuosinaan oli iloisena ja
riehakkana miekkaansa heiluttanut — mutta yhä virui Stålarm
yksinäisenä ja unhotettuna Gripsholman muurien sisällä. Vasta
seitsenkymmenvuotiaana harmaapäänä tuo lahjakas ja iloinen
ylimys, joka polveutui Tavastien ikivanhasta ja supisuomalaisesta
suvusta, pääsi ikuiseen lepoon. Kuten monen muunkin kuuluisan
suomalaisen, sai Ruotsinmaa kunnian kätkeä poveensa Stålarminkin
maalliset jäännökset. 28 p. toukok. 1620 haudattiin hänen ruumiinsa
Keruban kirkkoon.
Kyösti Wilkuna.

TALONPOIKAINEN RATSUMESTARI.
TUOMAS TEPPOINEN.
"— — Ja että Teidän kunink. majesteettinne saisi
paremman käsityksen siitä, missä tämä minun seurakuntani
sijaitsee, niin mainitsen, että se on siellä, missä Tuomas
Teppoinen asuu."
Muolan papin kirjeestä Juhana III:lle.
Moniksi vuosiksi oli ympäri valtakunnan riittänyt ihmisille
ilonaihetta siitä, kuinka moskovalaisten tsaari oli aikoinaan kosinut
nykyistä kuningatar Katariinaa ja kuinka Puolan röyhkeät herrat
olivat hänelle kosiomiesten mukana lähettäneet silkkiin ja samettiin
pyntätyn vanhan valkoisen tammakopukan. Mutta tämä hupaisa
juttu uhkasi nyt vuosien kuluttua kasvattaa kovin karvaita hedelmiä.
Tiedettiin, että oikullinen, juonikas ja raivopäinen Iivana-tsaari,
jota hänen alamaisensa olivat selän takana alkaneet nimitellä
Julmaksi, oli pyytänyt Eerik kuningasta lähettämään Katariinan
hänelle, mutta kuinka tästä ei tullut mitään Eerikin jouduttua
valtaistuimelta tyrmään. Kun hänen sijaansa oli noussut Juhana-veli,

Welcome to our website – the ideal destination for book lovers and
knowledge seekers. With a mission to inspire endlessly, we offer a
vast collection of books, ranging from classic literary works to
specialized publications, self-development books, and children's
literature. Each book is a new journey of discovery, expanding
knowledge and enriching the soul of the reade
Our website is not just a platform for buying books, but a bridge
connecting readers to the timeless values of culture and wisdom. With
an elegant, user-friendly interface and an intelligent search system,
we are committed to providing a quick and convenient shopping
experience. Additionally, our special promotions and home delivery
services ensure that you save time and fully enjoy the joy of reading.
Let us accompany you on the journey of exploring knowledge and
personal growth!
ebookultra.com

Myocardial Tissue Engineering 1st Edition Tatsuya Shimizu

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Myocardial Tissue Engineering 1st Edition Tatsuya Shimizu

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 5

Slide 6

Slide 7

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 17

Slide 19

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 35

Slide 36

Slide 37

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Slide 66

Slide 67

Slide 68

Slide 69

Slide 70

Slide 71

Slide 72

Slide 73

Slide 74

Slide 75

Slide 76

Slide 77

Slide 78

Tags

Categories

Download