Nucleic Acid Aptamers Selection Characterization And Application Gnter Mayer

Nucleic Acid Aptamers Selection Characterization
And Application Gnter Mayer download
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-aptamers-selection-
characterization-and-application-gnter-mayer-5229626
Explore and download more ebooks at ebookbell.com

Here are some recommended products that we believe you will be
interested in. You can click the link to download.
Nucleic Acid Aptamers Selection Characterization And Application 2nd
Edition 2nd Gnter Mayer
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-aptamers-selection-
characterization-and-application-2nd-edition-2nd-gnter-mayer-46272850
Nucleic Acid And Peptide Aptamers Methods And Protocols 1st Edition
Shawn K Piasecki
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-and-peptide-aptamers-
methods-and-protocols-1st-edition-shawn-k-piasecki-2533872
Nucleic Acid Detection And Structural Investigations Methods And
Protocols 1st Kira Astakhova
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-detection-and-structural-
investigations-methods-and-protocols-1st-kira-astakhova-47712446
Nucleic Acid Detection 2013th Dmitry M Kolpashchikov Yulia V
Gerasimova
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-detection-2013th-dmitry-m-
kolpashchikov-yulia-v-gerasimova-47776690

Nucleic Acid Biology And Its Application In Human Diseases Subhrangsu
Chatterjee
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-biology-and-its-
application-in-human-diseases-subhrangsu-chatterjee-49839080
Nucleic Acid Transfection Wolfgang Bielke Christoph Erbacher
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-transfection-wolfgang-
bielke-christoph-erbacher-52873846
Nucleic Acid Switches And Sensors Molecular Biology Intelligence Unit
1st Edition Scott K Silverman
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-switches-and-sensors-
molecular-biology-intelligence-unit-1st-edition-scott-k-
silverman-2006766
Nucleic Acid Architectures For Therapeutics Diagnostics Devices And
Materials Afonin A Kirill
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-architectures-for-
therapeutics-diagnostics-devices-and-materials-afonin-a-
kirill-36372128
Nucleic Acid Therapeutics In Cancer A M Gewirtz
https://ebookbell.com/product/nucleic-acid-therapeutics-in-cancer-a-m-
gewirtz-4111588

Nucleic Acid
Aptamers
Günter Mayer Editor
Selection, Characterization,
and Application
Methods in
Molecular Biology 1380

METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
Series Editor
John M. Walker
School of Life and Medical Sciences
University of Hertfordshire
Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB , UK
For further volumes:
http://www.springer.com/series/7651

Nucleic Acid Aptamers
Selection, Characterization, and Application
Edited by
Günter Mayer
University of Bonn, Bonn, Germany

ISSN 1064-3745 ISSN 1940-6029 (electronic)
Methods in Molecular Biology
ISBN 978-1-4939-3196-5 ISBN 978-1-4939-3197-2 (eBook)
DOI 10.1007/978-1-4939-3197-2
Library of Congress Control Number: 2015956601
Springer New York Heidelberg Dordrecht London
© Springer Science+Business Media New York 2016
This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, speciﬁ cally the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction
on microﬁ lms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not
imply, even in the absence of a speciﬁ c statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and
regulations and therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to
be true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty,
express or implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.
Printed on acid-free paper
Humana Press is a brand of Springer
Springer Science+Business Media LLC New York is part of Springer Science+Business Media (www.springer.com)
Editor
Günter Mayer
University of Bonn
Bonn , Germany

v
Aptamers are short, single chained nucleic acids that fold into a well-deﬁ ned three-
dimensional shape, upon which a target molecule is recognized by high afﬁ nity and speciﬁ c-
ity. Since their very ﬁ rst description in 1990, a plethora of aptamers have been developed,
characterized, and applied. Aptamers that recognize small molecules, proteins, and even
targets on cell surfaces have been selected and applied for different purposes. Within the last
decade, aptamers have become more and more popular, and their sophisticated biophysical
properties together with their ability to be easily modiﬁ ed and, thus, adapted to various
regimens make them a very promising class of compounds.
This book intends to provide protocol references covering recent developments in the
aptamer ﬁ eld. It is subdivided into three parts reﬂ ecting the aptamer generation process,
namely the selection, characterization, and ﬁ nally the application of aptamers.
The selection part covers methods to isolate aptamers recognizing small molecules
(Chapter 1 ) or to target molecules presented or embedded on cell surfaces (Chapters 2 and
3 ). In Chapter 4 , the implementation of novel, noncanonical base pairs for generating new
types of aptamers is described. A protocol for Capillary Electrophoresis-based selection
schemes ( CE-SELEX ), an emerging approach to allow the generation of aptamers for non-
tagged and non-immobilized target molecules, is given in Chapter 5 . The ﬁ rst part of this
volume of the Methods in Molecular Biology series is rounded out by two consecutive chap-
ters dealing with Next Generation Sequencing for the thorough analysis of individual selec-
tion experiments (Chapters 6 and 7 ).
The second part covers a series of analytical methods to assess biophysical properties
of aptamer–target interactions. This part contains protocols describing MicroScale
Thermophoresis (Chapter 8 ), isothermal titration calorimetry (Chapter 9 ), and ﬂ ow
cytometry (Chapter 10 ) as means to measure dissociation constants and to address speci-
ﬁ city of aptamers in regard to cognate ligand recognition. Chapter 11 covers methods to
perform in vivo imaging of tissue-speciﬁ c aptamers, whereas Chapter 12 provides an
approach toward generating co-crystals of aptamer–target complexes for X-ray crystallog-
raphy. With this, the second part of the volume is concluded leading into the third part,
which covers various applications of aptamers.
In this way, Chapters 13 – 15 provide protocols for employing aptamers as detection
modules in various assay formats, such as voltammetric assays, their simultaneous exploita-
tion as recognition elements and PCR templates ( Apta-PCR ) and as capture-modules in the
so-called enzyme-capture assays. The following chapters cover protocols for cellular appli-
cations of aptamers, e.g., their compatibility with histopathology investigations (Chapter
16 ) and their superior properties as imaging tools in super-resolution microscopy (Chapter
17 ). In Chapter 18 , a protocol for the synthesis of liposomes decorated with cell-speciﬁ c
aptamers is described, which enables the application of aptamers as a targeting reagent for
delivery of siRNAs into distinct cells. The last chapter provides means for generating genetic
switches based on aptamer-responsive ribozymes (Chapter 19 ).
Pref ace

vi
I am thankful to all contributors who made this book possible. I believe that this pro-
tocol collection provides a state-of-the-art summary of recent developments in the aptamer
ﬁ eld and will be a helpful resource for scientists in the life sciences working with aptamers
as tools to elucidate biological systems.
Bonn, Germany Günter Mayer
Preface

vii
Contents
Preface. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v
Contributors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
PART I SELECTION
1 Selection of Aptamers for Metabolite Sensing and Construction
of Optical Nanosensors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Yi Long , Franziska Pfeiffer , Günter Mayer , Tine Daa Schrøder ,
Veli Cengiz Özalp , and Lars Folke Olsen
2 SELEX of Cell-Specific RNA Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Katharina Berg , Eileen Magbanua , and Ulrich Hahn
3 Developing Aptamers by Cell-Based SELEX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Silvia Catuogno , Carla Lucia Esposito , and Vittorio de Franciscis
4 DNA Aptamer Generation by Genetic Alphabet Expansion
SELEX (ExSELEX) Using an Unnatural Base Pair System. . . . . . . . . . . . . . . . 47
Michiko Kimoto , Ken-ichiro Matsunaga , and Ichiro Hirao
5 Capillary Electrophoresis for the Selection of DNA Aptamers
Recognizing Activated Protein C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Nasim Shahidi Hamedani and Jens Müller
6 Preparation of SELEX Samples for Next-Generation Sequencing. . . . . . . . . . . 77
Fabian Tolle and Günter Mayer
7 Next-Generation Analysis of Deep Sequencing Data: Bringing Light
into the Black Box of SELEX Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
Michael Blank
PART II CHARACTERIZATION
8 Aptamer Binding Studies Using MicroScale Thermophoresis. . . . . . . . . . . . . . 99
Dennis Breitsprecher , Nina Schlinck , David Witte , Stefan Duhr ,
Philipp Baaske , and Thomas Schubert
9 Label-Free Determination of the Dissociation Constant of Small
Molecule-Aptamer Interaction by Isothermal Titration Calorimetry . . . . . . . . 113
Marc Vogel and Beatrix Suess
10 Applications of Aptamers in Flow and Imaging Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . 127
Isis C. Nascimento , Arthur A. Nery , Vinicius Bassaneze , José E. Krieger ,
and Henning Ulrich
11 In Vitro and In Vivo Imaging of Fluorescent Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
Ioanna Théodorou , Nam Nguyen Quang , Karine Gombert , Benoit Thézé ,
Benoit Lelandais , and Frédéric Ducongé
12 Crystallographic Pursuit of a Protein-RNA Aptamer Complex . . . . . . . . . . . . . 151
John J. G. Tesmer

viii
PART III APPLICATION
13 Voltammetric Aptasensor Based on Magnetic Beads Assay
for Detection of Human Activated Protein C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Arzum Erdem , Gulsah Congur , and Ece Eksin
14 Apta-PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
Alessandro Pinto , Pedro Nadal Polo , Miriam Jauest Rubio,
Marketa Svobodova , Teresa Mairal Lerga , and Ciara K. O’Sullivan
15 Aptamer-Based Enzyme Capture Assay for Measurement
of Plasma Thrombin Levels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179
Jens Müller , Tobias Becher , Günter Mayer , and Bernd Pötzsch
16 Application of Aptamers in Histopathology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
Sarah Shigdar , Li Lv , Lifen Wang , and Wei Duan
17 Aptamer Stainings for Super-resolution Microscopy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Maria Angela Gomes de Castro , Burkhard Rammner , and Felipe Opazo
18 Synthesis and Characterization of Aptamer-Targeted SNALPs
for the Delivery of siRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
Samantha E. Wilner and Matthew Levy
19 Screening of Genetic Switches Based on the Twister Ribozyme Motif . . . . . . . 225
Michele Felletti , Benedikt Klauser , and Jörg S. Hartig
Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
Contents

ix
PHILIPP BAASKE • NanoTemper Technologies GmbH  ,  Munich ,  Germany
VINÍCIUS BASSANEZE • Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology/LIM 13,
Heart Institute (InCor) ,  University of São Paulo Medical School  ,  São Paulo ,  Brazil
TOBIAS BECHER • Institute for Experimental Haematology and Transfusion Medicine ,
University of Bonn Medical Centre  ,  Bonn ,  Germany
KATHARINA BERG • Chemistry Department, Institute for Biochemistry
and Molecular Biology, MIN-Faculty ,  Hamburg University  ,  Hamburg ,  Germany
MICHAEL BLANK • AptaIT GmbH  ,  Munich ,  Germany
DENNIS BREITSPRECHER • NanoTemper Technologies GmbH  ,  Munich ,  Germany
SILVIA CATUOGNO • Istituto per l’Endocrinologia e l’Oncologia Sperimentale del CNR
“G. Salvatore”  ,  Naples ,  Italy
GULSAH CONGUR • Faculty of Pharmacy, Analytical Chemistry Department ,
Ege University  ,  Bornov ,  Izmir ,  Turkey
WEI DUAN • School of Medicine ,  Deakin University  ,  Waurn Ponds ,  VIC ,  Australia
FRÉDÉRIC DUCONGÉ • CEA, I2BM, Molecular Imaging Research Center (MIRCen)  ,
Fontenay-aux-Roses ,  France   ;   INSERM U1023 ,  Paris, France; Université Paris Sud  ,
Paris ,  France
STEFAN DUHR • NanoTemper Technologies GmbH  ,  Munich ,  Germany
ECE EKSIN • Faculty of Pharmacy ,  Analytical Chemistry Department, Ege University  ,
Bornov ,  Izmir ,  Turkey
ARZUM ERDEM • Faculty of Pharmacy ,  Analytical Chemistry Department, Ege University  ,
Bornov ,  Izmir ,  Turkey
CARLA LUCIA ESPOSITO • Istituto per l’Endocrinologia e l’Oncologia Sperimentale del CNR
“G. Salvatore”  ,  Naples ,  Italy
MICHELE FELLETTI • Department of Chemistry and Konstanz Research School Chemical
Biology ,  University of Konstanz  ,  Konstanz ,  Germany
VITTORIO DE FRANCISCIS • Istituto per l’Endocrinologia e l’Oncologia Sperimentale del
CNR “G. Salvatore”  ,  Naples ,  Italy
KARINE GOMBERT • INSERM U1023, Paris  ,    France   ;   Université Paris Sud ,     Paris ,  France;
CEA, I2BM, Service Hospitalier Frédéric Joliot (SHFJ) Paris, France
MARIA ANGELA GOMES DE CASTRO • Department of Neuro- and Sensory Physiology,
Cluster of Excellence Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain ,
University of Göttingen Medical Center  ,  Göttingen ,  Germany
ULRICH HAHN • Chemistry Department, Institute for Biochemistry and Molecular Biology,
MIN-Faculty ,  Hamburg University  ,  Hamburg ,  Germany
NASIM SHAHIDI HAMEDANI • Institute for Experimental Haematology and Transfusion
Medicine ,  University of Bonn Medical Centre  ,  Bonn ,  Germany
JÖRG S. HARTIG • Department of Chemistry and Konstanz Research School Chemical
Biology ,  University of Konstanz  ,  Konstanz ,  Germany
Contributors

x
ICHIRO HIRAO • Center for Life Science Technologies (CLST), RIKEN  ,  Yokohama ,
Kanagawa ,  Japan   ;   TagCyx Biotechnologies  ,  Yokohama ,  Kanagawa ,  Japan
MICHIKO KIMOTO • Center for Life Science Technologies (CLST), RIKEN  ,  Yokohama ,
Kanagawa ,  Japan   ;   TagCyx Biotechnologies  ,  Yokohama ,  Kanagawa ,  Japan   ;
  PRESTO, JST  ,  Saitama ,  Japan
BENEDIKT KLAUSER • Department of Chemistry and Konstanz Research School Chemical
Biology ,  University of Konstanz  ,  Konstanz ,  Germany
JOSÉ E. KRIEGER • Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology/LIM 13, Heart Institute
(InCor) ,  University of São Paulo Medical School  ,  São Paulo ,  Brazil
BENOIT LELANDAIS • CEA, I2BM, Molecular Imaging Research Center (MIRCen)  ,
Fontenay-aux-Roses ,  France   ;   INSERM U1023, Paris, France;   Université Paris Sud  ,
Paris ,  France
TERESA MAIRAL LERGA • Department of Chemical Engineering ,  Universitat Rovira I Virgili  ,
Tarragona ,  Spain
MATTHEW LEVY • Department of Biochemistry ,  Michael F. Price Center for Genetic and
Translational Medicine, Albert Einstein College of Medicine  ,  Bronx ,  NY ,  USA
YI LONG • Institute of Biochemistry and Molecular Biology ,  University of Southern
Denmark  ,  Odense ,  Denmark   ;   LIMES Institute ,  University of Bonn  ,  Bonn ,  Germany
LI LV • Department of Pathology ,  Second Afﬁ liated Hospital of Dalian Medical University  ,
Dalian ,  China
EILEEN MAGBANUA • Chemistry Department, Institute for Biochemistry
and Molecular Biology ,  MIN-Faculty, Hamburg University  ,  Hamburg ,  Germany
KEN-ICHIRO MATSUNAGA • Center for Life Science Technologies (CLST), RIKEN  ,
Yokohama ,  Kanagawa ,  Japan   ;   TagCyx Biotechnologies  ,  Yokohama ,  Kanagawa ,  Japan
GÜNTER MAYER • Life & Medical Sciences Institute (LIMES) ,  University of Bonn  ,  Bonn ,
Germany
JENS MÜLLER • Institute for Experimental Haematology and Transfusion Medicine ,
University of Bonn Medical Centre  ,  Bonn ,  Germany
ISIS C. NASCIMENTO • Departamento de Bioquímica, Instituto de Química ,  Universidade
de São Paulo  ,  São Paulo ,  Brazil
ARTHUR A. NERY • Departamento de Bioquímica, Instituto de Química ,  Universidade
de São Paulo  ,  São Paulo ,  Brazil
CIARA K. O’SULLIVAN • Department of Chemical Engineering ,  Universitat Rovira I Virgili  ,
Tarragona ,  Spain   ;   Institució Catalana de Recerca I Estudis Avançats  ,  Barcelona ,  Spain
LARS FOLKE OLSEN • Institute of Biochemistry and Molecular Biology ,  University
of Southern Denmark  ,  Odense ,  Denmark
FELIPE OPAZO • Department of Neuro- and Sensory Physiology, Cluster of Excellence
Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain ,  University of Göttingen
Medical Center  ,  Göttingen ,  Germany
VELI CENGIZ ÖZALP • Department of Medical Biology, School of Medicine ,  Istanbul
Kemerburgaz University  ,  Istanbul ,  Turkey
FRANZISKA PFEIFFER • LIMES Institute ,  University of Bonn  ,  Bonn ,  Germany
ALESSANDRO PINTO • Department of Chemical Engineering ,  Universitat Rovira I Virgili  ,
Tarragona ,  Spain   ;   Department of Bioengineering ,  Rice University  ,  Houston ,  TX ,  USA
PEDRO NADAL POLO • Department of Chemical Engineering ,  Universitat Rovira I Virgili  ,
Tarragona ,  Spain   ;   Center for Omic Sciences (COS) ,  Universitat Rovira I Virgili  ,  Reus ,
Spain
Contributors

xi
BERND PÖTZSCH • Institute for Experimental Haematology and Transfusion Medicine ,
University of Bonn Medical Centre  ,  Bonn ,  Germany
NAM NGUYEN QUANG • CEA, I2BM, Molecular Imaging Research Center (MIRCen)  ,
Fontenay-aux-Roses ,  France   ;   INSERM U1023 ,  Université Paris Sud  ,  Paris ,  France
BURKHARD RAMMNER • Department of Neuro- and Sensory Physiology, Cluster of Excellence
Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain ,  University of Göttingen
Medical Center  ,  Göttingen ,  Germany
MIRIAM JAUEST RUBIO • Department of Chemical Engineering  ,  Universitat Rovira I Virgili,
Tarragona ,  Spain
NINA SCHLINCK • NanoTemper Technologies GmbH  ,  Munich ,  Germany
TINE DAA SCHRØDER • Institute of Biochemistry and Molecular Biology ,  University of
Southern Denmark  ,  Odense ,  Denmark; Lundbeckfonden Center of Excellence NanoCAN,
University of Southern Denmark, Odense, Denmark
THOMAS SCHUBERT • 2bind GmbH  ,  Regensburg ,  Germany
SARAH SHIGDAR • School of Medicine ,  Deakin University  ,  Waurn Ponds ,  VIC ,  Australia
BEATRIX SUESS • Department of Biology ,  Technical University Darmstadt  ,  Darmstadt ,  Germany
MARKETA SVOBODOVA • Department of Chemical Engineering ,  Universitat Rovira I Virgili  ,
Tarragona ,  Spain
JOHN J.G. TESMER • Departments of Pharmacology and Biological Chemistry, University of
Michigan ,     Ann Arbor ,  MI ,  USA
IOANNA THÉODOROU • CEA, I2BM, Molecular Imaging Research Center (MIRCen)  ,
Fontenay-aux-Roses ,  France   ;   INSERM U1023 ,  Université Paris Sud  ,  Paris ,  France
BENOIT THÉZÉ • INSERM U1023  ,  Paris ,  France   ;   Université Paris Sud ,     Paris ,  France;
CEA, I2BM, Service Hospitalier Frédéric Joliot(SHFJ), Paris, France
FABIAN TOLLE • Life & Medical Sciences Institute (LIMES) ,  University of Bonn  ,  Bonn ,
Germany
HENNING ULRICH • Departamento de Bioquímica, Instituto de Química ,  Universidade
de São Paulo  ,  São Paulo ,  Brazil
MARC VOGEL • Department of Biology ,  Technical University Darmstadt  ,  Darmstadt ,
Germany
LIFEN WANG • Department of Pathology ,  Second Afﬁ liated Hospital of Dalian Medical
University  ,  Dalian ,  China
SAMANTHA E. WILNER • Department of Biochemistry ,  Michael F. Price Center for Genetic
and Translational Medicine, Albert Einstein College of Medicine  ,  Bronx ,  NY ,  USA
DAVID WITTE • NanoTemper Technologies GmbH  ,  Munich ,  Germany
Contributors

Part I
Selection

3
Chapter 1
Selection of Aptamers for Metabolite Sensing
and Construction of Optical Nanosensors
Yi Long , Franziska Pfeiffer , Günter Mayer , Tine Daa Schrøder ,
Veli Cengiz Özalp , and Lars Folke Olsen
Abstract
   Optical nanosensors are based on particles with diameters from 20 to 200 nm containing sensory ele−
ments. The latter are comprised of one or more signaling molecules and one or more references, which
allow measurements to be ratiometric and hence independent on the amount of sensor. The signaling
molecules may range from simple ion−binding ﬂ uorophores, e.g., pH−sensitive dyes, to complex biochemi−
cal assays. Aptamers are ideal for use in nanosensors because they are relatively easy to modify chemically
and hence to transform into signaling molecules, and their binding afﬁ nities may be ﬁ ne−tuned to a desired
measuring range in the selection process. Here we ﬁ rst describe the selection of metabolite binding aptam−
ers, how they are transformed into signaling molecules using a molecular beacon construct and then how
they are inserted into nanoparticles. Finally, we brieﬂ y describe how the sensors are calibrated before
inserted into cells to measure metabolite concentration in real time. As examples we present aptamers
binding to key metabolites in cells: ATP and fructose 1, 6−bisphosphate (FBP).
Key words      Nanosensor    ,   Aptamers  ,   Selection  ,   6−Bisphosphate  ,    Fructose 1   ,    ATP    ,   Calibration
1 Introduction
Metabolism in living cells is highly dynamic and variable. The cell
must be able to respond to external stimuli within seconds and
sometimes oscillations in physiologic concentrations of intracellu−
lar metabolites with periods ranging from seconds to minutes to
hours are observed [ 1 ]. In order to understand metabolic pro−
cesses and eventually to simulate them by mathematical models, it
is very important that we can measure metabolites in real time in
intact cells. This is not an easy task as most metabolites are gener−
ally spectroscopically “silent.” There are only a few exceptions to
this rule, such as NAD(P)H and ﬂ avines, which are ﬂ uorescent. To
measure other intracellular metabolites we usually have to quench
Günter Mayer (ed.), Nucleic Acid Aptamers: Selection, Characterization, and Application, Methods in Molecular Biology,
vol. 1380, DOI 10.1007/978-1-4939-3197-2_1, © Springer Science+Business Media New York 2016

4
cells and extract their content, which is subsequently measured
using off−line methods [ 2 ]. Therefore, measurements of metabo−
lites are usually performed at long discrete time intervals using the
assumption that metabolism is in a stationary state. In order to
increase our knowledge about metabolism, there are increased
efforts to develop sensors, which can be inserted into cells in a
noninvasive, or at least minimal invasive way, to measure intracel−
lular metabolites in real time. Some of these sensors are genetically
engineered ﬂ uorescent or Förster resonance energy transfer
( FRET  )−based proteins [ 3 – 5 ], while others are based on nanopar−
ticles that encapsulate sensing elements [ 6 ,  7 ]. For the latter aptam−
ers come in handy because (1) the  SELEX   [ 8 ,  9 ] technique, in
principle, allows for the construction of aptamers to essentially any
molecule, including low−molecular−weight metabolites, and with a
predetermined afﬁ nity, and (2) aptamers can be modiﬁ ed chemi−
cally, which makes it relatively easy to transform them into signal−
ing molecules [ 10 ,  11 ].
Here we will describe the process of selecting an aptamer to an
important metabolite in cells: Fructose 1, 6−bisphosphate (FBP).
FBP is a key intermediate in glycolysis, and it also serves as a regu−
lator of other metabolic processes. In addition to the selection of
the FBP aptamer, we will describe how aptamers may be converted
into signaling molecules that are inserted into polyacrylamide par−
ticles to form optical nanosensors. Finally, we brieﬂ y describe how
these sensors are calibrated before they are inserted into intact cells
to measure intracellular metabolites in real time [ 12 ,  13 ].
2 Materials
         1.    Sepharose 4B (Sigma).
   2.    Empty polypropylene spin columns, 1.2 mL bed volume
(Biorad).
   3.    1.5 mL Eppendorf tubes.
   4.    5× Cytosol buffer: 0.03 M KH 2 PO 4 , 0.07 M K 2 HPO 4 , 0.7 M
KCl, 0.05 M NaCl, 27.5 % glucose. Adjust to pH 6.88. Store
at −20 °C ( see   Note 1 ).
       1.    Sepharose 4B (Sigma).
   2.     D −fructose 1, 6−bisphosphate (FBP).
   3.    1, 4−Butanediol diglycidyl ether.
   4.    0.5 M Ethanolamine dissolved in water.
   5.    0.6 M NaOH with 0.6 % NaBH
4  in water.
   6.    0.5 M Na
2 CO
3  in water.
2.1 Selection Matrix
2.1.1 Negative
Selection Matrix
2.1.2 Functionalization
of Sepharose with
D -Fructose 1,
6-Bisphosphate
Yi Long et al.

5
   7.    Filtering setup (one Büchner ﬂ ask, one glass ﬁ lter funnel).
   8.    A shaker with heating.
       1.    FBP−labeled Sepharose 4B.
   2.    Empty polypropylene spin columns, 1.2 mL bed volume
(Biorad).
   3.    1.5 mL Eppendorf tubes.
   4.    1× Selection buffer: Dilute 5× cytosol buffer to 1× cytosol buf−
fer by mixing with water and 100 mM MgCl 2  to obtain 1×
cytosol buffer with 5 mM MgCl 2 .
         1.    Sepharose 4B (Sigma).
   2.    FBP−labeled Sepharose 4B.
   3.    Thermomixer.
   4.    5× Cytosol buffer.
   5.    100 mM MgCl 2  in water.
   6.    RNA library 5′−GGGAGGACGAUGCGG−N40− CAGACGAC
UCGCUGAGGAUCCGAGA− 3′ [ 14 ].
   7.    1× Selection buffer.
   8.    5 mM EDTA, pH 8.0 in water.
   9.    3 M sodium acetate, pH 5.4.
   10.    99.8 % ethanol.
   11.    10 mg/mL glycogen in water.
   12.    70 % ethanol.
       1.    5× Colorless GoTaq Flexi Buffer (Promega, cat# M890A).
   2.    5× ﬁ rst−strand buffer (Invitrogen).
   3.    100 mM dithiothreitol (DTT) in water.
   4.    100 mM MgCl
2 .
   5.    25 mM (each) dNTPs.
   6.    100 μM forward primer: 5′−GGGGGAATTCTAATACGACT
CACTATAGGGAGGACGATGCGG− 3s.
   7.    100 μM reverse primer: 5′−TCTCGGATCCTCAGCGAGT
CGTC− 3′.
   8.    Superscript II Reverse Transcriptase (200 U/μL) (Invitrogen,
cat# 18064).
   9.    GoTaqFlexiDNA polymerase (5 U/μL) (Promega, cat#
M8305).
   10.    Agarose, electrophoresis grade.
   11.    10× TBE−buffer: 89 mM Tris, pH 8.0, 89 mM boric acid, 2
mM EDTA. Dilute 1:10 with water.
2.1.3 Positive
Selection Matrix
2.2 Selection of FBP
Aptamer
2.2.1 SELEX Round 1–3
2.2.2 Reverse
Transcription Polymerase
Chain Reaction (RT-PCR)
Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

6
   12.    10 mg/mL Ethidium bromide ( see   Note 2 ).
   13.    Agarose gel−loading buffer: 50 % glycerol, 50 mM Tris–HCl,
pH 8.0, 50 mM EDTA, optionally add one spatula tip of bro−
mophenol blue and xylene cyanol.
       1.    5×  Transcription   buffer: 200 mM Tris–HCl, pH 7.9.
   2.    100 mM DTT in water.
   3.    25 mM (each) NTP−Mix.
   4.    100 mM MgCl 2  in water.
   5.    40 U/μL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor
(Promega, cat# N2515/N2511).
   6.    30 U/μL T7 RNA Polymerase.
   7.    Agarose, electrophoresis grade.
   8.    10× TBE−buffer: 89 mM Tris, pH 8.0, 89 mM boric acid, 2
mM EDTA. Dilute 1:10 with water.
   9.    10 mg/mL Ethidium bromide.
   10.    Agarose gel−loading buffer: 50 % glycerol, 50 mM Tris–HCl,
pH 8.0, 50 mM EDTA, optionally add one spatula tip of bro−
mophenol blue and xylene cyanol.
       1.    FBP−labeled Sepharose 4B.
   2.    5× Cytosol buffer: 0.03 M KH 2 PO
4 , 0.07 M K
2 HPO
4 , 0.7 M
KCl, 0.05 M NaCl, 27.5 % glucose, pH 6.88.
   3.    100 mM MgCl 2 .
   4.    1× Selection buffer: 1× Cytosol buffer with 5 mM MgCl
2 .
   5.    1× Elution buffer: 1× Cytosol buffer with 5 mM MgCl
2  and 5
mM FBP.
   6.    3 M Sodium acetate, pH 5.4.
   7.    99.8 % Ethanol.
   8.    10 mg/mL glycogen in water.
         1.    5×  Transcription   buffer: 200 mM Tris–HCl, pH 7.9.
   2.    100 mM DTT.
   3.    25 mM (each) NTP−Mix.
   4.    100 mM MgCl
2 .
   5.    40 U/μL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor
(Promega, cat# N2515/N2511).
   6.    30 U/μL T7 RNA Polymerase stored in aliquots at −20 °C in
20 mM sodium phosphate, pH 7.7, 1 mM DTT, 1 mM EDTA,
100 mM NaCl and 50 % glycerol.
   7.    Inorganic pyrophosphatase (IPP) (2 U/μL) (Roche).
   8.    Nano Quant (Tecan nanoquant inﬁ nite M200).
2.2.3 Transcription
2.2.4 SELEX Round 4-×
2.3 5′-End Labeling
of RNA Molecules
2.3.1 Large-Scale
Transcription
Yi Long et al.

7
       1.    10× Calf intestine alkaline phosphatase (CIAP) buffer (Promega).
   2.    10 mg/mL Bovine serum albumin (BSA, RNase−free grade)
stored at 4 °C in water.
   3.    CIAP enzyme (Promega).
   4.    40 U/μL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor
(Promega, cat# N2515/N2511).
   5.    500 mM EDTA, pH 8.0 in water.
   6.    Phenol and chloroform.
   7.    3 M Sodium acetate, pH 5.4 in water.
   8.    99.8 % Ethanol.
   9.    10 mg/mL Glycogen in water.
   10.    70 % Ethanol.
       1.    10 U/μl T4 Polynucleotide− Kinase   (T4 PNK).
   2.    10× T4 PNK buffer (New England Biolabs).
   3.    γ−[
32
P]− ATP   ( see   Note 3 ).
   4.    Illustra MicroSpin G−25 columns.
       1.    70 % Ethanol.
   2.    Plates, spacers, clamps, comb.
   3.    Concentrated gel solution, 25 % Bis−/Acrylamide in 8.3 M
Urea ( see   Note 4 ).
   4.    8.3 M Urea in water.
   5.    10× TBE−buffer: 89 mM Tris, pH 8.0, 89 mM boric acid, 2
mM EDTA.
   6.    10 % Ammoniumperoxodisulphate solution (APS). Store at 4 °C.
   7.     N , N , N ′, N ′−Tetramethylethylenediamine (TEMED). Store at
4 °C.
   8.    4× Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)−Gel loading
buffer: 9 M Urea, 50 mM EDTA, pH 8.0.
   9.    Bromophenol blue and xylene cyanol.
       1.    Phosphorimager (Fujiﬁ lm FLA−3000).
   2.    BAS cassette 2023 and BAS MS imaging plates (Fujiﬁ lm
FLA− 3000).
   3.    Sterile scalpel.
   4.    0.3 M sodium acetate, pH 5.4.
   5.    Thermomixer.
   6.    Syringe.
   7.    Glass wool (RNase−free grade).
2.3.2 Dephosphorylation
2.3.3 5′-Radioactive
Phosphorylation
2.4 Polyacrylamide
Gel Electrophoresis
2.5 PAGE Gel
Puriﬁ cation
Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

8
       1.    Sepharose 4B (Sigma).
   2.    FBP−labeled Sepharose 4B.
   3.    Empty polypropylene spin columns, 1.2 mL bed volume
(Biorad).
   4.    1.5 mL Reaction vials.
   5.    Puriﬁ ed 5′−end radioactively labeled RNA.
   6.    Thermomixer.
   7.    Liquid scintillation counter.
   8.    5× Cytosol buffer: 0.03 M KH
2 PO
4 , 0.07 M K
2 HPO
4 , 0.7 M
KCl, 0.05 M NaCl, 27.5 % glucose, pH 6.88.
   9.    100 mM MgCl 2 .
   10.    1× Selection buffer: 1× Cytosol buffer with 5 mM MgCl 2 .
   11.    1× Elution buffer: 1× Cytosol buffer with 5 mM MgCl
2  and 5
mM FBP.
       1.     ATP   aptamer: 5′−GTAGTAAGAACTAAAGTAAAAAAAAA
ATTAAAGTAGCCACGCTT− 3′.
   2.     Aptamer   switch probe: 5′ (AF488)−GTAGTAAGAACTAAAG
TAAAAAAAAAATTAAAGTAGCCACGCTT−
[(C18spacer)×6]−TTACTAC−(BHQ1) 3′ ( see   Note 5 ) (VBC
Biotech, Vienna).
   3.    Dioctyl sulfosuccinate.
   4.    Polyethylene glycol dodecyl ether (Brij 30).
   5.    Acrylamide solution of 38.8%T, 1.35 g of acrylamide, 0.4 g of
N , N −methylenebisacrylamide.
   6.    10 mg/mL Texas Red Dextran solution, MW of dextran:
10,000 g/mol.
   7.    10 % Sodium bisulﬁ te: 50 mg Na−bisulﬁ te dissolved in 0.45
mL 10 mM Na−phosphate buffer, pH 7.2.
   8.    Three−necked 100 mL round−bottomed ﬂ ask.
   9.    Sonication bath.
   10.    Argon gas.
   11.    Amicon ultraﬁ ltration cell model 2800 (Millipore Corp.,
Bedford, USA).
   12.    100 kDa ﬁ lter (Ultraﬁ ltration Membrane YM100).
   13.    0.025 μm nitrocellulose ﬁ lter membrane (Millipore ﬁ lter type
VS 0.025 μm).
       1.    Nanosensors containing aptamer switch probe and reference
ﬂ uorophore.
   2.    1× Cytosol buffer with 5 mM MgCl
2 .
   3.    500 mM ADP in 1× cytosol buffer, pH 7.0.
2.6 Binding Assay
2.7 Synthesis
of Aptamer -
Nanosensors
2.8 Calibration
of Nanosensors
Yi Long et al.

9
   4.    500 mM Phosphoenolpyruvate in water.
   5.    1 U/μL Rabbit pyruvate kinase.
   6.    1 U/μL Yeast hexokinase.
3 Methods
       1.    Wash 10 g sepharose 4B with 500 mL H
2 O on a ﬁ ltering setup
using suction. Remove as much water as possible by suction.
   2.    Resuspend the sepharose in 10 mL 0.6 M NaOH containing
0.6 % NaBH 4 . Subsequently add 5 mL 1, 4−butanediol diglyc−
idyl ether (liquid ~ 27.2 mmol).
   3.    Leave the suspension to react overnight on a shaker (150 rpm)
at room temperature.
   4.    Wash the sepharose with 1.5 L H 2 O. Remove as much water as
possible by suction.
   5.    Resuspend the activated sepharose in 50 mL 0.5 M Na 2 CO 3 ,
and then add 4.5 g FBP (8.2 mmol). Shake the mixture over−
night at 50 °C.
   6.    Wash the sepharose with 1.5 L H 2 O. At the end, remove as
much water as possible by suction.
   7.    Resuspend the sepharose in 50 mL 0.5 M ethanolamine and
shake it for 1 h at room temperature.
   8.    Wash the labeled sepharose with 1.5 L H 2 O and resuspend it
in 10 mL H 2 O. Store at 4 °C.
         1.    The selection matrix is prepared by loading 100 μL of FBP−
labeled sepharose for positive selection and sepharose 4B for
negative selection into empty polypropylene spin columns and
washing them with 600 μL H 2 O.
   2.    In  SELEX   round 1: Mix 1 nmol of the RNA library with 60 μL
5× cytosol buffer, 15 μL 100 mM MgCl 2 , and ﬁ ll H
2 O to
achieve 300 μL total volume. In SELEX rounds 2–3: Mix 50
μL transcription product from the previous selection cycle with
60 μL 5× cytosol buffer, 7.5 μL 100 mM MgCl 2  and ﬁ ll with
H 2 O to achieve 300 μL total volume.
   3.    Put the matrix for negative selection into a thermomixer, which
is set to 25 °C, load the sample solution ( see   step 2 ) onto the
negative matrix, let it pass by gravity, and collect the ﬂ ow
through.
   4.    Apply the ﬂ ow through from  step 3  to the FBP−labeled selec−
tion matrix. Discard the ﬂ ow through.
   5.    Wash the column twice with 600 μL 1× selection buffer.
   6.    Add 300 μL of 5 mM EDTA to the column to elute the bound
RNA and collect the eluted fraction.
3.1 Functionalization
of Sepharose
with D -Fructose-1,
6-Bisphosphate
3.2 Selection of FBP
Aptamer
3.2.1 SELEX Rounds 1–3
Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

10
   7.    Add 30 μL of 3 M sodium acetate, 990 μL of 99.8 % ethanol,
and 1 μL of 10 mg/mL glycogen to the eluted fraction.
   8.    Cool the mixture at −80 °C for 30 min and subsequently cen−
trifuge at 20,000 ×  g  for 20 min.
   9.    Discard the supernatant and wash the pellet with 70 % ethanol.
   10.    Dry the pellet and resuspend it in 50 μL of H 2 O.
       1.    Prepare a reverse transcription polymerase chain reaction (RT−
PCR) master mix as seen in Table  1 .
       2.    Add 50 μL H
2 O to one tube of the RT−PCR master mix as a
negative control and 50 μL of the puriﬁ ed eluate fraction ( see
previous section,  steps 6–10 ) to a second tube.
   3.    Incubate the two samples at 65 °C for 5 min.
   4.    Immediately place the samples at 4 °C.
   5.    Add 1 μL of Superscript II Reverse Transcriptase (200 U/μL)
and 1 μL of GoTaq Flexi DNA polymerase (5 U/μL) to the
samples.
   6.    Incubate for 10 min at 54 °C.
   7.    Place the sample in the thermocycler with the following set−
tings: 95 °C for 30 s, 60 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s ( see
Note 6 ).
   8.    Prepare a 2.5 % (w/v) agarose gel in 1× TBE−buffer and boil it
until the agarose is completely dissolved.
   9.    Add 0.1 μL/mL of 10 mg/mL ethidium bromide and mix
gently.
   10.    Pour the gel into a gel−casting chamber, insert the comb, and
let it solidify.
3.2.2 Reverse
Transcription Polymerase
Chain Reaction
Table 1
Protocol for setting up the RT-PCR reaction
Reagent Volume ( μL)/reaction Final concentration
5× Colorless GoTaq Flexi Buffer 20   1×
5× ﬁ rst−strand buffer 4   0.2×
100 mM DTT 2   2 mM
100 μM Primer fw Sul 1 1   1 μM
100 μM Primer rv Sul 1 1   1 μM
100 mM MgCl 2    1.5   1.5 mM
25 mM ( each ) dNTPs 1.2   300 μM
H
2 O   17.3
Total   48
Yi Long et al.

11
   11.    Mix 2 μL PCR product with 2 μL agarose−loading buffer and
load it onto the gel. Also load a suitable DNA−ladder (e.g.,
100 bp ladder).
   12.    Run the gel at 160 V with 1× TBE as running buffer for 20 min
and visualize the DNA bands with a state−of−the−art gel docu−
mentation system. Figure  1  shows an exemplary agarose gel
image of PCR products obtained from different selection
cycles.
              1.    Prepare the transcription master mix as seen in Table  2 .
       2.    For one reaction add 10 μL RT−PCR product to 85.7 μL of
transcription master mix. Subsequently, add 1 μL RNasin (40
U/μL) and 3.3 μL T7 RNA Polymerase (30 U/μL).
   3.    Perform the transcription reaction for 20 min at 37 °C.
3.2.3 Transcription
Fig. 1    RT-PCR product of different selection cycles.  M : DNA size marker;  numbers 1–13   indicate the SELEX    cycle
Table 2
Protocol for setting up the transcription reaction
Reagent
Volume (μL)
for one reaction
Volume (μL)
for 20 reactions
Final
concentration
5×  Transcription   buffer 20   400   1×
100 mM DTT 5   100   5 mM
NTP−Mix (25 mM each) 10   200   2.5 mM each
100 mM MgCl 2    15   300   15 mM
H
2 O   35.7   710
Total volume 85.7   1710

Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

12
       1.    Mix 50 μL transcription product from the previous selection
cycle with 60 μL 5× cytosol buffer and 7.5 μL 100 mM MgCl 2
and add up to 300 μL with H 2 O.
   2.    Apply the mixture with the transcription product from the pre−
vious round to the FBP−labeled sepharose and discard the ﬂ ow
through.
   3.    Wash the column twice with 600 μL 1× selection buffer.
   4.    Apply 300 μL of 1× elution buffer to the column to elute the
bound RNA and collect the eluted fraction.
   5.    Add 30 μL of 3 M sodium acetate, 990 μL of 99.8 % ethanol,
and 1 μL 10 mg/mL glycogen to the eluted fraction.
   6.    Freeze the mixture at −80 °C for 30 min; centrifuge it at 4 °C
and 20,000 ×  g  for 20 min.
   7.    Discard the supernatant, dry the pellet and resuspend it in 50
μL of H 2 O.
         1.    Mix 200 μL 5× transcription buffer with 10 μL RNasin
(40 U/μL), 2 μL IPP (2 U/μL), 30 μL T7 RNA Polymerase
(30 U/μL), and 258 μL H
2 O.
   2.    Add 100 μL RT−PCR product to the solution.
   3.    Incubate the reaction for 4 h at 37 °C.
   4.    Purify the RNA with a MicroSpin G−25 column.
   5.    Measure the RNA concentration on Nano Quant. Take at least
75 pmol RNA to do the dephosphorylation.
       1.    Mix 5 μL 10× CIAP buffer, 5 μL 10 mg/mL BSA, 0.85 μL 20
U/μL CIAP, 0.5 μL 40 U/μL RNasin, and 75 pmol RNA and
ﬁ ll it up to 50 μL with H 2 O.
   2.    Incubate at 37 °C for 15 min.
   3.    Add further 0.425 μL of 20 U/μL CIAP.
   4.    Incubate for an additional 15 min at 55 °C.
   5.    Add 0.5 μL 0.5 M EDTA, pH 8.0.
   6.    Incubate at 75 °C for 10 min.
   7.    Add 150 μL H
2 O.
   8.    Phenol/chloroform extraction: Mix 200 μL dephosphorylated
RNA with 200 μL of phenol and centrifuge at 14,000 ×  g  for
10 min. Take the upper phase and mix it with 400 μL of chlo−
roform; centrifuge at 14,000 ×  g  for 10 min. Take the upper
phase and add 1/10 volume of 3 M sodium acetate, pH 5.4, 3
volumes ethanol and 1 μL of 10 mg/mL glycogen.
   9.    Cool the mixture at −80 °C for 30 min and then centrifuge it
at 4 °C and 20,000 ×  g  for 20 min. Discard the supernatant.
   10.    Dry the pellet and resuspend it in 5 μL H 2 O. Use 2 μL to run
an agarose gel and 3 μL for the phosphorylation.
3.2.4 SELEX Round 4-×
3.3 5′-End Labeling
of RNA Molecules
3.3.1 Large-Scale
Transcription
3.3.2 Dephosphorylation
Yi Long et al.

13
       1.    Mix 3 μL dephosphorylated RNA, 2 μL 10× T4 PNK buffer,
1–2 μL γ−[
32
P]− ATP   ( see   Note 7 ), 2 μL 10 U/μL T4 PNK and
ﬁ ll up to 20 μL with H 2 O.
   2.    Incubate for 30–45 min at 37 °C.
   3.    Purify the RNA with a MicroSpin G−25 column.
       1.    Clean the glass plates with water and 70 % ethanol before use.
   2.    Prepare 30 mL of a 10 % PAGE−gel by mixing 12 mL 25 % Bis−/
Acrylamide containing 8.3 M urea, 15 mL 8.3 M urea in water,
3 mL 8.3 M urea in 10× TBE, 240 μL 10 % APS, and 12 μL
TEMED. Pour the mixture into the space between the two glass
plates and insert the comb. Let it polymerize for at least 30 min.
   3.    Carefully remove the comb and the spacer at the bottom of the
glass plates. Assemble the gel−running unit. Fill the lower cham−
ber with running buffer and remove any air bubbles between gel
and buffer. Afterwards, ﬁ ll the upper chamber with buffer and
rinse the wells with running buffer using a syringe.
   4.    Mix 50 μL radioactively labeled RNA sample from previous
section  step 3 , with 17 μL 4× PAGE−gel loading buffer, heat it
for 3 min at 80 °C and load onto the gel immediately.
   5.    Run the gel with 15 W/gel until the xylene cyanol band has
migrated through 2/3 of the gel.
   6.    Remove the gel from the gel−running unit and the glass plates
and wrap it in plastic foil.
   7.    Put the gel into an irradiation cassette and place an imaging
plate on top, close the cassette and expose the screen for
10 min. Read the screen using a phosphorimager. Print the
image at 100 % scale.
   8.    Place the printout underneath the gel, ﬁ nd the position of the
sample, cut out the band with a sterile scalpel, and place the gel
pieces in a 2 mL reaction vial. Crush the gel pieces with a blue
pipet tip.
   9.    Add 0.3 M sodium acetate pH 5.4 to resuspend the crushed
gel matrix.
   10.    Incubate the gel pieces at 65 °C at 1300 rpm and for 2 h on a
thermomixer.
   11.    Filter the suspension through a syringe with glass wool and
wash the gel pieces at least three times with 0.3 M sodium
acetate. Collect the ﬁ ltrate.
   12.    Add 3 volumes 99.8 % ethanol and 1 μL 10 mg/mL glycogen.
   13.    Leave at −20 °C overnight or cool for 30 min at −80 °C.
   14.    Centrifuge at 14,000 ×  g  and 4 °C for 20 min.
   15.    Discard the supernatant, dry the pellet, and dissolve it in 50 μL
MilliQ H 2 O.
3.3.3 5′-Labeling
with
32
P- ATP
3.4 Polyacrylamide
Gel Electrophoresis
(PAGE)
Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

14
       1.    The selection matrix is prepared by loading 100 μL each of
FBP labeled sepharose for positive selection and sepharose 4B
for negative selection into a spin column and washing them
with 600 μL H 2 O each.
   2.    Mix 50 μL of radioactively labeled RNA (approx. 100,000
cpm), 60 μL 5× cytosol buffer, and 15 μL 100 mM MgCl 2  and
ﬁ ll it up to 300 μL with H 2 O.
   3.    Put the sepharose 4B or FBP−labeled sepharose into a thermo−
mixer at 25 °C, apply the radioactive RNA from above, and
collect the ﬂ ow through.
   4.    Apply 600 μL 1× selection buffer to the matrix, let it pass through
by gravity, and collect the fraction. Repeat this procedure.
   5.    Apply 600 μL 1× elution buffer to the matrix, let it pass
through, and collect this fraction.
   6.    Add H 2 O to all samples to yield 1 mL ﬁ nal volume.
   7.    Measure the counts per minute by liquid scintillation count−
ing. One representative result of a typical binding assay is
shown in Fig.  2 .
              1.    In a three−necked 100 mL round−bottomed ﬂ ask purged with
argon place 3.08 g dioctyl sulfosuccinate and 1.59 g Brij 30
and add 45 mL hexane.
   2.    Connect the ﬂ ask to the argon, close it with stoppers, and leave
it on the magnetic stirrer.
   3.    Deoxygenate by sonication for 1 h.
   4.    Prepare separately a solution of 38.8%T solution of acrylamide
in a 7 mL vial purged with argon:          1.35 g Acrylamide, 0.4 g  N ,
N −methylenebisacrylamide, 4.5 mL 10 mM Na−phosphate
buffer, pH 7.2
   5.    Add 15 nmol of  ATP   aptamer probe and 15 μL Texas Red
dextran (10 mg/mL) into the acrylamide solution and mix for
15 min.
   6.    When the dioctyl sulfosuccinate is dissolved move the ﬂ ask to
the sonication bath and remove the stopper in the small neck.
Put also the monomer solution in the sonication bath without
a cap. Both solutions are left for 1 h in the sonication bath.
After sonication the round−bottomed ﬂ ask is closed with a
stopper and moved back to the magnetic stirrer.
   7.    Add 2.0 mL of acrylamide solution into hexane solution drop−
wise ( see   Note 8 ).
   8.    Stir solution for 15–20 min under argon such that the micro−
emulsion can form.
   9.    Initiate polymerization by adding 50 μL of 10 % w/v solution
of sodium bisulﬁ te ( see   Note 8 ).
   10.    Allow the reaction to proceed for 3 h.
3.5 Binding Assay
3.6 Synthesis
of Aptamer -
Nanoparticles
Yi Long et al.

15
   11.    Remove hexane under vacuum in a rotation evaporator.
   12.    Add 100 mL 96 % ethanol to the nanosensor suspension.
   13.    Transfer the suspension to an Amicon ultraﬁ lration cell with
100 kDa ﬁ lter.
   14.    Wash 4 times with 100 mL of 96 % ethanol to remove unreacted
monomers and surfactants. Do not let the ﬁ lter cake run dry.
   15.    Resuspend washed particles in 50 mL of 96 % ethanol and ﬁ lter
through 0.025 μm nitrocellulose ﬁ lter membrane.
   16.    Dry under vacuum and weigh (a typical synthesis yields about
400 mg of particles).
   17.    Keep dried particles at −20 °C until use.
Fig. 2    Binding assay results for RNA product of different rounds. ( a ) Percentage
of radioactivity in different fractions. Fraction 1: Eluate from different rounds of
transcribed radioactively labeled RNA in 1× selection buffer. Fraction 2: The ﬁ rst
wash ﬂ ow-through by 1× selection buffer. Fraction 3: The second wash ﬂ ow
through by 1× selection buffer. Fraction 4: Eluted RNA by elution buffer. Fraction
5: Radioactivity left on sepharose. ( b ) Fraction 4: Eluted RNA from different selec-
tion rounds. The ﬁ gure shows that, as the selection round goes up, the percent-
age of radioactivity for RNA from FBP-labeled sepharose also increases, which
means the  SELEX   procedure enriched the amount of RNA that can bind to FBP

Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

16
       1.     ATP  −nanosensors are dissolved in 2 mL 1× cytosol buffer and
5 mM MgCl 2  to a concentration of 1 mg/mL and placed in
the ﬂ uorometer. The solution is stirred continuously using a
magnetic stirrer ( see   Note 9 ).
   2.    Record ﬂ uorescence due to Alexa 488 (excitation 470 nm,
emission 520 nm) of the aptamer probe solution at 25 °C.
   3.    Add ADP to a ﬁ nal concentration of 1–6 mM (as indicated in
Fig.  3 ). When ﬂ uorescence is stationary add an equimolar con−
centration of phosphoenol pyruvate (PEP) and wait until the
ﬂ uorescence is again stable.
       4.    Add 5 U of rabbit pyruvate kinase (PK) to the solution and
wait until the ﬂ uorescence has increased to a constant level ( see
Fig.  3a, b ). The increase in ﬂ uorescence is due to the formation
3.7 Nanosensor
Calibration
Fig. 3    Construction of calibration curves for ADP and  ATP  . ( a  and  b ) Fluorescence changes due to Alexa Fluor
488 on the aptamer probe (excitation 470 nm, emission 520 nm) following addition of 1 mM ( a ) or 4 mM ( b )
ADP, 1 mM ( a ) or 4 mM ( b ) phosphoenol pyruvate (PEP), 5 U pyruvate kinase (PK), and ﬁ nally 5 U hexokinase
(HK) to the solution containing 1 mg/mL of ATP sensor. ( c ) Resulting binding curves for nucleotide titrations
calculated from the ﬂ uorescence response at 520 nm divided by the ﬂ uorescence signal recorded from the
reference ﬂ uorophore (Texas Red, excitation 580 nm, emission 610 nm)

Yi Long et al.

17
of  ATP   following transfer of phosphate from PEP to ADP cat−
alyzed by pyruvate kinase. The reaction is irreversible so when
it is complete all ADP has been converted to ATP.
   5.    Add 5 U of hexokinase and wait until the ﬂ uorescence has
decreased to a stable level. The decrease in ﬂ uorescence is due to
the transfer of phosphate from  ATP   to glucose in the cytosol
buffer catalyzed by hexokinase. Also this reaction is irreversible.
   6.    The ﬂ uorescence following addition of ADP is taken as the
ADP signal while the maximum ﬂ uorescence immediately
before addition of hexokinase is taken as the  ATP   signal.
   7.    The signal of the reference ﬂ uorophore Texas Red (excitation
580 nm, emission 610 nm) is then recorded. Wait until the
ﬂ uorescence is stable.
   8.    The calibration curves for ADP and  ATP   are constructed as the
ADP signal divided by the reference signal and the ATP signal
divided by the reference signal, respectively. These curves are
shown in Fig.  3c  ( see   Note 10 ).
4 Notes
     1.    All solutions are prepared with de−ionized water puriﬁ ed with
a resistivity of 18.2 MΩ and sterilized by ﬁ ltration with a ﬁ lter
pore size of 0.22 μm.
   2.    Ethidium bromide intercalates in DNA and is highly toxic.
   3.    γ−[
32
P]− ATP   is radioactive and should be handled with great
care and only with appropriate protection measures.
   4.    Bis−/Acrylamide is a neurotoxin. Be careful and avoid direct
contact.
   5.    The aptamer switch probe is composed of the  ATP   aptamer
sequence and a 7−nucleotide extension, which is complemen−
tary to the 5′−end of the ATP aptamer. The construct forms a
hairpin structure. By addition of a ﬂ uorophore (Alexa Flour
488) to the 5′−end of the ATP aptamer and a quencher (Black
Hole I) to the 3′−end of the 7−nucleotide extension the
aptamer/extension pair is converted to a signaling molecule. A
polyethylene glycol extender is inserted between the ATP
aptamer 3−end and the 5′−end of the 7−nucleotide extension in
order to make signaling reversible.
   6.    Check your product on an agarose gel and add more PCR cycles
if the product yield is low, then check again. Start with eight
PCR cycles and, if the band on the agarose gel does not appear,
do four additional cycles. If you feel that your product is not
ampliﬁ ed any more you may add fresh DNA−polymerase.
Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

18
   7.    How much γ−[
32
P]− ATP   should be added in depends on how
radioactive the γ−[
32
P]−ATP is.
   8.    Before addition of the any solution to the micro−emulsion the
tip of the pipette is ﬁ lled with argon 5 times and the argon is
blown over the solution.
   9.    Calibration curves can also be constructed by adding increasing
amounts of an  ATP   or an ADP stock solution to the nanosensor
solution. However, the stock solutions of ATP and ADP must
have a neutral pH. Since three of the four phosphate hydroxyl
groups of ATP have p K  a  values around 4.5 stock solutions pre−
pared from adenosine 5′−triphosphate disodium hydrate
become very acidic and require large amounts of NaOH to
bring to neutral pH. Therefore, it is advised to prepare ATP
stock solution from adenosine 5′−triphosphate di(tris) salt
hydrate (tris =  tris (hydroxymethyl)aminomethane), which
makes stock solutions that are close to neutrality and therefore
require only small amounts of NaOH to bring to neutral
pH. Stock solutions of ADP are always close to  neutrality.
   10.    It may be necessary to treat the nanosensors with DNase or
RNase (1 U/mL) before insertion into cells. In this case it is
advised to repeat the calibration after treatment with DNase or
RNase.
Acknowledgements
This research was supported by EU FP7 Marie Curie program to
the Initial Training Network ISOLATE. Tine Daa Schrøder was
supported by the Lundbeck Foundation grant to the Nanomedicine
Research Center for Cancer Stem Cell−Targeting Therapeutics
(NanoCAN).
References
    1.    Goldbeter A (1996) Biochemical oscillations
and cellular rhythms: the molecular basis of
periodic and chaotic behaviour. Cambridge
University Press, Cambridge
    2.    Noack S, Wiechert W (2014) Quantitative
metabolomics: a phantom? Trends Biotechnol
32:238–244
    3.    Lalonde S, Eherhardt DW, Frommer WB
(2005) Shining light on signaling and meta−
bolic networks by genetically encoded biosen−
sors. Curr Opin Plant Biol 8:574–581
   4.    Gu H, Lalonde S, Okumoto S, Looger LL,
Scharff−Poulsen AM, Grossman AR, Kossman
J, Jakobsen I, Frommer WB (2006) A novel
analytical method for in vivo phosphate track−
ing. FEBS Lett 580:5885–5893
    5.    Imamura H, Nhat KP, Togawa H, Saito K,
Iino R, Kato−Yamada Y, Nagai T, Noji H
(2009) Visualization of ATP levels inside sin−
gle living cells with ﬂ uorescence resonance
energy transfer− based genetically encoded
indicators. Proc Natl Acad Sci U S A 106:
15651–15656
    6.    Aylott JW (2003) Optical nanosensors − an
enabling technology for intracellular measure−
ments. Analyst 128:309–312
Yi Long et al.

19
    7.    Lee YEK, Kopelman R (2012) Optical
nanoparticle sensors for quantitative intracel−
lular imaging. Wiley Interdiscip Rev Nanomed
Nanobiotechnol 1:98–110
    8.    Tuerk C, Gold L (1990) Systematic evolution
of ligands by exponential enrichment: RNA
ligands to bacteriophage t4 DNA polymerase.
Science 249:505–510
    9.    Ellington AD, Szostak JW (1990) In vitro
selection of RNA molecules that bind speciﬁ c
ligands. Nature 346:818–822
    10.    Tang ZW, Mallikaratchy P, Yang RH, Kim YM,
Zhu Z, Wang H, Tan WH (2008) Aptamer
switch probe based on intramolecular displace−
ment. J Am Chem Soc 130:11268–11269
    11.    Nielsen LJ, Olsen LF, Özalp VC (2010)
Aptamers embedded in polyacrylamide
nanoparticles: a tool for in vivo metabolite
sensing. ACS Nano 4:4361–4370
    12.    Özalp VC, Pedersen TR, Nielsen LJ, Olsen LF
(2010) Time−resolved measurements of intra−
cellular ATP in the yeast  Saccharomyces cerevi-
siae  using a newtype of nanobiosensor. J Biol
Chem 285:37579–37588
    13.    Ytting CK, Fuglsang AT, Hiltunen JK,
Kastaniotis AJ, Özalp VC, Nielsen LJ, Olsen
LF (2012) Measurements of intracellular ATP
provide new insight into the regulation of gly−
colysis in the yeast  Saccharomyces cerevisiae .
Integr Biol 4:99–107
    14.    Jing M, Yingmiao L, Zahid NR, Zhongguang
Y, Johannes HU, Bruce AS, Bryan MC (2010)
In vivo selection of tumor−targeting RNA
motifs. Nat Chem Biol 6:22–24
Selection of Aptamers for Metabolite Sensing…

21
Günter Mayer (ed.), Nucleic Acid Aptamers: Selection, Characterization, and Application, Methods in Molecular Biology,
vol. 1380, DOI 10.1007/978-1-4939-3197-2_2, © Springer Science+Business Media New York 2016
Chapter 2
SELEX of Cell-Speciﬁ c RNA Aptamers
Katharina Berg , Eileen Magbanua , and Ulrich Hahn
Abstract
   This chapter focuses on the selection of RNA aptamers, which bind to speciﬁ c cell surface components and
thus can be internalized receptor mediated. Such aptamers discriminate between different tissues, e.g.,
detect malignant cells, and target them or induce apoptosis through drug internalization. However, before
starting the selection process the choice of an ideal target can be challenging. To give an example for the
selection of cell speciﬁ c aptamers, we here used the interleukin−6 receptor (IL−6R) as a target, which is
presented on hepatocytes, neutrophils, monocytes, and macrophages.
Key words     Interleukin−6 receptor  ,    SELEX    ,   Internalization  ,    Delivery
1 Introduction
Cell surfaces exhibit a high amount of diverse lipids, proteins, and
carbohydrates, whereas their composition differs tremendously
between various cell types. Therefore aptamers can be selected for
a variety of targets like growth factors, adhesion molecules, and cell
surface receptors which are exclusively presented on special cell
types [ 1 ]. Such aptamers can differentiate between cell types, for
example healthy and tumor cells or even different types of cancer
cells [ 2 – 5 ]. Therefore cell−speciﬁ c aptamers have a high potential
for diagnosis and as therapeutics.
By targeting a cell surface molecule that underlies natural
internalization processes, an aptamer can act as a molecular carrier
to convey ﬂ uorophores, chemotherapeutics, or other agents into
cells [ 3 ,  6 – 9 ]. A prerequisite is that binding of the aptamer (includ−
ing its cargo) does not interfere with the natural transport mecha−
nism of the receptor.
In some cases, aptamer binding can interfere with receptor−
ligand interaction or the receptor recycling processes, thus inhibit−
ing the binding of natural ligands and/or altering the subsequent
signal transduction [ 10 ]. However, recycling processes of most cell
surface lipids, receptors, or tumor markers are still not completely

22
understood. Though there are some reports on internalized cell
speciﬁ c aptamers, the localization of both aptamer and delivered
cargo cannot be predicted and determined easily and differs
depending on the respective receptor and cargo.
One example of such an aptamer represents PSM−A10, an
RNA aptamer, which inhibits the prostate−speciﬁ c membrane anti−
gen ( PSMA  ) with a  K  i  of 11.9 nM. PSM−A10 is able to bind
LNCaP human prostate cancer cells presenting PSMA, but not
PSMA−devoid PC−3 human prostate cancer cells [ 4 ]. It can be
used for the localized delivery of  siRNA   molecules, polymer
nanoparticles, or toxins like gelonin [ 6 – 8 ].
Another example is an RNA aptamer named AIR−3 as well as
its truncated form AIR−3A, which interact with high afﬁ nity
( K  d  = 20 nM) and speciﬁ city with the human interleukin−6 receptor
(IL−6R) [ 11 ]. AIR−3A is also able to deliver therapeutic agents,
such as chlorin e6 (ce6), into its target cell. This enables a speciﬁ c
ce6−mediated photodynamic therapy [ 12 ]. AIR−3 even might be
used for targeted chemotherapy when intrinsically comprising the
cytostaticum 5−ﬂ uoro−2′−deoxy−uridine [ 13 ].
The selection of aptamers consists of three main steps: The ﬁ rst
step is the incubation of an RNA library with the target molecule.
This library consists of around 10
14
  different sequences, which
share a randomized region of 30–50 nucleotides (N30–50). This
region is ﬂ anked by two constant regions for T7−transcription and
RT−PCR.
After incubation, bound and unbound oligonucleotides are
separated. In a common in vitro selection procedure, the target
molecule is immobilized on a column or beads, while other proto−
cols utilize gel electrophoresis or nitrocellulose membrane ﬁ ltra−
tion [ 14 ,  15 ]. In the last step of each  SELEX   cycle, bound
molecules are eluted, ampliﬁ ed via RT−PCR, and then transcribed
to generate an enriched pool of RNA oligonucleotide species for
the next selection round. This iterative process is repeated 5–15
times, followed by cloning and sequencing of the dsDNA library
[ 16 ,  17 ].
Obtained oligonucleotides can be characterized for their bind−
ing abilities and their speciﬁ city either by protein−RNA interaction
assays like ﬁ lter retention, electric mobility shift, and plasmon reso−
nance assays or directly on cells using ﬂ ow cytometry or confocal
microscopy. Subsequently to the  SELEX   procedure, the afﬁ nity of
the aptamers to cells has to be determined. Therefore, the aptamer
is ﬂ uorescently labelled. Adequate control cells omitting the target
protein are required to conﬁ rm speciﬁ city of the aptamers and
allow characterizations (e.g., toxicity, inhibiting or activating
events, aptamer internalization).
The interleukin−6 receptor, used as an aptamer target by our
group, interacts with its cytokine interleukin−6 (IL−6) and two gly−
coproteins 130 (gp130). The resulting gp130 dimerization
Katharina Berg et al.

23
initiates an intracellular signal transduction, in which event the
expression of various genes is activated [ 18 ,  19 ]. We used Ba/F3/
gp130/IL6R/TNF cells to analyze the inﬂ uence of the aptamer
on signal transduction and examined receptor mediated endocyto−
sis. As a control cell line Ba/F3/gp130/TNF cells without IL−6R
were used.
Generally, before starting a  SELEX   there are some aspects,
which have to be taken into account. In most cases, it is indispens−
able to use a soluble form of the target, often corresponding to the
extracellular domain of a cell surface protein if that has been cho−
sen. Nevertheless it needs to be ensured, that the protein is cor−
rectly folded and fully functional. If the cell surface protein of
choice cannot be produced in its soluble form, cell−SELEX [ 20 – 22 ]
would be a favorable alternative. For a successful SELEX experi−
ment, it is desirable to have as much information as possible about
the structure as well as the physical and chemical properties of the
target protein. This is required to assess ideal buffer conditions,
immobilization of the target and an appropriate pre− or counterse−
lection molecule to enhance the selectivity. Some chosen targets
might be highly glycosylated or some just might be difﬁ cult to
purify, rendering selection more challenging.
If the selected RNA aptamer is planned to be used in vivo, it
might be necessary or at least advantageous to enhance its stability.
Post−selective modiﬁ cations can interfere with aptamer folding and
target interaction, it is therefore recommended to use a stabilized
RNA library (e.g., with 2′− O −methyl or 2′−ﬂ uoro modiﬁ cations)
directly in the  SELEX   process [ 21 ,  23 – 25 ]. For certain applica−
tions, DNA aptamers might be preferential [ 26 ].
2 Materials
Prepare all solutions RNase−free ( see   Note 1 ).
       1.    100 μM single strand DNA library: 5′−AATGCTAATACGACT
CACTATAGG AAGAAAGAGGTCTGAGACATTCT–N50–
CTTCTGGAGTTGACGTTGCTT−3 ′ ( see   Note 2 ).
   2.    100 μM RT primer: 5′−AAGCAACGTCAACTCCAGAAG−3 ′
   3.    Klenow Fragment (5 U/μL), 10× Klenow Fragment buffer:
500 mM Tris−HCl (pH 8.0 at 25 °C), 50 mM MgCl 2 , 10 mM
DTT.
   4.    10× hybridization buffer: 200 mM Tris−HCl, pH 8.0, 500
mM NaCl, 10 mM EDTA.
   5.    dNTP mix: 25 mM  ATP  , 25 mM CTP, 25 mM GTP, 25 mM
TTP.
   6.    20 U/μL T7 RNA Polymerase ( see   Note 3 ).
2.1 Preparation
of RNA Library
and In Vitro T7
Transcription
SELEX of Cell-Speciﬁ c RNA Aptamers

24
   7.    5× transcription buffer: 200 mM Tris−HCl, pH 7.9.
   8.    100 mM MgCl
2 .
   9.    NTP−mix A: 25 mM  ATP  , 25 mM CTP, 25 mM GTP, 25 mM
UTP ( see   Note 4 ).
       1.    100 μg soluble IL−6R (sIL_6R) (Conaris).
   2.    2 mg  Sulfo −NHS−LC− Biotin  .
   3.    Phosphate−buffered saline (PBS): 0.14 M NaCl, 2.7 mM KCl,
1.5 mM KH 2 PO
4 , 6.5 mM NaH
2 PO
4 , pH 7.4.
   4.     SELEX   buffer: 3 mM MgCl
2  in PBS ( see   Note 5 ).
   5.    Slide−A−Lyzer
®
  dialysis cassette (MWCO 10K; Thermo Fisher
Scientiﬁ c) ( see   Note 6 ).
   6.    Nitrocellulose membrane.
   7.    ExtrAvidin
®
  Alkaline phosphatase.
   8.    Blocking buffer: 5 % (w/v) skim milk powder in PBS.
   9.    AB buffer: 2.5 % (w/v) skim milk powder in PBS.
   10.    Reaction buffer: 100 mM Tris−HCl, pH 9.5, 4 mM MgCl
2 .
   11.    AP solution: 0.01 % (w/v) 5−bromo−4−chloro−3−indoxyl phos−
phate, 0.002 % (w/v) nitro blue tetrazolium chloride in reac−
tion buffer.
       1.    Dynabeads
®
  M−280  Streptavidin   (Invitrogen).
   2.    Magna−Sep™ Magnetic Particle Separator.
   3.     SELEX   buffer: 3 mM MgCl
2  in PBS.
   4.    BSA solution: 20 μg/μL in water.
   5.    Coupling buffer A: 1 μg BSA/μL, 1× PBS, pH 7.4.
   6.    Coupling buffer B: 1 μg BSA/μL, 1.25× PBS, pH 7.4.
       1.    5 U/μL FIREPol
®
  DNA Polymerase (Solis BioDyne).
   2.    10× PCR reaction buffer B: 0.8 M Tris−HCl, 0.2 M (NH
4 ) 2 SO 4 ,
0.2 % w/v Tween−20 (Solis BioDyne).
   3.    15 U/μL SuperScript™ III Reverse Transkriptase.
   4.    5× cDNA synthesis buffer: 250 mM Tris−acetate, pH 8.4, 375
mM potassium acetate, 40 mM magnesium acetate.
   5.    25 mM MgCl 2 .
   6.    100 mM DTT.
   7.    dNTPmix: 25 mM  ATP  , 25 mM CTP, 25 mM GTP, 25 mM
TTP.
   8.    100 μM RT primer: 5′−AAGCAACGTCAACTCCAGAAG−3 ′.
   9.    100 μM T7 primer: 5′− AATGCTAATACGACTCAC TATA G
GAAGAAAGAGGTC TGAGACATT−3 ′.
2.2 Biotinylation
of Target Protein
2.3 Immobilization
on Streptavidin -
Coated Dynabeads
2.4 Reverse
Transcription -
Polymerase Chain
Reaction
Katharina Berg et al.

25
       1.    TOPO TA Cloning Kit (pCR2.1).
       1.    [α−
32
P]− ATP   (3000 Ci/mmol, 10 mCi/mL, Hartmann
Analytic).
   2.    NTP−mix B: 25 mM  ATP  , 25 mM CTP, 25 mM GTP, 25 mM
UTP.
   3.     SELEX   buffer: 3 mM MgCl 2  in PBS.
   4.    Aminohexanoic acid buffer: 20 % (v/v) Methanol; 40 mM
6−aminohexanoic acid.
   5.    Filtering paper (e.g., Rotilabo
®
−Blottingpaper, Carl Roth).
   6.    500 μM sIL−6R (Conaris).
   7.    Nitrocellulose membrane (0.45 μm).
   8.    Minifold
®
  I dot−blot−system (e.g., Schleicher & Schuell).
       1.    10 μM ﬂ uorescently labeled RNA ( see   Note 7 ).
   2.    Mouse anti−human Interleukin−6 receptor antibody (Bender
MedSystems) ( see   Note 7 ).
   3.    Mouse anti−human gp130 antibody (R&D Systems) ( see   Note 8 ).
   4.    Goat anti−mouse Ig–APC (BD Pharmingen).
   5.    Ba/F3/gp130/IL6R/TNF cells.
   6.    Ba/F3/gp130/TNF cells.
   7.     SELEX   buffer: 3 mM MgCl 2  in PBS.
   8.    FACSCalibur ﬂ ow cytometer (BD Bioscience).
3 Methods
       1.    Heat 2.5 μL ssDNA library (100 μM) with 5 μL RT primer
(100 μM), 5 μL hybridization buffer (10×), and 37.5 μL water
to 95 °C for 5 min and cool down slowly to room temperature
afterwards.
   2.    Mix 50 μL hybridization product with 1 μL Klenow Fragment
(10 U/μL), 10 μL Klenow Fragment buffer, 2 μL dNTPs (25
mM), and 37 μL water and incubate for 1 h at 37 °C. Then
inactivate Klenow Fragment by heating to 75 °C for 10 min.
   3.    For in vitro transcription, mix 20 μL double−strand DNA
library with 20 μL transcription buffer (5×), 15 μL MgCl 2
(100 mM), 10 μL NTP−Mix (25 mM), 1 μL T7 RNA
Polymerase (25 U/μL), and 34 μL water and incubate for
30 min at 37 °C.
       1.    Dissolve 2 mg Sulfo−NHS−LC− Biotin   in 360 μL water (yield−
ing a 10 mM solution, which needs to be diluted to 1 mM) ( see
Note 9 ).
2.5 Cloning
2.6 Filter
Retention Assay
2.7 Flow Cytometry
3.1 Preparation
of RNA Library
3.2 Biotinylation
of Target Protein
SELEX of Cell-Speciﬁ c RNA Aptamers

26
   2.    Mix 100 μL sIL−6R (1.15 μg/μL) with 8.8 μL freshly prepared
Sulfo−NHS−LC− Biotin   reagent (1 mM) and incubate on ice for
15 min. Afterwards incubate for additional 15 min at room
temperature ( see   Note 10  and 11).
   3.    Remove excess of non−reacted and hydrolyzed biotin reagent
by dialysis with Slide−A−Lyzer
®
  dialysis cassette. Therefore, ﬁ ll
mixture into the dialysis cassette and dialyze in 500 mL stirring
SELEX   buffer for 1 h at 4 °C. Then exchange the buffer and
dialyze the mixture overnight.
   4.    Verify biotinylation by dot blot analysis. Therefore, place 3 μL
of biotinylated protein on a nitrocellulose membrane and 3 μL
non−biotinylated protein next to it. Let drops dry up.
   5.    Place the membrane in 25 mL blocking buffer for 1 h at room
temperature and swing gently. Next, wash membrane brieﬂ y in
25 mL PBS, place the membrane in 25 mL AB buffer with 10
μL ExtrAvidin
®
  Alkaline phosphatase for 1 h at room tempera−
ture, and swing gently again.
   6.    Wash the membrane twice in 25 mL PBS and once in 25 mL
reaction buffer for 5 min at room temperature, respectively.
   7.    Add 25 mL reaction buffer to the membrane including 12.5
μL AP solution and incubate until color reaction signiﬁ cantly
appears. To stop reaction transfer the membrane into water.
        1.    Transfer 500 μL Dynabeads
®
  into a reaction tube and put it
into the magnetic particle separator for magnetic separation
( see   Note 10 ). Discard supernatant, take reaction tube out of
separator, and resolve the beads in 1 mL coupling buffer A ( see
Note 12 ). Repeat this washing step four times.
   2.    Add 100 μg biotinylated protein to the beads and incubate for
15 min at 4 °C. Wash the beads ﬁ ve times with 500 μL cou−
pling buffer A and then twice with 500 μL coupling buffer B.
   3.    Store the beads in 1.5 mL coupling buffer B at 4 °C.
       1.    For the initial round of selection, mix 500 pmol of the RNA
library with 100 pmol target protein immobilized on magnetic
beads in  SELEX   buffer and incubate for 30 min at
37 °C. Discard unbound RNA by magnetic separation ( see
Subheading  3.3 ) and wash beads with 200 μL SELEX buffer
( see   Note 13 ).
   2.    Elute bound RNA by resuspending magnetic beads in 50 μL
water and heat for 3 min at 80 °C. Then separate RNA con−
taining water from magnetic beads by magnetic separation and
transfer supernatant to a new reaction tube for reverse
transcription− polymerase chain reaction (RT−PCR).
   3.    For RT−PCR mix the following components: 50 μL eluate
from  step 2 , 10 μL 10× PCR reaction buffer B, 4 μL 5× cDNA
3.3 Immobilization
on Streptavidin -
Coated Dynabeads
3.4 SELEX
Katharina Berg et al.

27
synthesis buffer, 6 μL 25 mM MgCl
2 , 1.2 μL dNTPmix, 1 μL
RT primer, 1 μL T7 primer, 2 μL DTT, and 22.8 μL water.
Incubate samples at 65 °C for 5 min and cool down to room
temperature afterwards.
   4.    Add 1 μL SuperScript™ III Reverse Transcriptase and 1 μL
FIREPol
®
  DNA polymerase and incubate reaction mix for
10 min at 54 °C for reverse transcription.
   5.    Use reaction mixture from  step 4  instantly for PCR ampliﬁ ca−
tion comprising following steps: denaturing for 30 s at 95 °C,
annealing for 30 s at 60 °C and elongation for 30 s at 72 °C
and appropriate number of PCR cycles ( see   Note 14 ). Verify
PCR product by performing standard polyacrylamide gel
electrophoresis.
   6.    Transcribe resulting double stranded DNA (dsDNA) of  step 5
into RNA. Therefore, mix 10 μL dsDNA with 20 μL 5× tran−
scription buffer, 15 μL MgCl 2 , 10 μL NTP−mix A, 1 μL T7 RNA
polymerase and 44 μL water and incubate for 30 min at 37 °C.
   7.    Verify RNA by performing polyacrylamide gel electrophoresis.
   8.    Start new selection round with 20 μL obtained RNA ( see
Note 15 ).
   9.    To investigate individual clones, clone dsDNA library via
TOPO TA cloning ( see   Note 16 ) and perform sequence
analysis.
       1.    Perform T7 transcription to radioactively label RNA. Therefore,
mix 10 μL dsDNA with 20 μL 5× transcription buffer, 15 μL
MgCl 2 , 10 μL NTP mix B, 1 μL [α−
32
P]− ATP  , and 1 μL T7 RNA
polymerase with 43 μL water and incubate overnight at 37 °C.
   2.    Isolate RNA product by gel puriﬁ cation and dissolve RNA in
20 μL of water.
   3.    Mix 1 μL of radioactively labeled RNA (<1 nM) with 199 μL
SELEX   buffer.
   4.    Dilute target protein in  SELEX   buffer to a concentration of 5
μM in a total volume of 12 μL ( see   Note 17 ). For serial protein
dilution mix 6 μL 5 μM protein with 6 μL SELEX buffer and
continue to dilute the protein four times.
   5.    Start binding assay: mix 5 μL of each protein dilution with 20
μL RNA ( step 3 ) and incubate for 30 min at 22 °C. As nega−
tive control, dilute 20 μL RNA with 5 μL  SELEX   buffer ( see
Note 18 ).
   6.    Cut one ﬁ lter paper and nitrocellulose membrane to the size of
the dot blot apparatus. Equilibrate nitrocellulose membrane in
aminohexanoic acid buffer for 30 min at room temperature.
Afterwards, equilibrate both nitrocellulose membrane and ﬁ l−
ter paper in  SELEX   buffer for at least 5 min.
3.5 Filter
Retention Assay
SELEX of Cell-Speciﬁ c RNA Aptamers

28
   7.    Assemble dot blot apparatus. Therefore, place ﬁ lter paper
beneath the nitrocellulose membrane inside dot blot apparatus.
   8.    Apply vacuum on dot blot apparatus and wash each well twice
with 200 μL  SELEX   buffer.
   9.    Transfer all samples into the dot blot apparatus in respective
wells and let the samples completely pass through the mem−
brane ( see   Note 19 ).
   10.    Wash each well twice with 200 μL  SELEX   buffer and let buffer
completely pass through the membrane. Then take out the
nitrocellulose membrane and let it dry.
   11.    Prepare 100 % controls. Mix 5.4 μL  SELEX   buffer with 0.6 μL
radioactively labeled RNA. Apply twice 2 μL to the membrane
and let it dry.
   12.    Transfer membrane into a plastic bag and expose properly until
analysis.
   13.    For analysis use a phosphor imager.
   14.    Quantify intensities of the dots and calculate dissociation con−
stant (Fig.  1 ).
Fig. 1   ( a ) Filter retention assay. Constant amounts (<1 nM) of
32
P-radioactively
labeled aptamer AIR-3 or RNA starting library R1 were incubated with increasing
amounts of sIL-6R (0–300 nM). Protein-bound RNA could be visualized by auto-
radiography. To quantify the amount of RNA a 500 or 100 % control is used. ( b )
To calculate dissociation constants, fractions of bound RNA molecules (AIR-3A,
red ; library,  black ) were plotted against the concentrations of sIL-6R (logarithmic
scale). Data points represent mean values of ten independent measurements
(further details  see   [ 11 ] )

Katharina Berg et al.

29
          Perform all steps at 4 °C and use  SELEX   buffer pre−cooled to 4 °C
( see   Note 20 ).
    1.    Count cells and use 1 × 10
5
  cells for each sample.
   2.    Wash cells twice. Therefore, pellet cells for 3 min at 800 ×  g  and
resuspend with 350 μL  SELEX   buffer ( see   Note 21   and 22 ).
    (a)    Control cells are not further treated
(b) Aptamer binding: Add 1 μL ﬂ uorescently labeled RNA
aptamer (10 pmol) to the cells and incubate for 30 min on ice.
(c) IL−6R and gp130 veriﬁ cation: Add either 1 μL IL−6R
antibody or gp130 antibody to the cells and incubate for
30 min on ice. Then wash cells once with  SELEX   buffer
and add 1 μL anti−mouse Ig–APC antibody to the cells
and incubate for another 30 min on ice.
      3.    Wash cells once with 350 μL  SELEX   buffer.
   4.    Determine ﬂ uorescence intensities by ﬂ ow cytometry analysis
and compare intensities (Fig.  2 ).
4 Notes
     1.    Aqueous solutions can be treated with diethylpyrocarbonate
(DEPC) to inactivate RNases due to acetylation of histidine,
lysine, cysteine and tyrosine residues. Therefore solution is
3.6 Flow Cytometry
Fig. 2   ( a ) Flow cytometry    analysis. Upon binding of Atto-647 N-labeled Aptamer
AIR-3A ( red ) to BAF/gp130/IL6R/TNF cells presenting the human IL-6 receptor,
ﬂ uorescence shifts to higher values. Cells incubated with the variant G17U
(Atto647N-labeled control,  black ) resulted in a smaller shift compared to
AIR-3A. Laser scanning microscopic image of AIR-3A ( b ) or its variant G17U ( c )
with BAF/gp130/IL6R/TNF cells. The aptamer ( b ) is internalized into these cells
(further details  see   [ 11 ] )

SELEX of Cell-Speciﬁ c RNA Aptamers

30
treated with 0.1 % (v/v) DEPC and stirred overnight.
Autoclaving afterwards leads to destruction of DEPC. Tris
buffered solutions should not be treated with DEPC as it
inactivates DEPC. Alternatively, RNase−free water derived
from special ﬁ ltration plants can be used.
   2.    Given are sequences of a library used for the selection of aptam−
ers binding to the human interleukin−6 receptor [ 11 ].
Randomized region can be optimized regarding length and
given secondary structure (e.g., inserting a stem loop region).
Optimal lengths of randomized region are between 20 and 50
nucleotides.
   3.    Instead of wild type RNA polymerase, variants (e.g., RNAP
Y639F or R425C) can be used which are able to incorporate
modiﬁ ed nucleotides.
   4.    Unmodiﬁ ed standard nucleotides can be replaced by modiﬁ ed
nucleotides (e.g., 2′−ﬂ uoronucleotides,  O −methyl nucleotides),
which require the usage of specialized RNA polymerases.
Mostly the reaction time needs to be increased to 4 h instead
of 30 min.
   5.    Alternatively, other dialysis cassettes, membranes, tubes, and
suchlike can be used.
   6.    If the target protein exhibits a very low isoelectric point the use
of positive ions, e.g., calcium ions are recommended.
   7.    Fluorescently labeled RNA can be purchased or labeled by
inserting ﬂ uorescing nucleotide analogs during T7 transcrip−
tion (e.g., guanosine−5′− O −(3−thiotriphosphate)).
   8.    Choose antibodies which are applicable for FACS measurements.
   9.    There are several types of magnetic beads to choose from. In
the given example streptavidin coated beads were used, but
also the chemical coupling to carboxyl beads is possible.
   10.    Prepare  Sulfo −NHS−LC− Biotin   reagent immediately before
usage.
   11.     Sulfo −NHS−LC− Biotin   reagent should be used at threefold
molar excess to the protein.
   12.    Dynabeads
®
  are paramagnetic polystyrene particles that can be
separated by a magnet. Placing a reaction tube which contains
Dynabeads
®
  into the Magnetic Particle Separator always leads
directly to magnetic separation. Successful separation can be
observed when solution cleared up.
   13.    Prevent the magnetic beads to become dry.
   14.    In the course of selection, the number of washing steps is increased
to favor the selection of high afﬁ nity nucleic acids. So start with
one washing step and add one step in each selection round.
   15.    The optimal number of PCR cycles lies between 4 and 20. To
prevent formation of PCR side products emulsion PCR (e.g.,
Katharina Berg et al.

31
Micellula DNA Emulsion & Puriﬁ cation Kit by EUR
X ) can be
performed alternatively [ 27 ].
   16.    Stop  SELEX   procedure after 10–15 rounds. The number of
selection rounds depends on the afﬁ nity of the nucleic acid
pool to the target. If the whole library is analyzed by next gen−
eration sequencing less round are required.
   17.    To increase the enrichment of nucleic acids which are only
binding to the target molecule and not to Dynabeads
®
  or
Streptavidin  , it is common to do a preSELEX prior to each
SELEX   round. Therefore use Dynabeads
®
  with only biotin and
incubate them at 37 °C for 30 min with the prior round ﬁ rst.
Then use the supernatant as described above in the actual
SELEX round. In this step it is also possible to use Dynabeads
®

coupled with non−target molecules to exclude those nucleic
acids which are not binding speciﬁ cally.
   18.    Using a Taq polymerase for polymerase chain reaction leads to
adenine overhangs at the 3′−end of the PCR product. These
overhangs are required for successful TA cloning. Alternatively
to the mentioned TOPO TA cloning kit, a vector can be used
which exhibits 5′−thymine overhangs after restriction (e.g.,
endoribonuclease XcmI), or standard cloning can be per−
formed at restriction sites which were added during polymerase
chain reaction or presented within the primer sites.
   19.    12 μL 5 μM protein solution is needed to perform one binding
assay with one sample of RNA. If several aptamers are analyzed
simultaneously, protein amount has to be increased
proportionally.
   20.    End concentrations of protein are 1000, 0.500, 0.250, 0.125,
0.063, and 0.031 μM.
   21.    Avoid touching the nitrocellulose membrane with the tip. The
membrane can be damaged and distort results.
   22.    Resuspend cells gently, prevent formation of foam, and carry
out all steps quickly without delay to prevent cell death.
References
    1.    Mager MD, LaPointe V, Stevens MM (2011)
Exploring and exploiting chemistry at the cell
surface. Nat Chem 3:582–589
    2.    Davis KA, Lin Y, Abrams B, Jayasena SD
(1998) Staining of cell surface human CD4
with 2′−F−pyrimidine−containing RNA aptam−
ers for ﬂ ow cytometry. Nucleic Acids Res
26:3915–3924
    3.    Li N, Ebright JN, Stovall GM, Chen X, Nguyen
HH, Singh A, Syrett A, Ellington AD (2009)
Technical and biological issues relevant to cell
typing with aptamers. J Proteome Res
8:2438–2448
    4.    Lupold SE, Hicke BJ, Lin Y, Coffey DS (2002)
Identiﬁ cation and characterization of nuclease−
stabilized RNA molecules that bind human
prostate cancer cells via the prostate−speciﬁ c
membrane antigen. Cancer Res 62:4029–4033
    5.    Shangguan D, Tang Z, Mallikaratchy P, Xiao
Z, Tan W (2007) Optimization and modiﬁ ca−
tions of aptamers selected from live cancer cell
lines. Chembiochem 8:603–606
SELEX of Cell-Speciﬁ c RNA Aptamers

32
     6.    Chu TC, Marks JW 3rd, Lavery LA, Faulkner
S, Rosenblum MG, Ellington AD, Levy M
(2006) Aptamer:toxin conjugates that speciﬁ −
cally target prostate tumor cells. Cancer Res
66:5989–5992
   7.    Chu TC, Twu KY, Ellington AD, Levy M
(2006) Aptamer mediated siRNA delivery.
Nucleic Acids Res 34:e73
    8.    Farokhzad OC, Jon S, Khademhosseini A,
Tran TN, Lavan DA, Langer R (2004)
Nanoparticle−aptamer bioconjugates: a new
approach for targeting prostate cancer cells.
Cancer Res 64:7668–7672
    9.    Ray P, Cheek MA, Sharaf ML, Li N, Ellington
AD, Sullenger BA, Shaw BR, White RR (2012)
Aptamer−mediated delivery of chemotherapy
to pancreatic cancer cells. Nucleic Acid Ther
22:295–305
    10.    Kraus E, James W, Barclay AN (1998) Cutting
edge: novel RNA ligands able to bind CD4
antigen and inhibit CD4+ T lymphocyte func−
tion. J Immunol 160:5209–5212
       11.    Meyer C, Eydeler K, Magbanua E, Zivkovic T,
Piganeau N, Lorenzen I, Grotzinger J, Mayer
G, Rose−John S, Hahn U (2012) Interleukin−6
receptor speciﬁ c RNA aptamers for cargo deliv−
ery into target cells. RNA Biol 9:67–80
    12.    Kruspe S, Meyer C, Hahn U (2014) Chlorin
e6 conjugated interleukin−6 receptor aptamers
selectively kill target cells upon irradiation. Mol
Ther Nucleic Acids 3:e143
    13.    Kruspe S, Hahn U (2014) An aptamer intrinsi−
cally comprising 5−ﬂ uoro−2′−deoxyuridine for
targeted chemotherapy. Angew Chem Int Ed
Engl 53:10541–10544
    14.    Gopinath SC (2007) Methods developed for
SELEX. Anal Bioanal Chem 387:171–182
    15.    Jing M, Bowser MT (2013) Tracking the
emergence of high afﬁ nity aptamers for
rhVEGF165 during capillary electrophoresis−
systematic evolution of ligands by exponential
enrichment using high throughput sequenc−
ing. Anal Chem 85:10761–10770
    16.    Gu G, Wang T, Yang Y, Xu X, Wang J (2013)
An improved SELEX−Seq strategy for charac−
terizing DNA−binding speciﬁ city of transcrip−
tion factor: NF−kappaB as an example. PLoS
One 8:e76109
    17.    Schutze T, Wilhelm B, Greiner N, Braun H,
Peter F, Morl M, Erdmann VA, Lehrach H,
Konthur Z, Menger M, Arndt PF, Glokler
J (2011) Probing the SELEX process with
next−generation sequencing. PLoS One
6:e29604
    18.    Guo Y, Xu F, Lu T, Duan Z, Zhang Z (2012)
Interleukin−6 signaling pathway in targeted
therapy for cancer. Cancer Treat Rev
38:904–910
    19.    Ozbek S, Grotzinger J, Krebs B, Fischer M,
Wollmer A, Jostock T, Mullberg J, Rose−John
S (1998) The membrane proximal cytokine
receptor domain of the human interleukin−6
receptor is sufﬁ cient for ligand binding but not
for gp130 association. J Biol Chem
273:21374–21379
    20.    Mayer G, Ahmed MS, Dolf A, Endl E, Knolle
PA, Famulok M (2010) Fluorescence−activated
cell sorting for aptamer SELEX with cell mix−
tures. Nat Protoc 5:1993–2004
    21.    Meyer C, Hahn U, Rentmeister A (2011) Cell−
speciﬁ c aptamers as emerging therapeutics.
J Nucleic Acids 2011:904750
    22.    Sefah K, Shangguan D, Xiong X, O’Donoghue
MB, Tan W (2010) Development of DNA
aptamers using Cell−SELEX. Nat Protoc
5:1169–1185
    23.    Ibach J, Dietrich L, Koopmans KR, Nobel N,
Skoupi M, Brakmann S (2013) Identiﬁ cation
of a T7 RNA polymerase variant that permits
the enzymatic synthesis of fully 2′−O−methyl−
modiﬁ ed RNA. J Biotechnol 167:287–295
   24.    Padilla R, Sousa R (2002) A Y639F/H784A
T7 RNA polymerase double mutant displays
superior properties for synthesizing RNAs with
non−canonical NTPs. Nucleic Acids Res
30:e138
    25.    Meyer C, Berg K, Eydeler−Haeder K, Lorenzen
I, Grotzinger J, Rose−John S, Hahn U (2014)
Stabilized Interleukin−6 receptor binding RNA
aptamers. RNA Biol 11:57–65
    26.    Faryammanesh R, Lange T, Magbanua E, Haas
S, Meyer C, Wicklein D, Schumacher U, Hahn
U (2014) SDA, a DNA aptamer inhibiting E−
and P−selectin mediated adhesion of cancer and
leukemia cells, the ﬁ rst and pivotal step in tran−
sendothelial migration during metastasis for−
mation. PLoS One 9:e93173
    27.    Shao K, Ding W, Wang F, Li H, Ma D, Wang
H (2011) Emulsion PCR: a high efﬁ cient way
of PCR ampliﬁ cation of random DNA libraries
in aptamer selection. PLoS One 6:e24910
Katharina Berg et al.

33
Günter Mayer (ed.), Nucleic Acid Aptamers: Selection, Characterization, and Application, Methods in Molecular Biology,
vol. 1380, DOI 10.1007/978-1-4939-3197-2_3, © Springer Science+Business Media New York 2016
Chapter 3
Developing Aptamers by Cell-Based SELEX
Silvia Catuogno , Carla Lucia Esposito , and Vittorio de Franciscis
Abstract
   The reliable targeting of cell surface disease−associated proteins is a major challenge in chemical biology
and molecular medicine. In this regard, aptamers represent a very attractive and innovative class of ligand
molecules. Aptamers are generated by a reiterated in vitro procedure, named SELEX (Systematic Evolution
of Ligands by Exponential enrichment). In order to generate aptamers for heavily modiﬁ ed cell surface−
bound proteins and transmembrane receptors, the SELEX procedure has been recently adapted to the use
of living cells as complex targets (referred as “cell−SELEX”).
Here we give an overview on the most recent advances in the ﬁ eld of cell−SELEX technology, provid−
ing a detailed description of the differential cell−SELEX approach that has been developed in our labora−
tory to identify speciﬁ c signatures for human malignant glioma and non−small−cell lung cancer. The
procedures used for the evaluation of binding speciﬁ city and for the preliminary identiﬁ cation of potential
target receptors will be also described.
Key words    Cell−SELEX    ,    Aptamer    ,   NSCLC  ,    Glioma    ,   RTK
1 Introduction
   Several important human diseases, including cancer and metabolic
diseases are characterized by the presence of various alterations in
cell−surface proteins. Changes in the expression level, localization
or structural changes are frequently the cause of abnormal intracel−
lular signaling ultimately determining the pathological states.
Therefore, the speciﬁ c targeting of disease−associated membrane
proteins has recently become a challenge for the development of
new therapeutic or diagnostic tools.
In this perspective, nucleic acid aptamers are revealing highly
promising tools to identify and target cell−surface proteins [ 1 ].
Aptamers are short single stranded DNA/RNA molecules that
resemble antibodies in many ways. By folding into complex tertiary
structures, these oligonucleotides bind with high afﬁ nity and
speciﬁ city their target proteins, thus often leading to the modulation
of their activity [ 2 ].
1.1 Cell-Based
SELEX

34
Aptamers show many advantages over proteins or antibodies:
(1) they are chemically synthesized avoiding the use of animal cells,
thus providing high batch−to−batch ﬁ delity; (2) they can be easily
modiﬁ ed to enhance their stability, bioavailability and pharmacoki−
netics; (3) depending on their formulation, aptamers are usually
poorly or not immunogenic [ 3 ].
Different approaches have been adopted to generate aptamers
for cell surface molecular targets. In many cases, soluble puriﬁ ed
cell surface proteins have been used as targets for aptamer selection
in vitro (protein− SELEX  ) [ 4 – 7 ]. Although this approach shows the
advantage to be conducted under well−controlled conditions, the
selection is performed in a non−physiological context, leading to
the possibility that the selected aptamer might not recognize the
same target in its native conformation.
The application of the  SELEX   technology using whole living
cells (cell−SELEX) as complex target allows to overcome this
problem by selecting aptamers under native conditions in a
physiological context. Globally three variants of cell−SELEX have
been adopted that permit to achieve different objectives (Fig.  1 ).
   A ﬁ rst strategy (Fig.  1a ) allows to select aptamers against a
previously identiﬁ ed target protein, by using in the positive selection
step an engineered cell line forced to express the recombinant tar−
Unbound
aptamers
Collect bound aptamers Collect bound aptamers
Search for aptamers against the
desired overexpressed RTK Identify RTK targets of the
best binders
Unbound
aptamers
Collect internalizing
aptamers
Identify RTK targets of the
best internalizing aptamers
Unbound
aptamers
Counter-selection
Positive selection
a) Cell-SELEX
against a known target
b) Differential cell-SELEX c) Cell internalization SELEX
Fig. 1 Schematic representation of three variant of cell-based SELEX proposed to achieve different objectives:
( a ) protocol to select aptamers against a known target; ( b ) protocol to identify a speciﬁ c cell signature without
a prior knowledge of the target protein; ( c ) protocol to speciﬁ cally select cell internalizing aptamers

Silvia Catuogno et al.

35
get protein. To avoid the parallel enrichment of aptamers for
unwanted targets, the introduction at each round of one (or more)
counter−selection steps with parental cells is required. To date, several
groups have successfully adopted this strategy to generate aptamers
that speciﬁ cally bind cell surface receptors.
An innovative cell− SELEX   strategy has been successfully
applied to develop aptamers that speciﬁ cally bind the transforming
growth factor−β type III receptor (TGFβRIII) [ 8 ], ectopically
expressed on the surface of Chinese hamster ovary (CHO) cells,
as well as to generate a high−afﬁ nity ssDNA aptamer that speciﬁ cally
binds to the HCV E2 envelope glycoprotein [ 9 ]. This technique
offers the possibility to favor the selection of target−speciﬁ c aptam−
ers since the selective pressure is increased by the overexpression of
the target protein coupled to the use of an appropriate counter−
selection procedure.
An alternative strategy (referred to as “differential cell− SELEX      ”)
(Fig.  1b ) allows targeting of a speciﬁ c cell type without any prior
knowledge of the target protein, thus leading to the identiﬁ cation
of multiple ligands able to discriminate among even closely related
cell phenotypes. In this case, two different cell lines, or the same
cell line under different growth conditions or insults, are used in
the positive and in the counter−selection steps. The enrichment for
nonspeciﬁ c ligands can be avoided by modulating the stringency at
each SELEX round in different ways, including the use of suitable
competitors during the incubation step, the reduction of target
concentration and the increase in the number of washings after
incubation.
Shangguan et al. applied such approach to identify ssDNA
aptamers that by speciﬁ cally binding T−cell acute lymphocytic leu−
kemia (ALL) cells are able to distinguish them from B−cell lym−
phoma cells [ 10 ]. Moreover, in the same laboratory Chen et al.
developed a panel of aptamers speciﬁ c for small lung cancer (SCLC)
that is the most aggressive subtype of lung cancer with a very short
life expectancy. They isolated a set of oligonucleotides able to
discriminate small lung cancer cells versus large cell lung cancer,
providing a speciﬁ c tumor signature for early diagnosis of SCLC
[ 11 ]. A similar approach has been used by Sefah et al. to identify
aptamers speciﬁ c for colorectal cancer versus normal tissue or other
cancer cells [ 12 ].
The speciﬁ c protocols adopted by different laboratories may
largely vary in terms of the speciﬁ c scheme of  SELEX   applied
(for example the alternation of the selection and counter−selection
steps), the cell types used in the positive and counter−selection
steps, the time and the temperature of incubation of the library
with the cells and the stringency applied through the SELEX
rounds.
Developing Aptamers by Cell-Based SELEX

36
In order to develop more effective delivery tools for therapeu−
tics, a variant of the two cell−based  SELEX   strategies (Fig.  1a, b )
has been introduced in order to enrich for aptamers capable of
selective internalization (Fig.  1c ). The protocol (referred as “cell
internalization SELEX”) includes ice−cold 0.5 M NaCl in
Dulbecco’s Phosphate−Buffered Saline (DPBS) washings (High Salt
Wash) to remove surface−bound aptamers that do not internalize
into target cells [ 13 ,  14 ].
   In our laboratory, we adopted differential cell− SELEX   to generate
a panel of high afﬁ nity RNA aptamers directed against human
malignant glioma [ 15 ] and non−small−cell lung cancer (NSCLC)
cells surface antigens [ 16 ].
Gliomas are the most common primary malignant brain tumors
characterized by variable grade of malignancy and histological fea−
tures [ 17 – 22 ]. With the intention to identify new speciﬁ c molecu−
lar markers preferentially expressed on the surface of the more
malignant glioma phenotype, we used human U87MG glioma cell
line as target for the selection step and the less aggressive human
T98G glioma cells for the counter−selection steps [ 15 ]. These two
glioma cell lines differ for the potential to form tumors in nude
mice, being highly tumorigenic and poorly tumorigenic respec−
tively. We used a library of 2'−ﬂ uoro pyrimidines (2′−F)−RNAs and
performed 14 rounds of  SELEX  , progressively increasing the selec−
tive pressure by changing both incubation and washing conditions.
Finally, we identiﬁ ed ten families of highly related aptamers that
cover more than 46 % of all individual sequences obtained. Among
them, we selected a panel of eight aptamers displaying high bind−
ing afﬁ nity for U87MG glioma cells ( K  D −values ranging between
33 and 700 nM) and no or low afﬁ nity for T98G glioma cells and
other human cancer cell types, including neuroblastoma, lung, and
breast. Five of these aptamers showed biological activity as well,
inducing time−dependent down−regulation of extracellular regu−
lated kinase (ERK) and cyclin D1 phosphorylation, thus indicating
that they may act as inhibitory ligands for critical cell surface pro−
teins. In addition, one of the functional selected aptamers, named
GL21.T, has been further characterized [ 23 ].
As a ﬁ rst attempt to identify its molecular target, we performed
a phospho−tyrosine kinase receptor (RTK) array analysis that pro−
vided us a clear, even if preliminary, indication that GL21.T speciﬁ −
cally binds and inhibits Axl RTK that is overexpressed in U87MG
glioma cells. This result has been validated and the functional
activity of the aptamer has been characterized in detail [ 23 ].
Gl21.T revealed strong inhibition of cell migration and inva−
sion in vitro as well as tumor growth in vivo. Moreover, we dem−
onstrated that GL21.T is also able to internalize into target cells in
a receptor−dependent manner, thus resulting an interesting cargo
for tissue speciﬁ c internalization of therapeutic agents [ 24 ].
1.2 Differential
Cell-SELEX on Glioma
and Lung Cancer Cells
Silvia Catuogno et al.

37
More recently, with the aim to discriminate between the
chemo−resistant and chemo−sensitive phenotype in NSCLC, we
applied a similar approach by using A549 cells in the positive selec−
tion step and the more sensitive H460 cells in the counter− selection
step [ 16 ]. We selected a set of ﬁ ve families of 2′−F−RNA aptamers
able to distinguish between the two cell types. Among these, we
identiﬁ ed the aptamer CL4 employing phospho−RTK array analy−
sis that binds the epidermal growth factor receptor (EGFR). We
demonstrated that CL4 inhibits EGFR−mediated signaling in vitro
and tumor growth in vivo.
In conclusion, the identiﬁ cation of the molecular signature of
cancer cells is essential for an accurate and early diagnosis and the
generation of molecular probes for molecular analysis represents a
major goal in oncology. In this respect, differential cell− SELEX
strategy offers a great promise for cancer biomarker discovery and
therapeutic molecule identiﬁ cation.
In this chapter, we provide a detailed description of the differ−
ential cell− SELEX   approach that has a general applicability to
obtain a molecular signature of cell state in several cancer types.
2 Materials
       1.     Transcription   buffer (5×): 30 mM MgCl
2 , 50 mM NaCl, 200
mM Tris–HCl, pH 7.5 and 10 mM spermidine.
   2.    To prepare transcription reaction mix add: 1×  Transcription
buffer, 1 mM 2′−F−2′−dCTP and 2′−F−2′−dUTP, 1 mM  ATP  , 1
mM GTP, 1 U/ml inorganic pyrophosphatase, 0.5 U/μl
RNAse inhibitors, 10 mM dithiothreitol (DTT), 10 μCi/μl
32P−αUTP (3000 Ci/mmol), 2.5 U/μl of T7
Y639F
  RNA poly−
merase, and 1 pmol/μl DNA in RNAse−free water to a ﬁ nal
volume of 600 μl.
   3.    DNase treatment: DNase I.
   4.    Denaturing polyacrylamide gel 8 %: dissolve 60 ml 40 % acryl−
amide–bis solution (37.5:1) and 126 g urea ( see   Note 1 ) in
30 ml of TBE10× [Tris (0.89 M)–borate (0.89 M)−EDTA
(0.025 M)].
Add water to a ﬁ nal volume of 300 ml. To polymerize the
gel add 43 μl  N , N , N ′, N ′−tetramethyl−ethylendiamine
(TEMED) and 450 μl of 10 % ammonium persulfate solution
(APS) ( see   Note 2 ) for 50 ml of mix.
   5.    Gel loading buffer: 480 μl of formamide, 10 μl 0.5 M ethyl−
enediamine tetraacetic acid (EDTA), 10 μl water, and bromo−
phenol Blue.
   6.    Buffer to elute RNA from gel: 300 mM NaAc with 200 mM
EDTA.
2.1 In Vitro RNA
Transcription
Developing Aptamers by Cell-Based SELEX

Random documents with unrelated
content Scribd suggests to you:

Indien gij één enkelen stap doet, om haar weer te vinden, zijt gij
verloren.”
„Dat ten minste is duidelijk,” ging d’Artagnan voort; „maar in alle
geval is het niets meer dan een bedreiging.”—„Ja, maar die
bedreiging doet mij beven, mijnheer! ik ben volstrekt geen held en
zeer bang voor de Bastille.”—„Hm!” lispte d’Artagnan, „maar ik ben
evenals gij, en kom liefst niet in aanraking met de Bastille. Indien
het een degensteek betrof, dat kan er nog mede door.”—
„Intusschen, mijnheer! had ik inderdaad in deze omstandigheid op u
gerekend.”—„Ja.”—„Daar ik u steeds in het gezelschap zie van
musketiers van een zeer ontzaginboezemend voorkomen en weet,
dat deze musketiers die des heeren de Tréville en bijgevolg vijanden
van den kardinaal zijn, meende ik, dat gij en uw vrienden, door onze
arme koningin te hulp te komen, verheugd zoudt zijn Zijne
Eminentie een leelijken trek te spelen.”—„Ongetwijfeld.”—„En
vervolgens dacht ik aan de drie maanden huur, die gij mij schuldig
zijt, en waarom ik u nooit heb gevraagd.”—„Ja, ja! gij hebt mij dit
reeds te verstaan gegeven en die reden vind ik voortreffelijk.”—
„Daarenboven is het mijn voornemen, zoo lang gij mij de eer zult
aandoen in mijn huis te blijven, u nooit, zelfs niet in het
toekomstige, over de huur aan te spreken.”—„Heel goed!”—„En voeg
daarbij, indien zulks noodig mocht zijn, dat ik bereid ben u een
vijftigtal pistolen aan te bieden, indien gij, tegen alle
waarschijnlijkheid, op dit oogenblik om eenig geld verlegen mocht
zijn.”—„Kostelijk! Gij zijt dus rijk, mijn beste heer Bonacieux?”—„Ik
kan leven, mijnheer! dat kan ik zeggen; ik heb zoo wat twee tot drie
duizend kronen inkomen, bijeengegaard door mijn kleine
winkelnering, maar vooral door het beleggen van eenige gelden in
de laatste reis van den beroemden zeereiziger Jean Mocquet, zoodat
gij wel begrijpt, mijnheer!....”
„Ha! zie!” riep de burger.—„Wat?” vroeg d’Artagnan.—„Wat zie ik
daar!”—„Waar?”—„Op straat, tegenover uw venster, onder den post
van die deur; een man in een mantel gehuld!”—„Hij is het!” riepen
gelijktijdig d’Artagnan en de burger, daar zij elk voor zich zelven hun
man hadden herkend.—„Ha! dezen keer,” riep d’Artagnan, zijn degen

grijpende, „dezen keer zal hij mij niet ontsnappen!”—En zijn degen
uit de scheede trekkende, stortte hij het vertrek uit.
Op de trap ontmoette hij Athos en Porthos, die hem een bezoek
kwamen brengen. Zij gingen op zijde, en d’Artagnan vloog als een
pijl tusschen beiden door.—„Hei daar! waarheen moet dat?” riepen
hem eenparig de twee musketiers na.—„De man van Meung,”
antwoordde d’Artagnan, en hij verdween.
D’Artagnan had meer dan eens aan zijn vrienden zijn ontmoeting
met den vreemdeling verhaald, zoowel als de verschijning van de
schoone reizigster, aan welke die man een zoo gewichtige zending
had toevertrouwd. Het oordeel van Athos hieromtrent was, dat
d’Artagnan zijn brief in de worsteling verloren had. Volgens zijn
denkwijze, en te oordeelen naar het portret, dat d’Artagnan van den
vreemdeling had geschetst, kon deze niet anders dan een edelman
zijn geweest, en een edelman was niet in staat de laagheid te
begaan een brief te stelen. Porthos had in dat alles niets anders dan
een verliefde samenkomst gezien, welke door een dame aan een
minnaar of door een minnaar aan een dame was gegeven, maar die
gestoord was geworden door d’Artagnan’s tegenwoordigheid en die
van zijn geel paard. Aramis had gezegd, dat dergelijke zaken iets
geheimzinnigs bevatten en dat het beter was ze niet te
doorgronden.—Zij begrepen diensvolgens uit de weinige woorden,
die aan d’Artagnan ontglipten, waarvan sprake was, en daar zij
veronderstelden, dat d’Artagnan, na zijn man ingehaald of hem uit
het gezicht verloren te hebben, eindelijk weder naar huis zou
terugkeeren, klommen zij verder de trap op.
Toen zij de kamer van d’Artagnan binnentraden, was die verlaten;
de eigenaar, bevreesd voor de gevolgen, welke de ontmoeting
tusschen den jongeling en den vreemdeling zou hebben, had het
voorzichtig geoordeeld zich te verwijderen.

HOOFDSTUK IX.
D’Artagnan doet zich gelden.
Zooals Athos en Porthos hadden verwacht, kwam d’Artagnan na
verloop van een half uur terug. Wederom was zijn man hem ontgaan
en als door tooverij verdwenen. D’Artagnan had met getrokken
degen al de nabijgelegen straten doorloopen, doch niemand
ontmoet, die eenigszins geleek op den man, dien hij zocht.
Vervolgens ging hij over tot datgene, waarmede hij misschien had
moeten beginnen, namelijk: aan de deur te kloppen, waartegen de
vreemdeling had gestaan; maar tevergeefs deed hij den klopper tien
of twaalf malen er op nedervallen, niemand antwoordde, doch de
buren, door het gerucht opmerkzaam gemaakt, waren voor hun
deuren gekomen en staken den neus buiten hun vensters, hem
verzekerende, dat het huis, welks openingen trouwens alle dicht
waren, reeds sinds zes maanden onbewoond was geweest. Terwijl
d’Artagnan de straten doorliep en op de deuren bonsde, had Aramis
zich met zijn twee vrienden vereenigd, zoodat, toen d’Artagnan
terugkwam, hij het gezelschap voltallig vond.
„Wel?” riepen eenparig de musketiers, d’Artagnan met een van
zweet druipend voorhoofd en door toorn vertrokken gelaat ziende
binnenkomen.—„Wel!” hernam deze, zijn degen op het bed
werpende, „die kerel moet de duivel in persoon zijn; als een spook,
geest, of als een schim is hij verdwenen.”—„Gelooft gij aan spoken?”
vroeg Athos aan Porthos.—„Ik geloof aan niets anders dan aan
hetgeen ik zie, en dewijl ik nooit spoken heb gezien, geloof ik er niet
aan.”—„Volgens den bijbel,” zeide Aramis, „moeten wij er aan
gelooven: de schim van Samuel verscheen aan Saul en met
leedwezen zou ik aan dat geloofspunt twijfelen, Porthos!”—„Wat hij
ook zij, mensch, duivel, stof of geest, iets werkelijks of schijnbaars,

hij is mij tot een vloek geschapen; zijn verdwijning berooft ons van
een kostelijke zaak, die ons misschien honderd pistolen, ja meer zou
hebben bezorgd.”—„Hoezoo?” vroegen gelijktijdig Porthos en Aramis.
Athos echter, getrouw aan zijn stelsel van stilzwijgendheid, bepaalde
zich d’Artagnan met zijn blik te ondervragen.
„Planchet!” riep d’Artagnan tot zijn knecht, die op dat oogenblik
zijn hoofd tusschen de een weinig geopende deur stak, ten einde
eenige woorden van het gesprek af te luisteren; „ga naar beneden
en verzoek den huisheer ons een half dozijn flesschen Beaugency
boven te zenden; die wijn smaakt mij het best.”—„Ei! ei! hebt gij een
doorloopend krediet bij uw huisheer?” vroeg Porthos.—„Ja,”
antwoordde d’Artagnan, „heden ingegaan en wees gerust, indien zijn
wijn slecht is, zullen wij hem anderen doen halen.”—„Men moet
gebruiken en niet misbruiken,” zeide Aramis op vermanenden toon.—
„Ik heb altijd gezegd, dat d’Artagnan de vindingrijkste van ons allen
is,” zeide Athos, die, na zijn meening geuit te hebben, welk
kompliment d’Artagnan met een buiging beantwoordde, wederom in
zijn gewone sprakeloosheid verzonk.
„Maar ter zake, laat hooren; wat is er aan de hand?” vroeg
Porthos.—„Ja,” hernam Aramis, „deel het ons mede, mijn vriend!
althans, indien de eer eener vrouw er niet door wordt gekwetst;
want in dat geval deedt gij beter, de zaak voor u zelven te
houden.”—„Wees gerust,” antwoordde d’Artagnan, „de eer van
niemand zal door hetgeen ik u heb mede te deelen gekrenkt
worden.”—En daarop verhaalde hij in de minste bijzonderheden aan
zijn vrienden, wat er tusschen hem en den eigenaar van het huis
gesproken was geworden en hoe de man, die de vrouw des
waardigen winkeliers had ontvoerd, dezelfde was, met wien hij voor
de herberg de trouwe Molenaar twist had gehad.
„Uw zaak is zoo slecht niet,” zeide Athos, na den wijn als een
kenner geproefd en met een hoofdknik de deugd er van te hebben
bevestigd, „men zal van dien braven man een vijftig- of zestigtal
pistolen kunnen halen; maar nu is het de vraag, of zestig pistolen
waard zijn vier hoofden te wagen?”—„Herinner u, dat er een vrouw

in betrokken is, een ontvoerde vrouw, die men zeker bedreigt,
misschien wel foltert, alleen omdat zij haar meesteres getrouw is!”—
„Wees voorzichtig, d’Artagnan!” zeide Aramis, „gij schijnt u met al te
veel vuur over het lot van juffrouw Bonacieux te bekommeren. De
vrouw is tot ons verderf geschapen en het is uit haar, dat al onze
ellende voortspruit.”
Die vermaning hoorende, fronste Athos zijn wenkbrauwen en
beet zich op de lippen.—„Het is niet omtrent juffrouw Bonacieux, dat
ik mij verontrust,” riep d’Artagnan, „maar wegens de koningin, die
door den koning verlaten, door den kardinaal vervolgd, een voor een
de hoofden harer vrienden ziet vallen.”—„Waarom bemint zij wat wij
bovenal verfoeien: de Spanjaarden en de Engelschen?”—„Spanje is
het land harer geboorte, het is dus natuurlijk, dat zij de
Spanjaarden, kinderen van hetzelfde land, genegen is. Wat het
tweede verwijt betreft, dat gij haar doet, ik heb gehoord, dat zij niet
de Engelschen, maar slechts één Engelschman bemint.”—„Op mijn
woord, men moet bekennen, dat de Engelschman waardig is bemind
te worden. Nooit zag ik voornamere houding dan de zijne: zonder
nog van zijn allerprachtigste kleeding te spreken, waarbij niets te
vergelijken is,” zeide Porthos. „Ik bevond mij in het Louvre, den dag
toen hij zijn paarlen strooide en pardieu! ik raapte er twee van op,
die elk mij wel tien pistolen hebben opgebracht. En gij, Aramis! kent
gij hem?”—„Zoo goed als gij, heeren! immers, ik bevond mij onder
degenen, die hem in den tuin van Amiëns, waarin de heer de
Pétange, de stalmeester der koningin, mij bracht, gevangen namen.
Ik was destijds in het Seminarie en dat voorval scheen den koning
zeer veel verdriet te veroorzaken.”—„Dat zou mij niet beletten,” zeide
d’Artagnan, „indien ik wist, waar de hertog van Buckingham zich
bevond, hem bij de hand te nemen en voor de koningin te geleiden,
al ware het alleen om den kardinaal woedend te maken; want onze
ware, onze eenige, eeuwige vijand, mijne heeren! is de kardinaal; en
indien er een middel ware, hem een leelijken trek te spelen, ik
beken, dat ik daarvoor gaarne mijn hoofd zou willen wagen.”—„En,”
hernam Athos, „heeft de winkelier u gezegd, dat de koningin
vermoedde, dat men den hertog van Buckingham op een valschen

brief heeft doen overkomen?”—„Zij vreest het.”—„Een oogenblik,”
sprak Aramis.—„Hoe!” riep Porthos.—„Ga maar voort, ik tracht mij
eenige bijzonderheden te herinneren.”—„En nu ben ik overtuigd,”
zeide d’Artagnan, „dat de ontvoering dezer dienares der koningin in
verband staat met de gebeurtenissen, waarover wij spreken en
misschien ook wel met de tegenwoordigheid van den hertog van
Buckingham te Parijs.”—„Welk een doorzicht heeft die Gaskonjer!”
riep Porthos vol bewondering uit.—„Ik hoor hem gaarne,” zeide
Athos, „zijn tongval bekoort mij.”—„Mijne heeren!” zeide Aramis,
„luistert eens!”—En de drie vrienden zeiden: „Laat ons naar Aramis
luisteren.”—„Gisteren bevond ik mij ten huize van een zeer geleerden
doctor in de godgeleerdheid, dien ik bijwijlen ter voortzetting mijner
studiën ga raadplegen.”—Athos glimlachte.—„Hij woont in een zeer
eenzame wijk,” vervolgde Aramis, „zijn smaak en zijn vak vereischen
zulks. Op het oogenblik, dat ik zijn huis verliet....”—Hier zweeg
Aramis.—„En vervolgens!” riepen zijn hoorders, „toen gij het huis
verliet?”—Aramis scheen in verlegenheid te zijn als iemand, die,
bezig met liegen, eensklaps door iets onverwachts in zijn loop
gestuit wordt.
Intusschen waren de blikken zijner drie vrienden op hem
gevestigd, terwijl zij hun gehoor scherpten; er was geen middel
meer voor Aramis zich terug te trekken.
„Die godgeleerde heeft een nicht,” vervolgde Aramis....—„Zoo!
heeft hij een nicht?” viel Porthos hem in de rede.—„Een zeer
achtenswaardige dame.” antwoordde Aramis.
De drie mannen begonnen te lachen.—„O! als gij lacht of
twijfelt,” hernam Aramis, „dan hoort gij niets meer.”—„Wij zijn
geloovig als Mahomedanen en stom als grafzerken,” zeide Athos.—
„Dan zal ik voortgaan,” hernam Aramis. „Die nicht bezoekt nu en dan
haar oom; toevallig was zij gisteren, gelijktijdig met mij, bij hem,
zoodat ik mij verplicht vond, toen zij vertrok, haar tot aan haar koets
te geleiden.”—„Zoo, zoo! heeft de nicht van den godgeleerde een
koets?” riep Porthos, wiens grootste gebrek een buitengewone
lostongigheid was; „een heerlijke ontmoeting, mijn vriend!”—

„Porthos!” hernam Aramis, „ik heb u reeds meer dan eens doen
opmerken, dat gij al te praatziek zijt en zulks u bij de vrouwen tot
nadeel strekt.”—„Mijne heeren! mijne heeren!” riep d’Artagnan, die
meer doorzicht in de zaak begon te krijgen, „het is iets ernstigs; laat
ons dus trachten zoo mogelijk ernstig te blijven. Ga voort, ga voort,
Aramis!”—„Een groote kerel, bruin van gelaat en fier van houding....
met manieren als een edelman, zoo een van de soort als de uwe,
d’Artagnan!”—„Misschien dezelfde,” zeide deze.—„Licht mogelijk,”
antwoordde Aramis en hij hervatte: „deze naderde mij, vergezeld
van vijf of zes mannen, die hem op een afstand van tien schreden
volgden. Op den beleefdsten toon der wereld zeide hij mij:
„‚Mijnheer de hertog!’ en zich toen tot de dame richtende, die ik
den arm gaf, vervolgde hij: ‚en gij! mevrouw!’”—„Tot de nicht van
den godgeleerde?”—„Stil toch, Porthos! gij zijt onverdragelijk,” zeide
Athos.—„‚Wees zoo goed in de koets te stijgen en dat zonder den
minsten weerstand te bieden, of het minste gerucht te maken.’”
„Hij zag u aan voor Buckingham,” riep d’Artagnan.—„Ik geloof het
ook,” zeide Aramis.—„Maar die dame?” vroeg Porthos.—„In deze
meende hij de koningin te herkennen,” zeide d’Artagnan.—„Juist,”
antwoordde Aramis.—„Die duivelsche Gaskonjer!” riep Athos, „niets
ontsnapt hem.”—„Inderdaad,” hernam Porthos, „Aramis is van
dezelfde grootte en heeft in zijn houding wel iets van den fraaien
hertog; maar het schijnt mij dat het musketiersgewaad....”—„Ik was
in een ongewoon grooten mantel gehuld,” zeide Aramis.—„In de
maand Juli?” riep Porthos; „vreest de doctor, dat men u zoude
herkennen?”—„Ik begrijp volkomen,” hernam Athos, „dat de spion
door de houding is misleid geworden; maar het gezicht?”—„Ik had
een zeer breeden hoed op,” antwoordde Aramis.—„O, mijn God! wat
voorzorgen voor de godgeleerde studiën!”—„Och, heeren!
verbeuzelen wij den tijd niet met scherts; begeven wij ons liever, elk
voor zich, langs verschillende zijden, ter opsporing der vrouw van
den winkelier. Zij is de sleutel der intrigue.”—„Een vrouw van dien
nederigen stand! Gelooft gij dat, d’Artagnan?” vroeg Porthos, den
mond verachtelijk samentrekkende.—„Zij is de pleegdochter van de
la Porte, den vertrouwden kamerdienaar der koningin. Ik heb u dit

reeds gezegd, mijne heeren! En buitendien, Hare Majesteit kan
opzettelijk haar helpsters in een zoo lagen stand gezocht hebben;
hoofden, die uitsteken boven anderen, ziet men van verre, en de
kardinaal heeft een scherp gezicht.”—„Welnu,” zeide Porthos, „bepaal
vooreerst maar den prijs met den winkelier; maar vooral een goeden
prijs.”—„Dat is niet noodig,” zeide d’Artagnan; „want ik geloof, dat,
indien hij ons niet betaalt, wij van een anderen kant ruimschoots
zullen voldaan worden.”
Op dit oogenblik werd een haastig geloop op de trap gehoord; de
deur vloog kletterend open, en de ongelukkige winkelier stortte de
kamer binnen, waar de raadsvergadering gehouden werd.—„O,
mijne heeren!” riep hij, „redt mij in ’s hemels naam! redt mij!
Beneden zijn vier mannen, die gekomen zijn, om mij in hechtenis te
nemen; redt mij! redt mij!”
Porthos en Aramis stonden van hun stoelen op.—„Een
oogenblikje!” riep d’Artagnan, hun een teeken gevende den degen
weder in de scheede te laten zinken, waaruit zij hem ten halve
getrokken hadden, „een oogenblikje; hier wordt geen moed
vereischt, maar wel voorzichtigheid.”—„Wij zullen toch niet....!” riep
Porthos.—„Gij zult d’Artagnan laten begaan,” zei Athos; „hij is, ik
herhaal het, de slimste kop van ons allen, en ik, wat mij betreft,
verklaar, dat ik hem zal gehoorzamen.... Handel naar goedvinden,
d’Artagnan!”
Bij die woorden verschenen de vier wachten voor de deur der
voorkamer; maar vier musketiers ziende staan, met den degen op
zijde, aarzelden zij nader te treden.—„Komt binnen, heeren! komt
binnen,” riep d’Artagnan.... „Gij zijt hier ten mijnent, en wij zijn allen
trouwe dienaars van den koning en den kardinaal.”—„Welaan,
heeren! gij zult niet beletten, dat wij de bevelen ten uitvoer brengen,
die men ons gegeven heeft?” vroeg degene, die de aanvoerder der
kleine bende scheen te zijn.—„Integendeel, heeren! en wij zullen u
bijstand verleenen, indien zulks noodig mocht zijn.”—„Maar wat
praat hij toch?” mompelde Porthos.—„Gij zijt een ezel,” zeide Athos,
„stil!”—„En gij hebt mij beloofd....” zeide de winkelier zoo zacht

mogelijk.—„Wij kunnen u niet redden dan wanneer wij vrij blijven,”
antwoordde haastig en even zacht d’Artagnan; „want indien wij den
schijn aannemen u te verdedigen, neemt men ons tegelijk met u
gevangen.”—„Ik meen echter....”—„Treedt nader, heeren!” zeide
d’Artagnan luid, „ik heb geen de minste reden, mijnheer te
verdedigen. Het is heden, dat ik hem voor het eerst heb gezien, en
nog wel bij gelegenheid, dat hij mij om de huur kwam vragen; hij zal
het u zelf zeggen.... Niet waar, mijnheer Bonacieux? antwoord!”—
„Dat is de zuivere waarheid!” riep de winkelier; „maar mijnheer zegt
u niet....”—„Zwijg over mij, over mijn vrienden en vooral over de
koningin, of gij zoudt ons allen in het verderf storten, zonder u
zelven te redden.—Welaan, heeren! brengt dien man weg.”
En d’Artagnan stiet den gansch ontstelden winkelier voort en gaf
hem in de handen der dienaren, zeggende: „Gij zijt een schoft, mijn
vriend! mij om geld te komen vragen; van een musketier geld te
eischen! Achter de traliën met hem, heeren! voort, en houdt hem
zoo lang achter slot als gij kunt, dat zal mij een goed uitstel van
betaling verschaffen.”
De politiedienaren putten zich uit in dankbetuigingen en voerden
hun prooi mede. Op het oogenblik dat zij de trap afgingen, klopte
d’Artagnan op den schouder van den aanvoerder en zeide, terwijl hij
twee glazen met Beaugency wijn vulde, die hem de edelmoedigheid
van den heer Bonacieux geschonken had: „Willen wij eerst niet eens
op elkanders gezondheid drinken.”—„Dat zal mij veel eer zijn,” zeide
de aanvoerder der politiemannen, „en ik neem dit aanbod met
dankbaarheid aan.”—„Op uw gezondheid dan, mijnheer!.... hoe is
uw naam?”—„Bois-Renard.”—„Mijnheer Bois-Renard!”—„Op de uwe,
edele heer! mag ik ook uw naam weten?”—„D’Artagnan.”—„Op uw
gezondheid dus, mijnheer d’Artagnan!”—„En bovenal de
gezondheid,” riep d’Artagnan, als in geestvervoering, „de gezondheid
van den koning en den kardinaal!!”
De aanvoerder der politiedienaren zou misschien aan de
oprechtheid van d’Artagnan getwijfeld hebben, indien de wijn slecht
ware geweest; maar deze was goed, en hij was overtuigd.

„Maar wat vervloekte lafhartigheid hebt gij daar uitgevoerd?”
zeide Porthos, toen de aanvoerder der wacht zich bij zijn
manschappen had gevoegd en de vier vrienden met elkander weder
alleen waren. „Wel foei! vier musketiers laten een ongelukkige, die
zich in hun midden bevindt en hen om hulp smeekt, gevangen
nemen! Een edelman met een dievenleider klinken!”—„Porthos!”
zeide Aramis, „Athos heeft u reeds te kennen gegeven, dat gij een
ezel zijt, en ik vereenig mij met zijn gevoelen. D’Artagnan, gij zijt
een groot man! en wanneer gij de plaats van den heer de Tréville
zult bekleeden, zal ik uw bescherming inroepen, om mij een abdij te
doen verkrijgen.”—„Wat is dat? nu begrijp ik er niets meer van, keurt
gij goed wat d’Artagnan heeft uitgevoerd?”—„Pardieu! wel zeker,”
zeide Athos, „niet alleen dat ik het goedkeur, maar daarenboven
maak ik hem hierover mijn kompliment.”—„En nu, mijne heeren!”
zeide d’Artagnan, zonder verder zijn gedrag aan Porthos te
verklaren, „allen voor één, één voor allen! dat moet onze leus zijn,
niet waar?”—„Echter....” zeide Porthos.—„Steek op de hand en
zweer!” riepen gelijktijdig Athos en Aramis. Door het voorbeeld
gedwongen en bij zich zelven vloekende, stak Porthos de vingers op,
en de vier vrienden herhaalden eenstemmig de door d’Artagnan
voorgestelde leus: „Allen voor één, één voor allen!”—„Zoo is het
goed! dat elk zich nu naar huis begeve,” zeide d’Artagnan op een
toon, alsof hij geheel zijn leven nooit iets anders gedaan had dan
bevelen geven; „en weest op uw hoede; want van nu aan zijn wij
met den kardinaal in oorlog!”

HOOFDSTUK X.
Een muizenval in de zeventiende eeuw.
De uitvinding der muizenvallen is niet van onzen tijd; zoodra de
maatschappijen bij hun tot stand koming slechts een of andere
politie hadden uitgevonden, vond de politie op haar beurt de
muizenvallen uit. Daar onze lezers zeker niet bekend zijn met de
dieventaal van de Jeruzalemstraat,4) en het sedert dat wij schrijven,
nu vijftien jaar geleden, de eerste keer is, dat wij dit woord op die
zaak van toepassing brengen, gaan wij over tot de verklaring van
wat een muizenval is: Wanneer men, in welk huis het ook zij, een
persoon heeft in hechtenis genomen, die van de een of andere
misdaad wordt beschuldigd, houdt men die gevangenneming
geheim; men legt vier of vijf politiedienaren in hinderlaag in het
eerste vertrek van het huis: men opent de deur voor allen die
kloppen, sluit ze achter hen, waarna zij worden aangehouden. Op
die wijze heeft men na verloop van twee of drie dagen bijna al de
medeplichtigen des schuldigen in de macht. Ziedaar wat een
muizenval is.
4) Het hoofdbureau van politie is nog heden ten dage gelegen in de
straat van dien naam.
Men maakte dan van het vertrek van baas Bonacieux een
muizenval; elk, die zich dáár vertoonde, werd vastgehouden en door
de lieden van den kardinaal verhoord, maar dewijl een afzonderlijke
trap naar de eerste verdieping leidde, die door d’Artagnan werd
bewoond, spreekt het vanzelf, dat zij, die hem kwamen bezoeken,
volstrekt geen onderzoek te ondergaan hadden. Bovendien, bij hem
kwamen niet anders dan de drie musketiers. Deze hadden, elk van
hun zijde, nasporingen gedaan, maar niets gevonden, niets ontdekt.
Athos was zelfs zoo ver gegaan, den heer de Tréville te ondervragen,

hetgeen met het oog op de gewone stilzwijgendheid van den
waardigen musketier, zijn kapitein veel verwondering had gebaard.
Maar de heer de Tréville wist niets dan alleen dat, toen hij het
laatste den kardinaal, den koning en de koningin had gezien, de
kardinaal er zeer zorgvol uitzag, dat de koning onrustig was, en dat
de roode oogen der koningin blijken gaven, dat zij òf gewaakt òf
geweend had. Maar deze laatste bijzonderheid had hem weinig
getroffen, immers de koningin waakte en schreide dikwijls sedert zij
gehuwd was. De heer de Tréville beval evenwel ernstig Athos aan
den dienst des konings, en vooral dien der koningin, ter harte te
nemen en verzocht hem dezelfde aanbeveling aan zijn krijgsmakkers
te doen.
Intusschen kwam d’Artagnan het huis niet uit, en had hij zijn
kamer ingericht om van daar uit alles, wat in de nabijheid voorviel,
gemakkelijk te kunnen gadeslaan. Van uit zijn venster zag hij
diegenen naderen, welke in de val gingen loopen; vervolgens had hij
de steenen uit den vloer gelicht, dien hij diep opgroef; en toen,
slechts door een enkele planken zoldering van de kamer gescheiden,
waar de verhooren plaats vonden, hoorde hij alles, wat er tusschen
de inquisiteurs en de beschuldigden voorviel. De verhooren,
voorafgegaan door een nauwkeurig onderzoek van den persoon des
aangehoudenen, luidden bijna altijd als volgt: „Heeft mejuffrouw
Bonacieux u iets ter hand gesteld voor haar man of voor iemand
anders?—Heeft de heer Bonacieux u iets ter hand gesteld voor zijn
vrouw of voor iemand anders?—Hebben een van beiden u
mondeling het een of ander geheim toevertrouwd?”
„Indien zij iets wisten, zouden zij het niet vragen,” dacht
d’Artagnan. „Maar wat willen zij weten? Indien de hertog van
Buckingham zich niet te Parijs bevindt, noch met de koningin een
samenkomst heeft gehad of moet hebben....”
D’Artagnan bleef bij dat denkbeeld berusten, dat, na al hetgeen
hij vernomen had, niet zoo onwaarschijnlijk was. Intusschen was de
muizenval steeds in werking, en de waakzaamheid van d’Artagnan
ook.—Op den avond van den dag na dien, waarop de arme

Bonacieux werd in hechtenis genomen, terwijl Athos d’Artagnan
verliet om zich naar den heer de Tréville te begeven, en het negen
uur had geslagen, en Planchet, die het bed nog niet had opgemaakt,
hieraan begon, hoorde men aan de straatdeur kloppen: onmiddellijk
werd de deur geopend en weder gesloten: iemand was in de val
geloopen. D’Artagnan snelde naar de van steenen ontbloote plek des
vloers, ging op den buik liggen en luisterde.
Weldra werden er angstkreten gehoord, vervolgens een gekerm,
dat men trachtte te smoren. Van een ondervraging was geen sprake.
—„Duivelsch!” zeide d’Artagnan bij zich zelven, „het schijnt, dat het
een vrouw is; men onderzoekt haar kleeding, zij biedt weerstand,
men doet haar geweld aan.... De ellendelingen!”—En d’Artagnan,
ondanks zijn voorzichtigheid, had moeite zich niet bij het tooneel te
voegen, dat onder hem plaats had.—„Maar ik zeg u, mijne heeren,
dat ik de vrouw des huizes, dat ik juffrouw Bonacieux ben; geloof
mij, ik ben in dienst der koningin!” riep de ongelukkige vrouw.—
„Juffrouw Bonacieux!” mompelde d’Artagnan, „zou ik gelukkig
genoeg geweest zijn om datgene te vinden, waarnaar allen
zoeken?”—„Gij zijt het juist, die wij wachten,” antwoordden de
ondervragers.
De stem werd hoe langer hoe onduidelijker; een stommelend
gerucht deed het houtwerk kraken. Het slachtoffer verdedigde zich,
zooveel als het aan een vrouw mogelijk was aan vier mannen
weerstand te bieden.—„Ik smeek u, heeren!.... ik....” stamelde de
stem, die slechts eenige onafgebroken woorden deed hooren.—„Zij
stoppen haar den mond dicht! zij gaan haar voortsleepen!” riep
d’Artagnan, opspringende als door een springveer bewogen. „Mijn
degen! Ha! ik heb hem op zijde. Planchet!”—„Mijnheer!”—„Ga
spoedig Athos, Porthos en Aramis halen. Eén van drieën zal zeker te
huis zijn, misschien wel alle drie. Laten zij zich wapenen; dat zij zich
spoeden hier te komen. Ha! ik herinner mij, Athos is bij den heer de
Tréville!”—„Maar waarheen gaat gij, mijnheer? waarheen gaat gij?”—
„Ik ga het venster uit om des te eer beneden te zijn; leg gij de
steenen weer op hun plaats, veeg den vloer, ga de voordeur uit en
begeef u daar, waar ik u zeg.”—„O, mijnheer! mijnheer! gij zult den

hals breken!” riep Planchet.—„Zwijg, uilskuiken,” zeide d’Artagnan.
En met de eene hand zich aan den rand van het venster
vasthoudende, liet hij zich van de eerste verdieping op straat vallen,
zonder het minste letsel te bekomen, daar de hoogte niet veel
beteekende. Vervolgens klopte hij aan de deur en mompelde bij zich
zelven: „Ik zal op mijn beurt mij in de val laten vangen; maar
ongelukkig de katten, die zich aan een muis als ik zullen wagen.”
Nauwelijks was de klopper onder de hand des jongelings
neergevallen, of het gerucht hield op en voetstappen naderden, de
deur werd opengedaan, en d’Artagnan stormde met blooten degen
het vertrek van baas Bonacieux binnen, welks deur, waarschijnlijk
door een veer, vanzelf achter hem dichtviel.
Zij, die toen het rampzalig huis van Bonacieux bewoonden en ook
de naaste buren hoorden een luid geschreeuw, voetgetrappel en
degengekletter en een onophoudelijk gedruisch van brekend
huisraad. Een oogenblik daarna konden zij, die opmerkzaam door
dat geweld gemaakt aan de vensters waren gekomen, om er de
oorzaak van te ontdekken, de deur zien openen en vier in het zwart
gekleede mannen er niet zien uitgaan, maar als verschrikte raven
uitvliegen, terwijl zij op den grond en op de hoeken der tafels de
veeren hunner vleugels achterlieten, dat is te zeggen, de lappen van
hun kleederen en de slippen van hun mantels.
D’Artagnan, dit moet gezegd worden, kostte het weinig moeite
overwinnaar te zijn, want één slechts der politiedienaren was
gewapend en verdedigde zich alleen in schijn. Het is waar, dat de
drie anderen den jongeling met stoelen, zitbankjes en aarden potten
naar het hoofd wierpen, maar een paar schrammen, door de kling
van den Gaskonjer hun toegebracht, hadden hun schrik aangejaagd.
Tien minuten waren voldoende geweest om hen op de vlucht te
jagen en d’Artagnan was meester van het slagveld gebleven. De
buren, die hun vensters hadden geopend met die koelbloedigheid,
welke den bewoners van Parijs in die tijden van oproer en
eeuwigdurende vechtpartijen zoo eigen was, sloten ze weer, na de
vier in het zwart gekleede mannen te hebben zien wegloopen, bij

zich zelven verzekerd dat voor het oogenblik alles gedaan was.
Bovendien was het reeds laat en toen, zooals nog tegenwoordig,
ging men in de wijk van het Luxembourg vroegtijdig te bed.
D’Artagnan, nu alleen met juffrouw Bonacieux gebleven, wendde
zich tot haar. De arme vrouw lag op een leuningstoel, bijna in zwijm.
D’Artagnan beschouwde haar met een vluchtigen blik. Zij was een
bekoorlijke vrouw van vijf of zes en twintig jaar, een brunette, met
blauwe oogen, een klein wipneusje, schitterend witte tanden en
rozerood, als opaal schitterend vel. Dit was alles, wat haar voor een
voorname dame zou hebben kunnen doen aanzien; want hoewel
blank, waren de handen niet teer en de voeten duidden geen
adellijke afkomst aan.
Gelukkig was d’Artagnan nog zoo ver niet gevorderd, om bij deze
bijzonderheden stil te staan. Terwijl hij juffrouw Bonacieux stond te
beschouwen en, zooals wij zeiden, hiermede tot aan de beenen was
gekomen, zag hij op den grond een fijn batisten zakdoek liggen, op
welks punt hij hetzelfde naamcijfer herkende, dat hij op den zakdoek
had gezien, die bijna de oorzaak van een gevecht tusschen hem en
Aramis was geweest. Sedert dat oogenblik vertrouwde hij de
zakdoeken, waarop geborduurde geslachtswapens stonden, maar
zeer weinig meer; hij stak dan ook zonder één woord te spreken
dengene, dien hij had opgeraapt, in den zak van juffrouw Bonacieux.
Juist kwam juffrouw Bonacieux tot haar zelve; zij opende de oogen
en zag angstig rond, bemerkende, dat het vertrek ontruimd was en
zij zich alleen met haar bevrijder bevond. Dadelijk reikte zij hem
glimlachend haar hand toe. Juffrouw Bonacieux had den
bekoorlijksten glimlach, dien men zien kon.
„O, mijnheer!” riep zij, „zijt gij het, die mij gered hebt? Veroorloof
mij u mijn dankbaarheid te betuigen!”—„Juffrouw!” zeide d’Artagnan,
„ik heb niets meer gedaan dan hetgeen ieder edelman in mijn plaats
zou gedaan hebben; gij zijt mij dus niet de minste dankbaarheid
verschuldigd.”—„Ja wel, mijnheer! en ik hoop u het bewijs te geven,
dat gij geen ondankbare een dienst hebt bewezen. Maar wat wilden
toch die lieden, die ik aanvankelijk voor dieven aanzag en hoe komt

het, dat de heer Bonacieux niet hier is?”—„Mejuffrouw! die lieden
waren oneindig gevaarlijker dan dieven zouden kunnen zijn, want
het waren politieagenten van den kardinaal; en wat uw man, den
heer Bonacieux betreft, deze is niet te huis, dewijl men hem gisteren
in hechtenis heeft genomen, om hem naar de Bastille te brengen.”—
„Mijn man in de Bastille!” riep juffrouw Bonacieux. „Ach, mijn God!
Wat heeft de goede, arme man dan toch uitgevoerd? hij, de
onschuld zelf.”—En iets, naar een glimlach gelijkende, zweefde op
het nog angstige gelaat der jonge vrouw.
„O, juffrouw! wat hij heeft uitgevoerd,” zeide d’Artagnan, „ik
geloof, dat zijn eenige misdaad die is, van tegelijk het geluk en het
ongeluk te hebben uw man te zijn.”—„Hoe, mijnheer! gij weet
dan....?”—„Ik weet, mejuffrouw! dat men u heeft ontvoerd.”—„En
door wien, weet gij dat? O, indien gij het weet, zeg het mij dan!”—
„Door een man van tusschen de veertig en vijf en veertig jaar, zwart
van haar, bruin van gelaat en met een litteeken op den linkerslaap
des hoofds.”—„Dat is zoo, maar hoe is zijn naam?”—„O, zijn naam,
dien ken ik niet.”—„En is het mijn man bekend, dat ik ontvoerd
ben?”—„Hiervan was hem kennis gegeven door een brief, dien hem
de ontvoerder zelf geschreven had.”—„En vermoedt hij,” vroeg
juffrouw Bonacieux eenigszins aarzelende, „de reden dezer
ontvoering?”—„Hij schreef het, geloof ik, aan staatkunde toe.”—„Ik
heb er al dadelijk aan getwijfeld en nu geloof ik het ook.... Dus heeft
de goede mijnheer Bonacieux niet een oogenblik mij
gewantrouwd?”—„O, verre van daar, juffrouw! hij was al te
hoovaardig op uw deugd en vooral op uw liefde.”—Een tweede, bijna
onmerkbare glimlach teekende zich op de rooskleurige lippen der
schoone, jonge vrouw.—„Maar hoe,” vroeg d’Artagnan, „hoe is het u
mogelijk geweest te ontvluchten?”—„Ik heb van een oogenblik
gebruik gemaakt, dat ik alleen was; en daar ik sinds heden morgen
wist, wat ik omtrent mijn ontvoering moest denken, liet ik mij met
behulp mijner bedlakens uit het venster zakken, en in de verbeelding
mijn man hier te zullen vinden, spoedde ik mij herwaarts.”—„Om u
onder zijn bescherming te stellen?”—„Och! mijn arme man! ik wist
wel, dat hij niet in staat zou zijn mij te verdedigen; maar daar hij

ons in andere opzichten van dienst kon zijn, wilde ik hem van iets
kennis geven.”—„Waarvan?”—„O, dat geheim behoort mij niet, ik
mag het u dus niet zeggen.”—„Buitendien,” zeide d’Artagnan,—„ik
verzoek u, mejuffrouw! mij te willen verschoonen, dat, hoezeer
krijgsman, ik u voorzichtigheid aanraad,—buitendien geloof ik, dat
het hier geen zeer geschikte plaats is om elkander geheimen mede
te deelen. De lieden, welke ik op de vlucht heb gejaagd, zullen
spoedig met versterking terugkeeren, en wanneer zij ons dan
vonden, waren wij verloren. Ik heb wel drie mijner vrienden doen
roepen, maar wie weet of men hen heeft te huis gevonden.”—„Ja,
ja, gij hebt gelijk!” riep de opnieuw beangstigde juffrouw Bonacieux;
„vluchten wij, redden wij ons!”
Bij die woorden nam zij den arm van d’Artagnan en trok hem
haastig voort.—„Maar waarheen vluchten wij?” zeide d’Artagnan,
„waarheen?”—„Verwijderen wij ons eerst van dit huis, vervolgens
zullen wij zien.”—En de jonge vrouw en de jongeling, zonder zich de
moeite te geven de deur te sluiten, liepen haastig de
Doodgraversstraat door, begaven zich in de straat Fossés-Monsieur-
le-Prince, en bleven niet eer staan dan op het plein St. Sulpice.
„En wat zullen wij nu doen?” vroeg d’Artagnan, „en waar wilt gij
dat ik u brenge?”—„Ik weet het, om u de waarheid te zeggen, zelve
niet,” zeide juffrouw Bonacieux; „mijn voornemen was den heer de
la Porte door mijn man te laten verwittigen, opdat die ons
nauwkeurig mededeelen zoude, wat er sedert drie dagen in het
Louvre was voorgevallen; en of er geen gevaar voor mij was er mij
te vertoonen.”—„Maar ik, ik kan den heer de la Porte gaan
waarschuwen.”—„Ja, echter is er één beletsel; den heer Bonacieux,
dien men daar kent, zal men binnenlaten, maar voor u, die er niet
bekend zijt, zal men de deur dicht houden.”—„O ja,” zeide
d’Artagnan; „maar gij kent wel aan de een of andere achterdeur van
het Louvre een u genegen portier, die op zeker teeken of
wachtwoord....”—Juffrouw Bonacieux beschouwde den jongeling met
strakken blik.—„En indien ik u het wachtwoord mededeelde,” zeide
zij, „zoudt gij het dan willen vergeten, onmiddellijk na u er van
bediend te hebben?”—„Op mijn woord van eer, zoo waar ik edelman

ben,” antwoordde d’Artagnan op een zoo overtuigenden toon, dat
aan de waarheid niet te twijfelen was.—„Welaan, ik wil u gelooven,
gij schijnt mij een braaf jongeling. Buitendien zal deze
dienstbewijzing misschien uw fortuin zijn.”—„Ik wil, zonder eenige
beloften en naar mijn geweten, alles doen wat den koning dienstig
en der koningin aangenaam kan zijn,” zeide d’Artagnan; „beschik dus
over mij als over een vriend.”—„Maar waar zult gij mij in dien
tusschentijd laten?”—„Kent gij niemand, waar de heer de la Porte u
kan komen afhalen?”—„Neen, ik durf mij op niemand vertrouwen.”—
„Wacht,” hernam d’Artagnan, „wij zijn in de nabijheid van het huis
van Athos. Ja, ik geloof het is wel zoo.”—„Wie is Athos?”—„Een
mijner vrienden.”—„Maar als hij te huis is zal hij mij zien.”—„Hij is
niet te huis, en ik zal den sleutel medenemen, zoodra gij in zijn
kamer zult zijn.”—„Maar als hij terugkomt?”—„Hij zal niet
terugkomen; bovendien, men zal hem zeggen, dat ik een vrouw heb
medegebracht, en dat die vrouw zich in zijn kamer bevindt.”—„Maar
wat zal men wel van mij denken?”—„Wat geeft gij daarom, men kent
u niet; en daarenboven de omstandigheden, waarin wij ons
bevinden, moeten ons over eenige welvoegelijkheden doen
heenstappen.”—„Welaan dan, naar uw vriend! Waar woont hij?”—
„Straat Férou, twee schreden van hier.”—„Welaan!”
En beiden hervatten hun tocht.
Zooals d’Artagnan wel had voorzien, was Athos niet te huis; hij
nam den sleutel, dien men de gewoonte had hem, als een vriend
des huizes, ter hand te stellen, ging de trap op en geleidde juffrouw
Bonacieux in de kleine kamer, van welke wij reeds de beschrijving
hebben gegeven.—„Hier zijt gij te huis,” zeide hij, „sluit nu de deur
van binnen en doe voor niemand open, althans indien men niet tot
driemaal op deze wijze klopt; hoor.”—En hij klopte driemaal,
tweemaal tamelijk hard en snel achter elkander, en vervolgens
nogmaals, maar na een tusschenpoos en wat zachter.
„Goed,” sprak juffrouw Bonacieux. „Nu is het mijn beurt u te
onderrichten.”—„Ik luister.”—„Vertoon u voor de kleine deur van het
Louvre, aan de zijde der Ladderstraat, en vraag naar Germain.”—

„Goed; en dan?”—„Hij zal u vragen, wat gij begeert, en gij zult hem
deze twee woorden zeggen: Tours en Brussel. Daarop zal hij dadelijk
u zijn dienst aanbieden.”—„En waarmede moet ik hem belasten?”—
„Den heer de la Porte, kamerdienaar der koningin, te roepen.”—„En
wanneer hij den heer de la Porte geroepen zal hebben en deze zal
gekomen zijn?”—„Dan moet gij hem tot mij zenden?”—„Het is wel;
maar waar en op welke wijze zal ik u weerzien?”—„Zijt gij er zeer op
gesteld om mij weer te zien?”—„Ongetwijfeld.”—„Welnu, laat aan mij
de zorg hieromtrent over, en wees gerust.”—„Ik maak staat op uw
woord.”—„Reken er op.”
D’Artagnan groette juffrouw Bonacieux, op haar bevallige, kleine
gestalte den verliefdsten blik werpende, die hem mogelijk was, en
terwijl hij de trap afging, hoorde hij de deur achter zich op het
nachtslot draaien. Op een draf snelde hij naar het Louvre; toen hij
voor de poort in de Ladderstraat was, sloeg het tien uur.
Al de gebeurtenissen, die wij hebben verhaald, hadden elkander
in een half uur opgevolgd. Alles viel voor, zooals juffrouw Bonacieux
het had gezegd. Op het geven van het wachtwoord boog zich
Germain; tien minuten later was de la Porte in het portiershuisje;
met een paar woorden had d’Artagnan hem van een en ander kennis
gegeven en hem gezegd, waar juffrouw Bonacieux zich bevond. De
la Porte verzekerde zich ten tweeden male van de nauwkeurigheid
der woonplaats en verwijderde zich haastig. Nauwelijks echter was
hij tien schreden ver, of hij keerde terug.—„Jongeling,” zeide hij tot
d’Artagnan, „ik wil u nog een raad geven.”—„Welken?”—„Het is
mogelijk, dat men u onaangenaamheden aandoet wegens hetgeen
er is voorgevallen.”—„Gelooft gij?”—„Ja. Hebt gij ook een of anderen
vriend, wiens uurwerk nagaat?”—„En dan?”—„Ga hem dan
bezoeken, opdat hij voor het gerecht getuigen kan, dat gij te half
tien bij hem waart. In gerechtszaken heet zulks een alibi.”
D’Artagnan vond den raad heel voorzichtig, en vliegensvlug
snelde hij naar den heer de Tréville; doch in plaats van in de zaal te
gaan, waar het gezelschap bij elkaar was, verzocht hij in zijn kabinet
te worden binnengelaten. Aan d’Artagnan, als een der huisvrienden

bekend, werd zonder moeilijkheden zijn verzoek toegestaan, en men
ging den heer de Tréville verwittigen, dat zijn jeugdige landgenoot,
die hem iets gewichtigs had mede te deelen, een afzonderlijk
gesprek met hem verlangde te hebben. Vijf minuten later vroeg de
heer de Tréville aan d’Artagnan, waarin hij hem van dienst kon zijn,
en wat de reden van zijn zoo laat bezoek was.
„Ik verzoek u verschooning, mijnheer!” zeide d’Artagnan, die van
het oogenblik gebruik had gemaakt, dat hij alleen was geweest, om
de pendule drie vierde uurs na te zetten; „maar ik dacht: daar het
pas vijf minuten voor half tien was, dat ik mij nog gevoegelijk tot u
konde begeven.”—„Vijf minuten voor half tien!” riep de heer de
Tréville op de pendule ziende; „maar dat is niet mogelijk.”—„Zie
slechts, mijnheer!” zeide d’Artagnan, „daar is het bewijs.”—„Het is
zoo,” hernam de heer de Tréville; „ik dacht dat het later was. Maar
laat hooren, wat is er van uw begeerte?”
Toen sprak d’Artagnan den heer de Tréville wijdloopig over de
koningin. Hij gaf hem de vrees te kennen, die hij voor Hare Majesteit
koesterde; hij verhaalde hem, hetgeen hij had gehoord omtrent de
plannen des kardinaals jegens Buckingham, en dat alles met een
kalmte en een gevatheid door welke de heer de Tréville te meer
werd misleid, daar hij zelf, zooals wij gezegd hebben, had
opgemerkt, dat er iets nieuws tusschen den kardinaal, den koning en
de koningin plaats had. Op slag van tien uur verliet d’Artagnan den
heer de Tréville, die hem bedankte voor zijn mededeelingen, hem
aanbevelende, steeds den dienst des konings en der koningin ter
harte te nemen, en die daarop in de zaal terugkeerde. Maar
beneden aan de trap herinnerde zich d’Artagnan zijn rottingstok te
hebben vergeten; en bijgevolg liep hij overhaast weer naar boven,
trad het kabinet binnen, en in een oogwenk draaide hij den wijzer
der pendule op het behoorlijke uur, opdat men den volgenden
morgen niet mocht bemerken, dat ze niet goed ging; en nu
verzekerd, dat hij een getuige had om zijn tegenwoordigheid te
bewijzen, ging hij de trap weder af en was spoedig op straat.

HOOFDSTUK XI.
De intrigue verwikkelt zich.
Na het bezoek bij den heer de Tréville gedaan, sloeg d’Artagnan
peinzende den langsten weg in, om naar zijn woning terug te
keeren.—Waaraan dacht d’Artagnan, die, dus van zijn weg
afwijkende, nu eens zuchtende, dan weder glimlachende, de sterren
des hemels aanschouwde?—Hij dacht aan juffrouw Bonacieux. Voor
den kadet-musketier was de jonge vrouw een bijna ideale geliefde.
Bekoorlijk, geheimzinnig, ingewijd in bijna al de hofgeheimen, die op
haar bevallig gelaat een zoo bekoorlijken ernst verspreidden,
vermoedde men, dat zij niet ongevoelig kon zijn, iets, dat voor
pasbeginnende verliefden een onweerstaanbare aantrekkingskracht
bezit; daarenboven had d’Artagnan haar uit de klauwen dier duivels
verlost, welke haar wilden doorzoeken en mishandelen, en die
gewichtige dienst had tusschen hem en haar een dier gevoelens van
dankbaarheid doen ontstaan, welke zoo gereedelijk van meer
teederen aard worden. D’Artagnan zag zich zelven reeds,—zoo snel
gaan de droomen voort op de vleugels der verbeelding,—door een
boodschapper der jonge vrouw aangesproken, die hem een
minnebrief, een gouden ketting of een juweel overbracht.
Wij zeiden, dat de jonge edellieden, zonder zich daarvoor te
schamen, van hun koning geschenken aannamen; voegen wij er bij,
dat, in dien tijd van gemakkelijke zeden, zij zich voor hun
minnaressen niet schaamden, wanneer deze hun gewoonlijk
kostbare en blijvende geschenken gaven, alsof zij trachtten de
veranderlijkheid hunner gevoelens door de duurzaamheid harer
giften te vergoeden. Men maakte toen zijn fortuin door middel der
vrouwen, zonder hiervoor te blozen. Zij, die slechts schoon waren,
gaven haar schoonheid, en van daar zeker het spreekwoord, dat: het

schoonste meisje der wereld niet in staat is meer te geven, dan zij
heeft. Zij, die rijk waren, gaven bovendien een gedeelte van hun
geld, en men zou een groot aantal helden van dien galanten tijd
kunnen aanwijzen, die vooreerst hun sporen niet zouden gewonnen
hebben, noch later hun veldslagen, zonder de min of meer gevulde
beurs, die hun minnaressen aan den zadelknop hingen.
D’Artagnan bezat niets; de ingetogenheid van den landelijken
jongeling was als een licht vernis, als een bloem, als het dons der
perzik door den wind der weinig zedelijke raadgevingen, die de drie
musketiers hun jongen vriend gaven, weggevaagd. D’Artagnan,
volgens de zonderlinge gewoonten van dien tijd, beschouwde zich te
Parijs als in een legerkamp, en de vrouwen als zijn buit, en zulks,
alsof hij in Vlaanderen tegenover den Spanjaard stond; overal was
een aangeboren vijand te bestrijden en was er buit te maken.
Maar zeggen wij het, d’Artagnan was op dat oogenblik door een
meer edel en minder baatzuchtig gevoel bezield. De winkelier had
hem gezegd, dat hij rijk was; de jongeling had kunnen begrijpen,
dat met een onnoozele, zooals de heer Bonacieux, het de vrouw
moest zijn, die den sleutel van de geldkist had. Maar dit had niet
dien minsten invloed uitgeoefend op den indruk, dien de aanblik van
juffrouw Bonacieux bij hem had teweeggebracht: en het belang
bleef bijna vreemd aan dat begin van liefde, dat het gevolg van dien
indruk was. Wij zeggen bijna; want wij verbeelden ons, dat als een
jonge, bevallige, geestige vrouw tevens rijk is, dit laatste niet aan
een ontluikende liefde in den weg staat, maar die liefde integendeel
meer ontwikkelt. Welgesteldheid doet een aantal zorgen en
aristocratische luimen ontstaan, die aan de schoonheid veel voordeel
doen. Fijne, witte kousen, een zijden kleed, een kanten halsdoek,
een fraaie schoen aan den voet, een nieuw lint op het hoofd maken
een schoone vrouw niet leelijk, noch een leelijke vrouw schoon,
zonder daarbij de handen te rekenen, die bij dat alles winnen:
immers de handen der vrouwen moeten niets doen om fraai te
blijven.... Daarbij was d’Artagnan, zooals het den lezer, dien wij den
staat zijner geldmiddelen niet hebben ontveinsd, trouwens bekend
is, bij lange geen millionnair, hij hoopte zulks, wel is waar, den een

of anderen dag te worden; maar de dag, dien hij bij zich zelven voor
deze gelukkige verandering had bepaald, was nog tamelijk ver
verwijderd. Hoe smartelijk valt het intusschen, de vrouw, die men
bemint, die duizenden snuisterijen te zien verlangen, waaruit de
vrouwen haar geluk samenstellen, en haar die duizenden
snuisterijen niet te kunnen geven.... Althans indien de vrouw rijk, en
de minnaar het niet is, bezorgt zij zich zelve datgene, wat hij haar
niet kan aanbieden; en hoewel gewoonlijk het geld des echtgenoots
wordt besteed, om zich dat genoegen te verschaffen, is het echter
zeldzaam, dat hij er dankbaarheid voor inoogst. Vervolgens, gaarne
de teederste minnaar willende zijn, was d’Artagnan, in afwachting,
reeds een zeer dienstvaardig vriend. Te midden zijner verliefde
plannen op de vrouw van den winkelier vergat hij de zijne niet. De
mooie juffrouw Bonacieux was een vrouw, zeer geschikt om
daarmede in de vlakte van St. Denis of langs de kermis van St.
Germain in gezelschap van Athos, Porthos en Aramis te gaan
wandelen, aan wie d’Artagnan met trotschheid een dergelijke
verovering zou vertoonen. En na een vermoeiende wandeling begint
de honger te prikkelen; d’Artagnan had zulks ook reeds sedert
eenigen tijd opgemerkt. Men zou dan aan die kleine, bekoorlijke
maaltijden plaats nemen, waarbij men aan de eene zijde de hand
eens vriends, en aan de andere den voet eener minnares drukt.
Kortom, in oogenblikken van nood en gevaar zou d’Artagnan de
redder zijner vrienden zijn.
En de heer Bonacieux, dien d’Artagnan in de handen der
politiedienaren overgeleverd had door hem luid te verloochenen,
maar dien hij beloofd had te zullen redden? Wij moeten onze lezers
bekennen, dat d’Artagnan aan hem volstrekt niet dacht, en zoo al,
dat hij zich zelven verzekerde, dat die man, waar hij was, zich zeer
goed bevond, onverschillig op welke plaats ook. De liefde is de
baatzuchtigste aller hartstochten.
Intusschen gelieven onze lezers zich gerust te stellen; hoewel
d’Artagnan zijn huisheer vergeet, of hem schijnt te vergeten, onder
het voorwendsel niet te weten werwaarts men hem heeft gevoerd,
wij vergeten hem niet, en wij weten zeer goed, waar hij is. Maar

doen wij voor het oogenblik, zooals de verliefde Gaskonjer; wij
zullen later op den waardigen winkelier terugkomen.
D’Artagnan, al peinzende over zijn toekomstige liefde, met den
nacht in gesprek en de sterren toelonkende, liep de straat Cherche-
midi of Chasse-midi, zooals men die toen noemde, door. Daar hij
zich in de nabijheid der woning van Aramis bevond, kwam het
denkbeeld in hem op, zijn vriend een bezoek te brengen en hem een
nadere verklaring te geven der reden, die hem Planchet had doen
zenden om hem te verzoeken zich zonder verwijl naar de muizenval
te begeven. Want, zoo redeneerde hij bij zich zelf, als Aramis thuis
was, toen Planchet hem de boodschap kwam brengen, was hij
ongetwijfeld naar de Doodgraversstraat gegaan en niemand daar
aantreffende dan zijn twee andere vrienden, zou hij noch een van
drieën geweten hebben, wat die boodschap beteekende. Die zaak
moest worden opgehelderd; ziedaar, wat d’Artagnan zich zelven
overluid zeide, maar in stilte dacht hij, dat het tevens voor hem een
gelegenheid zou zijn, om van de kleine, lieve juffrouw Bonacieux te
spreken, van wie zijn geest, zoo niet zijn hart, reeds geheel vervuld
was.
Het is niet van een eerste liefde, dat men geheimhouding moet
verwachten. Een eerste liefde gaat vergezeld van een zoo groote
blijdschap, dat zij moet overloopen, wil men er niet door stikken.
Sedert twee uren was Parijs in duisternis gehuld, en begon het in
de stad eenzaam te worden. Elf uur sloeg het op al de uurwerken
van de voorstad St. Germain; het weder was zacht. D’Artagnan ging
een steeg door, ter plaatse waar thans de straat d’Ansas is, de
welriekende uitwasemingen inademende, die de wind hem van de
straat Vaugirard overbracht, en die voortkwamen uit de door den
avonddauw en de koelte des nachts verkwikte tuinen. In de verte
hoorde men het gerucht, dat uit eenige in de vlakte verstrooide
herbergen voortkwam, ondanks hun zware vensterluiken.
Toen hij het einde der steeg bereikt had, sloeg d’Artagnan links
om. Het huis, dat Aramis bewoonde, bevond zich tusschen de straat
Casette en de straat Servandoni. D’Artagnan was voorbij de straat

Casette en ontwaarde reeds de deur der woning zijns vriends,
verscholen achter een groep moerbezie-, vijgeboomen en
meelbloemen, die er boven een dicht ineengegroeide kruin vormden,
toen hij een menschelijke schim uit de straat Servandoni zag
verschijnen. Die schim was in een mantel gehuld, en d’Artagnan
hield ze aanvankelijk voor een man, maar aan de kleinheid der
gestalte, aan den onzekeren en waggelenden gang, herkende hij
spoedig een vrouw. En alsof die vrouw niet zeker was geweest van
het huis, dat zij zocht, liet zij de oogen rondwaren, ten einde zich
van de omgeving op de hoogte te stellen; nu stond zij stil, ging dan
weder achteruit en keerde op haar schreden terug. D’Artagnan wist
niet, wat hij hiervan moest denken.
„Indien ik haar eens mijn dienst ging aanbieden!” dacht hij. „Aan
haar gestalte ziet men, dat zij jong is, misschien is zij daarbij wel
mooi. Stellig! maar een vrouw, die op dit uur op straat is, gaat
gewoonlijk niet uit dan om haar minnaar te zoeken.... Duivelsch!
indien ik die samenkomst ging storen, zou het een slechte inleiding
zijn, om kennis met haar te maken.”
Intusschen vervolgde de jonge vrouw steeds haar weg, de huizen
en vensters tellende. Dit vereischte trouwens niet veel tijd, noch veel
moeite. Slechts drie hotels bevonden zich in dat gedeelte dier straat,
en twee vensters, die op de straat uitkwamen; het eene was van een
paviljoen, dat aan datgene grensde, hetwelk Aramis bewoonde; het
andere was dat van Aramis zelf.
„Pardieu!” zeide d’Artagnan bij zich zelven, die zich de nicht van
den Theologant herinnerde, „pardieu! het zou raar zijn, als die
nachtelijke tortelduif het huis van onzen vriend zocht. Maar bij mijn
ziel! het schijnt waarachtig zoo. O, mijn waarde Aramis! voor dezen
keer wil ik er het mijne van hebben!”—En d’Artagnan, zich zooveel
mogelijk inkrimpende, begaf zich naar het donkerste gedeelte van
de straat, dicht bij een steenen bank, en verborg zich daar in een
nis.
De jonge vrouw ging steeds voorwaarts, en behalve de vlugheid
van haar gang, die haar jonkheid aanduidde, liet zij een zwak

gekuch hooren, dat een allerzuiverste stem verried. D’Artagnan hield
dien hoest voor een afgesproken teeken.—Intusschen, hetzij men op
dien hoest door een overeenkomstig teeken, dat de aarzeling der
nachtelijke zwerfster deed ophouden, had geantwoord, hetzij dat zij,
zonder vreemde hulp, de plaats harer bestemming herkende, zij
naderde stoutmoedig het vensterluik van Aramis en klopte met haar
kromgebogen vinger driemaal met gelijke tusschenpoozen.
„Het is wel bij Aramis,” mompelde d’Artagnan. „O, mijnheer de
huichelaar! ik betrap u in uw godgeleerde studiën.”
Nauwelijks had zij drie malen geklopt, of het binnenraam werd
geopend, en licht blonk door de opening van het luik.
„Ha, ha,” dacht de luistervink. „Zoo, zoo, het is afgesproken.
Komaan, het luik zal nu wel geopend worden, en de dame, door
inklimming, binnen geraken.... Heerlijk!”
Maar tot d’Artagnan’s grootste verwondering bleef het luik
gesloten; het licht, dat een oogenblik had geschenen, verdween, en
alles keerde weder in de duisternis terug. D’Artagnan meende, dat
dit van korten duur zou zijn, en hij ging voort met al zijn zintuigen te
zien en te hooren.—Hij had gelijk; na verloop van een paar seconden
werden er van binnen twee harde slagen gehoord. De jonge vrouw
klopte eenmaal tot antwoord, en het luik werd een weinig
geopend.... Men oordeele over de nieuwsgierigheid, waarmede
d’Artagnan zag en luisterde. Ongelukkiglijk was het licht in een ander
vertrek gebracht; maar des jongelings oogen hadden zich aan de
duisternis gewend; bovendien, zooals men zegt, bezitten de oogen
der Gaskonjers, gelijk die der katten, het vermogen om in het
donker te zien. D’Artagnan zag dan, dat de jonge vrouw uit haar zak
een wit voorwerp haalde, hetwelk zij haastig opensloeg, en dat toen
den vorm van een neusdoek aannam.... Van dit opengevouwen
voorwerp vertoonde zij een punt aan dengene, die het luik geopend
had. Dit herinnerde d’Artagnan den zakdoek, dien hij aan de voeten
van juffrouw Bonacieux had gezien, en welke hem dien had
herinnerd, welken hij onder den voet van Aramis vond.

„Wat duivel moet die zakdoek toch beteekenen?”—Van de plaats,
waar d’Artagnan stond, kon hij het gezicht van Aramis niet zien;—wij
zeggen van Aramis, omdat de jongen niet twijfelde, of het was zijn
vriend, die van binnen met de dame van buiten in gesprek was;—de
nieuwsgierigheid won het eindelijk van de voorzichtigheid, en van de
afgetrokkenheid gebruik makende, in welke het zien des zakdoeks
beide personen, die wij ten tooneele voeren, scheen te dompelen,
verliet hij zijn schuilplaats, en met bliksemsnelheid drong hij zich
tegen den hoek des muurs, van waar hij met zijn blik volkomen de
kamer van Aramis kon overzien. Dáár aangekomen, ontglipte
d’Artagnan bijna een kreet van verbazing; het was Aramis niet, die in
gesprek was met de nachtelijke bezoekster, het was een vrouw....
D’Artagnan zag genoeg om de soort van haar kleederdracht te
herkennen, maar niet genoeg om haar gelaatstrekken te
onderscheiden. Op hetzelfde oogenblik haalde de vrouw in het
vertrek een tweeden zakdoek te voorschijn en ruilde hem voor dien,
welken men haar vertoond had. Vervolgens wisselden beide vrouwen
eenige woorden met elkander; toen werd het blind weder gesloten,
en de vrouw, die op straat was, keerde zich om en ging d’Artagnan
op vier schreden voorbij, de kap van haar mantel neerlatende; maar
deze voorzorg kwam te laat, want d’Artagnan had juffrouw
Bonacieux reeds herkend.
„Mejuffrouw Bonacieux!”—Het vermoeden, dat zij het was, had
zijn geest reeds vervuld, toen zij den zakdoek uit haar zak haalde;
maar het was immers niet waarschijnlijk, dat juffrouw Bonacieux, die
den heer de la Porte had laten roepen om haar naar het Louvre te
geleiden, nu alleen de straten van Parijs om half twaalf des nachts
doorliep op gevaar af van voor de tweede maal te worden
ontvoerd.... Het moest dus voor een zeer gewichtige zaak zijn;—en
wat is voor een vrouw van vijf en twintig jaar de gewichtigste
zaak?.... De liefde.—Maar was het in haar eigen belang, òf in dat van
iemand anders, dat zij zich aan zooveel gevaar blootstelde?.... Dit
waren de vragen, die zich de jongeling deed, wiens hart reeds door
den duivel der jaloezie werd gekweld, alsof hij reeds tot erkenden
minnaar aangenomen ware.... Overigens, er bleef hem een

eenvoudig middel over, om zich te verzekeren, waarheen juffrouw
Bonacieux zich begaf; dit middel was, haar te volgen. Een middel
zoo eenvoudig, dat d’Artagnan het natuurlijkerwijze en werktuigelijk
te baat nam. Maar op het zien van den jongeling, die zich van den
muur los maakte als een standbeeld uit zijn nis, en op het gerucht
der voetstappen, welke zij achter zich hoorde weergalmen, liet
juffrouw Bonacieux een zwakken kreet ontglippen en ging op de
vlucht. D’Artagnan achtervolgde haar en het was voor hem niet
moeilijk een vrouw in te halen, die in haar loop door een wijden
mantel gehinderd werd.... Hij bereikte haar dan ook op het derde
gedeelte der straat, die zij was ingeloopen. De ongelukkige was
uitgeput, niet door vermoeidheid, maar door angst en toen
d’Artagnan zijn hand op haar schouder legde, viel zij op de knieën en
riep met gesmoorde stem: „Breng mij om het leven, zoo gij wilt,
maar gij zult niets weten!”
D’Artagnan richtte haar op, zijn arm om haar middel slaande;
maar daar hij aan het gewicht, dat op zijn arm drukte, voelde, dat zij
op het punt was in onmacht te vallen, haastte hij zich door
betuigingen van dienstaanbieding haar gerust te stellen. Deze
betuigingen waren voor juffrouw Bonacieux van niet de minste
waarde, immers dergelijke betuigingen kunnen met de slechtste
bedoelingen der wereld gedaan worden; maar de stem was voor
haar van meer waarde. De jonge vrouw meende den klank dier stem
te herkennen; zij opende de oogen weder, sloeg haar blik op den
man, die haar zoo grooten schrik had aangejaagd en d’Artagnan
herkennende, slaakte zij een vreugdekreet.
„O, zijt gij het!” riep zij; „ik dank u, mijn God!”—„Ja, ik ben het,”
zeide d’Artagnan; „ik, dien God heeft gezonden om over u te
waken.”—„Was het met dat voornemen, dat gij mij volgdet?” vroeg
met een koketten glimlach de jonge vrouw, wier spotlustige aard
weder boven kwam en bij wie het denkbeeld van vrees geheel was
verdwenen, van het oogenblik dat zij een vriend herkende in
dengene, dien zij voor een vijand had aangezien.

„Neen,” hernam d’Artagnan, „neen, ik beken, dat alleen het
toeval mij op uw weg heeft gevoerd; ik zag een vrouw aan het
venster van een mijner vrienden kloppen.”—„Van een uwer
vrienden?” viel juffrouw Bonacieux hem in de rede.—„Zeker; Aramis
is een mijner beste vrienden.”—„Aramis? wie is dat?”—„Komaan, wilt
gij mij nu wijs maken, dat gij Aramis niet zoudt kennen?”—„Het is de
eerste maal, dat ik dien naam hoor noemen.”—„Was het dan voor
het eerst, dat gij naar dat huis gingt?”—„Ja.”—„En gij wist niet, dat
het door een jongeling werd bewoond?”—„Neen.”—„Door een
musketier?”—„Volstrekt niet.”—„Hij was het niet, dien gij gingt
bezoeken?”—„In het minste niet. Daarenboven, gij hebt dit moeten
zien: de persoon, met wie ik heb gesproken, was een vrouw.”—„Dat
is waar, maar die vrouw zal een vriendin van Aramis zijn geweest?”—
„Dat weet ik niet.”—„Wel, zij was immers in zijn huis.”—„Dat kan wel
zijn.”—„Maar wie is zij?”—„O, dat mag ik niet zeggen.”—„Lieve
mejuffrouw Bonacieux; gij zijt allerbekoorlijkst; maar tevens zijt gij
de geheimzinnigste dame der wereld.”—„Ben ik hierom minder in uw
oog?”—„Neen, integendeel, gij zijt aanbiddelijk.”—„Geef mij dan uw
arm.”—„Gaarne, en nu?”—„Ga met mij.”—„Waarheen?”—„Waar ik
heen ga.”—„Maar waarheen gaat gij?”—„Gij zult het zien, dewijl ik u
aan de deur zal laten.”—„Moet ik wachten?”—„Dat is niet noodig.”—
„Gij zult dan alleen terugkeeren?”—„Misschien wel, misschien niet.”—
„Maar zal de persoon, die u vervolgens zal geleiden, een man of een
vrouw zijn?”—„Dat weet ik zelve nog niet.”—„Dan zal ik het
weten.”—„Hoedat?”—„Ik zal wachten, totdat gij er uit komt.”—„In
dat geval, vaarwel!”—„Waarom?”—„Ik heb u niet noodig.”—„Maar gij
hebt mij verzocht.”—„Ik heb om de hulp eens edelmans, maar niet
de beloering eens spions verzocht.”—„Het woord is niet zacht.”—
„Hoe noemt men hen, die de lieden tegen hun wil volgen?”—
„Nieuwsgierigen.”—„Dat woord is te zacht.”—„Welaan, mejuffrouw! ik
zie wel, dat men zich aan u moet onderwerpen.”—„Waarom hebt gij
u de verdienste ontzegd zulks onmiddellijk te doen?”—„Is het er dan
niet eene, berouw te hebben?”—„En hebt gij wezenlijk berouw?”—
„Dat weet ik zelf niet; maar wat ik weet, is, dat ik u beloof alles te
zullen doen, wat gij begeert, indien gij mij veroorlooft u te
vergezellen tot dáár, waarheen gij gaan wilt.”—„En zult gij mij

daarna verlaten?”—„Ja.”—„Zonder mij verder te bespieden?”—„Ja.”—
„Op uw woord van eer?”—„Op mijn woord van edelman!”—„Geef mij
den arm en laat ons gaan.”
D’Artagnan bood zijn arm aan juffrouw Bonacieux, die, half
lachende, half bevende, hem aannam. Beiden bereikten alzoo het
einde der straat la Harpe. Dáár scheen de jonge vrouw te aarzelen,
zooals in de straat Vaugirard. Echter meende zij aan zekere
kenteekenen een deur te herkennen en haar naderende, zeide zij:
„Hier, mijnheer! is het, waar ik zijn moet; duizendmaal dank voor uw
vereerend gezelschap, dat mij gevrijwaard heeft voor al de gevaren,
waaraan ik alleen zou zijn blootgesteld; het oogenblik is nu gekomen
uw woord te houden. Ik ben ter plaatse mijner bestemming.”—„En
hebt gij, terugkeerende, niets meer te vreezen?”—„Niets anders dan
de dieven.”—„Is dat dan niets?”—„Wat kunnen zij mij ontnemen? ik
heb geen penning in den zak.”—„Gij vergeet dien fraaien, met een
wapen geborduurden zakdoek.”—„Welken?”—„Dien ik aan uw voeten
gezien en in uw zak gestoken heb.”—„Zwijg, zwijg, ongelukkige!”
riep de jonge vrouw; „wilt gij mij in het verderf storten?”—„Gij ziet
wel, dat er nog gevaar voor u aanwezig is; want één enkel woord
doet u beven en gij bekent, dat, indien hetzelve gehoord werd, gij
verloren zoudt zijn. O! zie, mejuffrouw!” ging d’Artagnan voort, haar
hand nemende en op haar een gloeienden blik vestigende. „Zie,
wees edelmoediger, stel in mij vertrouwen; hebt gij dan niet in mijn
oogen kunnen lezen, dat alleen van liefde en toewijding aan u mijn
hart is vervuld?”—„O, ja!” antwoordde juffrouw Bonacieux, „vraag
mij daarom ook naar mijn geheimen en ik zal ze u zeggen; maar die
van anderen, dat is iets anders.”—„Het is wel,” zeide d’Artagnan, „ik
zal ze ontdekken; omdat deze geheimen invloed op uw leven kunnen
hebben, moeten die geheimen de mijne worden.”—„Wacht er u wel
voor!” riep de jonge vrouw, met een ernst, die d’Artagnan
onwillekeurig een huivering op het lijf joeg. „O, bemoei u met niets,
wat mij betreft; tracht mij niet te helpen in hetgeen ik wil ten uitvoer
brengen; ik vraag u dit in naam van het belang, dat ik u inboezem,
in naam van den dienst, welken gij mij hebt bewezen en dien ik zoo
lang ik leef niet zal vergeten. Geloof liever aan hetgeen ik u zeg.

Bemoei u niet meer met mij, laat ik voor u niet meer bestaan en laat
het zijn, alsof gij mij nimmer gezien hebt.”—„Moet Aramis even zoo
doen als ik, mejuffrouw?” vroeg d’Artagnan verstoord.—„Ziedaar
reeds twee of drie malen, dat gij dien naam hebt genoemd,
mijnheer! ik heb u echter gezegd, dat ik hem niet kende.”—„Kent gij
hem niet, aan wiens venster gij hebt geklopt? Kom, mejuffrouw! gij
beschouwt mij toch niet voor al te lichtgeloovig.”—„Beken dat het is,
om mij uit te hooren, dat gij dien naam en die historie verzint.”—„Ik
verzin niets, mejuffrouw! ik spreek de zuivere waarheid.”—„En gij
zegt, dat een uwer vrienden in dat huis woont?”—„Ik zeg en herhaal
het voor de derde maal, in dat huis woont mijn vriend en die vriend
heet Aramis.”—„Dit alles zal zich later ophelderen,” lispte de jonge
vrouw; „zwijg er nu over, mijnheer!”—„Indien gij in mijn hart kondet
lezen,” zeide d’Artagnan, „zoudt gij er zooveel nieuwsgierigheid in
zien, dat gij medelijden met mij zoudt gevoelen en zooveel liefde,
dat gij onmiddellijk die nieuwsgierigheid zoudt voldoen. Men heeft
niets te vreezen van hen, door wie men bemind wordt.”—„Gij
spreekt al zeer spoedig van liefde, mijnheer!” zeide de jonge vrouw,
het hoofd schuddende.—„Het is, omdat mij de liefde eensklaps
overvallen is en voor de eerste maal en omdat ik nog geen twintig
jaar oud ben.”
De jonge vrouw zag hem van ter zijde aan.—„Luister,” hernam
d’Artagnan, „ik ben reeds op het spoor. Drie maanden geleden had ik
bijna een tweegevecht aangegaan met Aramis, uit hoofde van een
zakdoek, op dien gelijkende, welken gij die vrouw hebt vertoond, die
zich in zijn kamer bevond en die, ik ben er zeker van, even zoo
gemerkt was.”—„Mijnheer!” zeide de jonge vrouw, „gij verveelt mij
erg, dat verzeker ik u, met al die praatjes.”—„Maar gij, mejuffrouw,
die zoo voorzichtig zijt, zoudt gij, wanneer gij met dien zakdoek
werdt aangehouden, niet in gevaar verkeeren?”—„Waarom, is het
naamcijfer het mijne niet: C. B. Constance Bonacieux?”—„Of Camille
de Bois-Tracy?”—„Stil mijnheer! nogmaals stil! Maar, dewijl de
gevaren, die ik voor mij zelve loop, u niet weerhouden, denk dan
aan die, welke gij kunt loopen.”—„Ik?”—„Ja, gij! Gij waagt in de
gevangenis te komen, gij waagt zelfs uw leven, door mij te

kennen.”—„Dan verlaat ik u niet meer.”—„Mijnheer!” smeekte de
jonge vrouw met gevouwen handen, „mijnheer! in ’s hemels naam!
op uw eer als krijgsman en uw beleefdheid als edelman! ik bid u,
verwijder u! Zie, daar slaat het middernacht, het uur, waarop men
mij wacht.”—„Mejuffrouw!” zeide de jongeling, zich buigende, „wees
gerust, ik verwijder mij.”—„En gij zult mij niet volgen, mij niet
bespieden?”—„Ik ga onmiddellijk naar huis.”—„O! ik wist wel, dat gij
een braaf jongeling waart,” riep juffrouw Bonacieux, hem de eene
hand toereikende, terwijl zij de andere op den klopper der kleine,
bijna onzichtbare deur van den muur, voor welken zij stonden, legde.
D’Artagnan greep de hand, die men hem aanbood en drukte er
vurige kussen op.
„O! ik had u liever nooit gezien!” riep d’Artagnan met die
eenvoudige heftigheid uit, welke de vrouwen gewoonlijk boven een
gemaakte wellevendheid verkiezen, omdat zij de inwendige
gedachte bloot legt en ten bewijs strekt, dat het gevoel het verstand
beheerscht.—„Welnu,” hernam juffrouw Bonacieux met bijna
vleiende stem en de hand van d’Artagnan drukkende, die de hare
nog vasthield, „welnu, ik wil dan zeggen: wat heden is uitgesteld, is
voor het vervolg niet verloren. Wie weet of, indien ik eenmaal van
mijn geheim ontbonden zal zijn, ik uw nieuwsgierigheid niet zal
voldoen.”—„En doet gij mij dezelfde belofte ten aanzien mijner
liefde?” riep d’Artagnan, ten toppunt van vreugd.—„O! wat dat
betreft, ik kan mij niet verbinden, dat zal van de gevoelens
afhangen, die gij mij zult weten in te boezemen.”—„Dus voor heden,
mejuffrouw!”—„Voor heden, mijnheer, kan ik mij slechts tot
erkentelijkheid bepalen.”—„Ach! gij zijt al te bekoorlijk!” zeide
d’Artagnan treurig, „en gij maakt misbruik van mijn liefde.”—„Neen,
ik maak gebruik van uw edelmoedigheid; ziedaar alles! Maar wees
verzekerd, met zekere lieden komt alles terecht.”—„O! gij maakt mij
tot den gelukkigste der menschen! Vergeet dezen avond, vergeet
deze belofte niet!”—„Wees gerust, te bekwamer uur zal ik mij alles
herinneren. En nu, verwijder u, vertrek in ’s hemels naam! Men
wachtte mij op klokslag van middernacht en het is er nu reeds
over.”—„Vijf minuten!”—„Ja, maar in zekere omstandigheden zijn vijf

minuten vijf eeuwen.”—„Wanneer men bemint.”—„Welnu, wie zegt u,
dat ik met geen verliefde te doen heb?”—„Het is een man, die u
wacht!” riep d’Artagnan.—„Een man! komaan! zie, daar begint gij
weer,” zeide juffrouw Bonacieux met een flauwen glimlach, die
eenigszins naar ongeduld zweemde.—„Neen, neen! ik ga, ik
verwijder mij, ik vertrek, ik geloof u, en ik wil mij opofferen, al zou
deze opoffering een dwaasheid zijn. Vaarwel, mejuffrouw! vaarwel!”
En alsof hij zich niet krachtig genoeg voelde, zich van haar hand
los te maken, dan door er zich van los te rukken, verwijderde hij zich
hard loopende, terwijl juffrouw Bonacieux driemaal, zooals op het
venster, langzaam en met tusschenpoozen klopte. Toen d’Artagnan
aan den hoek der straat was gekomen, keerde hij zich om: de deur
was geopend en weder gesloten geworden, de schoone
koopmansvrouw was verdwenen.
D’Artagnan vervolgde zijn weg, hij had zijn woord gegeven
juffrouw Bonacieux niet te zullen bespieden en al had zijn leven er
van afgehangen, om te weten, werwaarts zij zich moest begeven, of
den man te kennen, die haar moest geleiden, d’Artagnan zou naar
huis zijn gegaan, omdat hij het beloofd had. Vijf minuten later was
hij in de Doodgraversstraat.
„Die arme Athos!” zeide hij, „zal niet weten, wat het te beduiden
heeft. Hij zal, mij afwachtende, in slaap gevallen zijn of naar zijn
huis teruggekeerd zijn en te huis komende, zal men hem gezegd
hebben, dat er een vrouw op zijn kamer is geweest. Een vrouw bij
Athos! Maar er was er wel eene bij Aramis!” ging d’Artagnan bij zich
zelven voort. „Dat alles is zeer vreemd en ik ben zeer nieuwsgierig te
weten, hoe het zal afloopen.”—„Slecht, mijnheer! slecht!”
antwoordde een stem, die de jongeling voor die van Planchet
herkende; want overluid tot zich zelven sprekende, zooals lieden, die
zeer afgetrokken zijn, ging hij de gang door, aan het einde van welke
de trap was, die naar zijn kamers leidde.—„Hoedat slecht? Wat wilt
gij zeggen, lomperd?” vroeg d’Artagnan; „wat is u dan gebeurd?”—
„Allerlei rampen.”—„Welke?”—„Vooreerst is de heer Athos in
hechtenis genomen.”—„Athos in hechtenis genomen! en waarom?”—

Welcome to our website – the perfect destination for book lovers and
knowledge seekers. We believe that every book holds a new world,
offering opportunities for learning, discovery, and personal growth.
That’s why we are dedicated to bringing you a diverse collection of
books, ranging from classic literature and specialized publications to
self-development guides and children's books.
More than just a book-buying platform, we strive to be a bridge
connecting you with timeless cultural and intellectual values. With an
elegant, user-friendly interface and a smart search system, you can
quickly find the books that best suit your interests. Additionally,
our special promotions and home delivery services help you save time
and fully enjoy the joy of reading.
Join us on a journey of knowledge exploration, passion nurturing, and
personal growth every day!
ebookbell.com

Nucleic Acid Aptamers Selection Characterization And Application Gnter Mayer

About This Presentation

Slide Content

Tags

Categories

Download

Quick Actions

Statistics

Related Slideshows

Nucleic Acid Aptamers Selection Characterization And Application Gnter Mayer

About This Presentation

Slide Content

Slide 1

Slide 2

Slide 3

Slide 5

Slide 6

Slide 8

Slide 9

Slide 10

Slide 11

Slide 12

Slide 13

Slide 14

Slide 15

Slide 16

Slide 18

Slide 20

Slide 21

Slide 22

Slide 23

Slide 24

Slide 25

Slide 26

Slide 27

Slide 28

Slide 29

Slide 30

Slide 31

Slide 32

Slide 33

Slide 34

Slide 35

Slide 36

Slide 38

Slide 39

Slide 40

Slide 41

Slide 42

Slide 43

Slide 44

Slide 45

Slide 46

Slide 47

Slide 48

Slide 49

Slide 50

Slide 51

Slide 52

Slide 53

Slide 54

Slide 55

Slide 56

Slide 57

Slide 58

Slide 59

Slide 60

Slide 61

Slide 62

Slide 63

Slide 64

Slide 65

Slide 66

Slide 67

Slide 68

Slide 69

Slide 70

Slide 71

Slide 72

Slide 73

Slide 74

Slide 75

Slide 76

Slide 77

Slide 78

Slide 79

Slide 80

Slide 81

Slide 82