Técnicas Histológicas.ppt.........................

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2. TECNICAS HISTOLOGICAS
Se define Técnica Histológica
como el conjunto de
operaciones a que se somete
una materia organizada, a fin de
posibilitar su estudio al
microscopio.
Las Técnicas Histológicas
incluyen los siguientes pasos:
Obtención de la Muestra.
Fijación de la Muestra.
Deshidratación.
Inclusión en Parafina.
Obtención de cortes.
Coloración.
Montaje

3. Obtención de material humano:
De tres fuentes puede provenir el
material humano:
Necropsias o Autopsias: Son las piezas
que se obtienen de un cadáver.
Biopsias: Son trozos de tejido que se
obtienen de un sujeto con vida con
el objeto de estudiarlos al
microscopio y efectuar un
diagnóstico histopatológico.
- Piezas operadas: Los tejidos que han
sido extraídos de las intervenciones
quirúrgicas, generalmente tumores u
órganos inflamados, pero, sólo
servirán para anatomía patológica.

4. FIJACION DE LA MUESTRA
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido
con sustancias químicas que tienen varias
finalidades:
Conservar los tejidos de forma que muestren el
mayor parecido posible a su estado in vivo.
Aumentar la dureza del tejido para facilitar la
preparación de finas películas de éste.
Destruir bacterias y gérmenes que pudieran
encontrarse en ellos.
Interrumpir los procesos celulares dinámicos que
ocurren a la muerte de la célula.

5. La fijación mantiene las estructuras al
estimular la formación de enlaces
cruzados entre las proteínas.
Regla de Oro para la Fijación
La mejor fijación es cuando a pasado el
menor tiempo entre la muerte del
tejido y la fijación.
Tamaño de la Muestra.
El tamaño de la muestra debe de ser de
2-3 cm. variando el estudio para lo
cual de va a utilizar.

6. FIJACION (CONTINUACION)
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración
ulterior de los tejidos.
FIJADORES QUÍMICOS
Son los más utilizados; pueden ser:
- fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y
- fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su
constitución.
FIJADORES SIMPLES:
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en
que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar
órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).

7. Para Microscopia Electrónica se usan:
Glutaraldehído al 2.5%, Paraformaldehído,
Tetróxido de Osmio y Permanganato de
Potasio
Permiten conservar detalles estructurales
finos, ya que otros fijadores como el
formaldehido, son muy enérgicos en su acción
con las proteínas.
Actúan como colorantes electrodensos,
permitiendo observar al tejido con el haz de
electrones.
Una solución de Glutaraldehído al 2.5% en un
tampón a pH 7.4, evita la violenta
desnaturalización de las proteínas guardando
detalles finos de la célula. Es el más usado en
Microscopia Electrónica.

8. DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO
DESHIDRATACIÓN
Después que la muestra ha sido fijada se
elimina el fijador y se deshidrata.
Debido a que una gran parte del tejido está
constituida por agua, se aplica una serie
gradual de soluciones acuosas de menor a
mayor de agente deshidratante, por ejemplo,
Alcohol Etílico o Acetona.
Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una
solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y
alcanzando de manera paulatina el alcohol al
100 % para eliminar el agua.
Esto se hace por que si se colocara el tejido
en una solución al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldría muy rápido
del tejido y se deformaría.

9. ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una
solución de una sustancia que es miscible
tanto con el alcohol como con el medio de
inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos
se utiliza como medio de inclusión Parafina
líquida).
La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno
o Xilol.
Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna
transparente o claro en el xileno, esto se debe
a que cambia su índice de refracción.
También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o
Cloroformo como medios de aclaramiento.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los
lípidos de la célula y por lo cual al extraerse
también se extraen las grasas y los lípidos de la
célula.

10. DESHIDRATACION E INCLUSION EN PARAFINA
A fin de que se puedan obtener cortes
suficientemente finos para ser observados al
microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y
envueltos por una sustancia de consistencia firme.
Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y
parafina.
El objeto de la inclusión es:
Tener un objeto lo suficientemente duro para su
manejo y corte.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o
cualquier medio de inclusión en estado líquido al
tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y
penetra en el tejido.
Por lo general se coloca la muestra de tejido en un
recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C,
colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a
6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.

11. Debido al calor, el xilol o el benzol
se evaporan y los espacios
anteriormente ocupados por ellos
son ahora ocupados por la
parafina.
Después se coloca la pieza y un
poco de parafina fundida en un
molde de papel o metal de forma
rectangular y se deja solidificar a
temperatura ambiente,
formándose un bloque sólido de
parafina con el trozo de tejido
incluido, a este bloque se le
denomina Taco.

12. OBTENCION DE CORTES
El taco ahora se puede cortar en secciones
lo suficientemente delgadas como para
permitir el paso de la luz.
La mayor parte de los preparados para
microscopia óptica tienen un grosor entre 3
a 10 micrómetros.
Para estos cortes se utiliza un aparato
llamado MICROTOMO.
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos
que se extraen en el proceso de
aclaramiento o enzimas que quedan
inactivadas por el calentamiento de la
inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de
Congelación de Tejidos.
Un tejido congelado, es los suficientemente
duro para ser cortado. Se sumerge la
muestra de tejido en Nitrógeno líquido para
tener una congelación rápida.

13. COLORACION O TINCION DE LA MUESTRA
Las tinciones son combinaciones de colorantes ácidos y
básicos que permiten obtener suficiente contraste de
color en los cortes histológicos comunes.
A continuación presentaremos una lista de las tinciones
más comunes:
Hematoxilina y Eosina: La hematoxilina al ser básica tiñe
ácidos de color morado (núcleos con DNA y RNA),
mientras que la eosina es un ácido y tiñe bases de color
rosado (citoplasma).
PAS (Ácido Peryódico de Schiff): Tiñe carbohidratos
(mucopolisacáridos) de color rojo, por ejemplo las células
caliciformes en el intestino.
Tricrómico de Masson: Tiñe de color azul la colágena, de
rojo la queratina, y de morado los núcleos (muy utilizada
para los cortes de piel).
Nissl: Tiñe de color morado el retículo endoplásmico
rugoso y los corpúsculos de Nissl en las neuronas.

14. EJEMPLOS DE COLORACIONES
Coloración Hematoxilina-
Eosina
Resultados:
Núcleos y material basófilo
en tonos de morado.
Citoplasma en tonos de
rosado
Glándula salival Sublingual,
objetivo 40X
Tricrómico de Van
Gieson.
Resultados:
Células:
- Núcleos: negro - azul
- Citoplasma: amarillo
Colágeno: rojo intenso
Piel humana, objetivo
40X
Impregnación Argéntica
Resultados:
Célula (neurona):
-Soma y prolongaciones
(dendritas, axón) de
color pardo oscuro
Corteza cerebral de rata,
objetivo 40X

15. Ácido Periódico de Schiff (PAS)
Hematoxilina
Resultados:
- Núcleos: azul
-Células caliciformes y Chapa estriada en
fucsia
Intestino delgado, objetivo 40X
Corte de piel con tricrómico de Masson

16. MONTAJE Y OBSERVACION EN EL MICROSCOPIO
Para observar adecuadamente los cortes teñidos con
el microscopio óptico, se ha de proceder a cubrir las
preparaciones mediante un cubreobjetos.
Para ello se requiere la utilización de una sustancia
cementante o medio de montaje.
Si durante la técnica de tinción se han empleado
colorantes hidrosolubles, deben utilizarse medios de
montaje no-acuosos, es decir hidrofóbicos.
Si por el contrario, los colorantes utilizados son no-
iónicos, es preceptivo utilizar un medio de montaje
hidrosoluble. Antes de su aplicación, los cortes deben
hidratarse convenientemente.